Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESA T6CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

Một phương pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bởi tế bào T khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn lao đ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO 3

1.4 VI KHUẨN LAO 6

1.4.1 Đặc điểm phân loại 6

1.4.2 Đặc điểm hình thái 7

1.4.3 Cấu trúc thành tế bào 8

1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy 10

1.4.4.1 Môi trường và dạng khuẩn lạc 10

1.4.4.2 Chu kì tế bào 11

1.4.5 Khả năng gây bệnh 11

1.4.6 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 12

1.4.6.1 Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis 12

1.4.6.2 Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1 12

1.5 PROTEIN ESAT6/CFP10 14

1.5.1 Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10 14

1.5.2 Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 21

2.4 PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU 22

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 22

2.4.2.1 Tách chiết ADN 22

2.4.2.2 PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 22

2.4.2.3 Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 23 2.4.2.4 Giải trình tự ADN 24 2.4.2.5 Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6 27 2.4.2.6 Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6 28 2.4.2.7 Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 30 2.4.2.8 Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 33 3.1.1 Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33 3.1.1.1 Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của M.tuberculosis 33 3.1.1.2 Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33 3.1.2 Kết quả tách dòng 35 3.1.2.1 Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của M.tuberculosis 35 3.1.2.2 Kết quả tách dòng 35 3.1.2.3 Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10 37 3.1.2.3.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+ 37 3.1.2.3.2 Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+ 40 3.1.2.3.3 Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR-colonies 40 3.2 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10 41

3.2.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng

BL21(DE3) 41

3.2.2 Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6 43

3.2.3 Tối ưu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6 44

3.2.3.1 Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng 44

3.2.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen CFP10/ESAT6 46

3.2.4 Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 47

3.2.5 Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm 48

3.2.6 Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu 49

3.2.7 Xác định hoạt tính kháng nguyên 49

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính 18

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính 19

Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu 20

Bảng 3.1 Mức độ tương đồng của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 từ các chủng vi khuẩn lao Việt Nam so sánh với chủng chuẩn H37Rv 34

Bảng 3.2 Mức độ biểu hiện CFP10/ESAT6 tại các điều kiện khác nhau 47

Bảng 3.3 Nồng độ độc tố trong sản phẩm 48

Bảng 3.4 Đáp ứng với các nồng độ kháng nguyên khác nhau 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn lao M tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57] 7

Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57] 8

Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72] 8

Hình 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen 10

Hình 1.5 Vùng gen RD [31] 13

Hình 1.6 Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49] 14

Hình 3.1 Kết quả khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại gene mã hóa protein CFP10 và ESAT6 35

Hình 3.3 Khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid 36

Hình 3.4 Sản phẩm PCR được khuếch đại trên các plasmid tái tổ hợp, sử dụng cặp mồi P1, P4 37

Hình 3.5 Kết quả mở vòng pET21a+ và pGEMT/ESAT6/CFP10 39

Hình 3.6 Trình tự khung đọc mở mã hóa protein CFP10/ESAT6 41

Hình 3.7 Kết quả kiểm tra khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10-ESAT6 42

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra protein đích trên gel SDS 44

Hình 3.9 Kết quả cảm ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 45

Hình 3.10 Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp 48

Hình 3.11: Westerm blot trên 49

Hình 3.12: Westerm blot 49

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(Cặp bazo) CFP10 Culture Filtetrate Protein 10

CTCLQG Chương trình chống lao Quốc gia

ESAT6 Early Secretory Antigenic Target 6

INF γ Interferon gamma

IS Insert sequence

(Trình tự chèn)

(Chủng lao đa kháng thuốc) ORF Open reading frame

(Khung đọc mở)

(Phản ứng chuỗi polymerase) RD1 Region deletion 1

RFLP Restriction fragment length polymorphisms

(Đa hình độ dài đoạn cắt bởi enzym giới hạn)

TST Tuberculin Skin Test

(Phản ứng quá mẫn muộn với tuberculin) WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế Giới) XDR Extensively drug resistant

(Chủng lao kháng thuốc tuyệt đối)

Trước diễn biến nghiêm trọng đó, WHO đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh lao Bệnh lao ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy việc phát hiện và điều trị sớm càng trở nên cần thiết Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh và chính xác Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn

Trong nhiều thập kỉ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) vẫn được sử dụng để chẩn đoán nhiễm lao Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra TST

có độ đặc hiệu thấp đặc biệt trên các đối tượng có chủng ngừa BCG Một phương pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bởi tế bào T khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn lao đã được chứng minh có độ đặc hiệu cao hơn TST Hai kháng nguyên 10 Kdal Culture Filtetrate Proteinn (CFP10) và 6 Kdal Early Secretory

Antigenic Target (ESAT6) được mã hóa bởi gen Ihp nằm trên vùng đặc hiệu RD1

của vi khuẩn lao Vùng RD1 có chiều dài 9,5 kb và có chứa 9 khung đọc mở

(ORFs) [36, 55] Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng

minh RD1 chỉ quan sát được trên các chủng Mycobacterium tuberculosis, không có mặt trên các chủng BCG và các chủng Mycobacteria trong môi trường [42,49] Do

vậy việc nghiên cứu, ứng dụng gen mã hóa protein ESAT6 và CFP10 trong chẩn đoán lao và có thể phát triển 1 vacxin có hiệu quả bảo vệ cao được coi là một hướng

đi mới và đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới [29, 59, 65]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu quy trình

biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ cho việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao” Đề tài này thuộc một phần nghiên

cứu của nhiệm vụ Nghị định thư Hoa Kỳ:״ Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình

chế tạo bộ sinh phẩm ELISPOT chẩn đoán nhiễm lao ở quy mô phòng thí nghiệm״

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO

Bệnh lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện lâu đời, đã được hiện diện trong con người từ thời cổ đại Các nghiên cứu dấu tích hoá thạch đã cho thấy bệnh lao xuất hiện trên quần thể người khoảng 400- 230 năm trước Công nguyên Các dấu hiệu của bệnh cũng đã được tìm thấy trong xác ướp Ai Cập giữa năm 3000 và 2400 trước Công Nguyên

Bệnh ho lao (còn được gọi là consumption) là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp Khoảng 400 năm trước Công nguyên, Hippocrate đã xác định bệnh ho lao là căn nguyên phổ biến nhất liên quan đến ho ra máu và sốt, hầu như luôn gây tử vong Đại dịch lao bùng phát ở châu Âu (mà sau này được gọi là “Great White Plague”) bắt đầu vào thế kỷ XVII lan sang châu Mỹ và kéo dài cho đến tận thế kỷ XIX

Tác nhân gây bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis, chính thức được xác

định và mô tả vào năm 1882 Đây là công trình nghiên cứu của Robert Koch 1910) [3, 72] Để ghi nhận công lao của ông, ngày nay người ta còn gọi trực khuẩn lao gây bệnh trên người là trực khuẩn Koch (Bacille de Koch) [57]

(1843-Việc áp dụng các thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh đã cứu chữa cho hàng triệu bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này Tuy nhiên điều đó cũng đã tạo ra một

áp lực chọn lọc cho sự hình thành và phát triển các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

Hy vọng rằng bệnh này có thể được loại bỏ đã hoàn toàn bị dập tắt kể từ khi xuất hiện các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc vào những năm 1980 [69]

Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của đại dịch HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã bước sang một hướng phát triển mới gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống lao của loài người, đó là sự tương tác giữa lao và đại dịch HIV/AIDS và sự phát triển của các chủng lao kháng thuốc [57, 61]

1.2 TÌNH HÌNH BỆNH LAO TRÊN THẾ GIỚI

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay Trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia, một khu vực, một dân tộc nào

không có người mắc bệnh lao và chết do lao Năm 1993, WHO đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [6]

Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dânk.bb số thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M.tuberculosis và 10% trong số đó sẽ ph át triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao thuộc về các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động, do đó bệnh lao

là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [70]

Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% trên toàn thế giới Số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á Trong năm 2010,

có khoảng 10 triệu trẻ em mồ côi do cha mẹ tử vong vì lao, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [70] Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO mỗi năm có thêm khoảng 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) Ngày nay bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao đa kháng thuốc (MDR), lao kháng thuốc tuyệt đối (XDR) và lao đồng nhiễm HIV/AIDS [61, 69]

Đến cuối thế kỷ 20, con người vẫn lạc quan về khả năng có thể kiểm soát được đại dịch này Thực tế, cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển người ta đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học Tuy nhiên, thực tế lại không như vậy bởi sự xuất hiện cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn lao, khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém [61] Theo số liệu công bố của WHO [70], ước tính trong năm 2010 có thêm khoảng 8,8 triệu người mắc lao mới (trung bình 128 trường hợp trên 100 000 dân) và 1,4

triệu người chết do lao (trong đó 1,1 triệu người HIV (-) và 0,35 triệu người tử vong

do lao/HIV (+)) Sau HIV/AIDS, vi khuẩn lao là căn nguyên thường gặp nhất gây tử vong do các bệnh truyền nhiễm; và khuynh hướng hiện tại cho thấy, vi khuẩn lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân gây gánh nặng bệnh tật toàn cầu đến năm 2020 [70]

Tổ chức Y tế thế giới WHO đang phấn đấu đến năm 2015 sẽ giảm 1 nửa số người nhiễm và tử vong do lao [67,68] Ngày Thế giới phòng chống lao (24/3) được

tổ chức hàng năm nhằm nâng cao nhận thức về dịch bệnh lao toàn cầu và nỗ lực loại trừ bệnh lao

Bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét [6, 52] Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp phát hiện (chẩn đoán) và điều trị bệnh lao

1.3 TÌNH HÌNH BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM

Việt Nam hiện vẫn là nước có gánh nặng bệnh lao cao, đứng thứ 12 trong 22 nước có tình hình dịch tễ lao cao nhất trên toàn cầu, đồng thời đứng thứ 14 trong số

27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc cao nhất thế giới [68]

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình Y tế Quốc gia trọng điểm [6]

Năm 1996, Việt Nam đã đạt mục tiêu toàn cầu về tìm và điều trị bệnh lao, nhưng số ca bệnh báo cáo không thuyên giảm

Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ

lệ khỏi là 92% [6, 15]

Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới [6]

Năm 2010, Việt Nam có 88.000 ca mắc lao mới được phát hiện, trên 8.000 bệnh nhân lao cũ cần tái điều trị và gần 30.000 người chết vì bệnh lao Tổng số bệnh nhân lao hiện mắc là 300.000 người [5] Năm 2012, tổng số người mắc lao là 161.000, trong đó số người mắc lao mới khoảng 149.000, số người mắc lao thứ phát

là 12.000 người Mỗi năm, Chương trình chống lao quốc gia phát hiện 100.000 bệnh nhân lao và chữa khỏi cho 92% [4]

Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề cấp bách Theo nghiên cứu của CTCLQG có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới có mang vi trùng lao kháng thuốc, trong đó có kháng SM 25,1%, tiếp theo là INH 20.0%, đây là hai loại thuốc phổ biến trong điều trị bệnh lao [73]

Vấn đề đồng nhiễm HIV và lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% nhưng trên thực tế có thể còn cao hơn, như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn [6] Việc chẩn đoán nhiễm lao, phát triển một vacxin có hiệu quả bảo vệ cao từ gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 được coi là một hướng đi mới ở nước ta

1.4 VI KHUẨN LAO

1.4.1 Đặc điểm phân loại

Tên khoa học: Mycobacterium tuberculosis [3, 7]

Các chủng vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium được chia làm 2 nhóm

 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:

M tuberculosis, M bovis, M africanum, M microti Trong đó M tuberculosis và

M bovis gây bệnh lao điển hình

 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:

M avium, M ortuitum, M govdovac, M kansasii Nhóm này không gây bệnh lao

[57, 60]

1.4.2 Đặc điểm hình thái

Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây (hình 1.1) Tuy nhiên tùy thuộc vào điều kiện và thời gian nuôi cấy mà có sự thay đổi về hình dạng, kích thước, từ cầu- trực khuẩn đến trực khuẩn dài [7, 20, 57] Vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do

có lớp sáp ở thành tế bào Mycobacterium tuberculosis được xếp vào nhóm vi

khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc không giữ được màu thuốc nhuộm [3, 7, 8] Nhuộm theo phương pháp Ziehl-Neelsen, trực khuẩn lao không bị cồn và axit làm mất màu của cacbonfuchsin, bắt màu đỏ [8, 20], (hình 1.2)

Hình 1.1 Vi khuẩn lao M tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57]

Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57]

1.4.3 Cấu trúc thành tế bào

Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng Cấu trúc của lớp này ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững đối với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [8]

Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, được chia thành 4 lớp

mannoside 8- Khung thành tế bào

Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các lyzozyme của tế

bào Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M

tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám Thành phần của capsule này có

protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên trong các đại thực bào Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với

màng của các Mycobacteria trong cùng một giống, bao gồm cả các Mycobacteria

không gây bệnh [7, 20]

Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các lipit phức tạp Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực bào và các tế bào miễn dịch [7] Gắn với peptidoglican là một poysaccharide phân nhánh và arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được este hóa với axit béo có khối

lượng phân tử cao là axit mycolic Các axit mycolic đặc hiệu của M tuberculosis là

alpha - keto và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL) Xuyên qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid như phosphatidyl- myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào, trong đó LAM có tính đặc hiệu loài Thành tế bào Mycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này tham gia vào cấu trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic [57]

Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất định Thành tế bào của Mycobacteria có cấu trúc phức tạp với các thành phần hóa học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan

ở thành tế bào của M tuberculosis là 70 đến 80% trong khi ở E coli là 20-30% [57]

Lớp trong cùng là màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các photpholipit Các photpholipit gồm 2 nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước

hướng ra phía ngoài vỏ [7, 20, 57] Màng sinh chất giữ vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu giữa tế bào chất và môi trường Ngoài ra các protein của màng giữ các chức năng khác nhau như protein nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường , protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và bộ máy di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo vách ngăn trong quá trình phân chia tế

bào [20]

1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy

1.4.4.1 Môi trường và dạng khuẩn lạc

Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC , ở nhiệt độ dưới 37oC và trên 42oC vi khuẩn lao hầu như không mọc [20, 57] Trực khuẩn lao sinh trưởng tốt nhất khi pO2 là 100 mmHg và pCO2 là 40 mmHg Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao nhất (pO2 là 120-130 mmHg khi đứng), rồi đến thân xương và đầu xương (pO2 là

100 mmHg) Gan lách, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì pO2 thấp

Vi khuẩn lao không sinh trưởng trong môi trường thông thường mà phải được nuôi trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat, glixerol, asparagin, xanh malachite

Môi trường thường dùng là môi trường Loewenstein đặc đã được cải tiến bởi Jensen hoặc môi trường lỏng Sauton Trong môi trường đặc, trực khuẩn lao mọc rất chậm, phải mất 4 đến 6 tuần mới mọc khuẩn lạc điển hình dạng R ( hình 1.4)

Hình 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen

Sau một thời gian nuôi cấy trực khuẩn M tuberculosis gây bệnh sẽ tạo thành các khuẩn lạc có bề mặt dính và xù xì Các Mycobacteria không gây bệnh và các

trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám [3, 8, 57]

Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát [19] Miễn dịch trong lao

là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của trực khuẩn lao, gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn và cuối cùng làm phá hủy trực khuẩn Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá mẫn muộn Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ ở trong các u hạt nên cơ thể không thanh toán được Đặc biệt là trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không thanh

toán được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được, đây là một vấn đề nan giải trong điều trị lao [19]

1.4.6 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao

1.4.6.1 Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hệ gen của chủng H37Rv được công bố năm 1998 có chiều dài 4.411.529 cặp base Trong đó có 3.918 gen và các gen này đều được dự đoán là có mã hóa cho protein, tỷ lệ G+C chiếm 65,61% không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn

bộ genome Genome của Mycobacteria tuberculosis có tới 90,8% trình tự mã hóa

protein và chỉ có 8 gen giả [ 26, 50, 57]

Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA

(operon rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ

có duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb Điều này góp phần lý

giải về tốc độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [26]

Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium

tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS), trong đó

đặc biệt là đoạn IS6110 Hệ gen của M tuberculosis H37Rv có 16 bản sao IS6110 và

6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn lao có chứa 4-20 bản sao

IS6110 Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis thiếu hệ thống MutS có tác dụng

sửa chữa các lỗi trong bắt cặp nucleotide Tuy nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất chính xác do sự có mặt của gần 45 gen liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA bao gồm

cả 3 bản sao của gen mutT mã hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ

các Guanin bị oxy hóa trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [62]

1.4.6.2 Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1

Các nghiên cứu so sánh hệ gen của chủng vắc xin BCG và các chủng

M.tuberculosis gây bệnh đã chỉ ra một số vùng gen quyết định độc tố của vi khuẩn

nhưng bị thiếu ở chủng vắc xin BCG và đa số các chủng mycobacterium trong môi trường [49] Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh những gen này đóng vai trò quan trọng trong quyết định độc tố của vi khuẩn, cũng như khởi động quá trình đáp

ứng miễn dịch bảo vệ của cơ thể vật chủ [55]

Theo báo cáo dựa trên việc so sánh hệ gen giữa chủng chuẩn H37Rv và chủng vắc xin BCG, có tới 129 khung đọc mở có mặt ở chủng gây bệnh nhưng không phát hiện ở chủng BCG Vùng gen khuyết thiếu trên chủng vắc xin BCG được biết đến là vùng gen biệt hóa RD [32] Nằm trên vùng RD, vùng gen biệt hóa RD1 bao gồm 9 khung đọc mở (Rv3871-Rv3879), có chiều dài 9454 bp (hình 1.5) là một trong những gen khuyết thiếu của chủng BCG được nghiên cứu nhiều nhất Những protein quan trọng được mã hóa bởi vùng gen này bao gồm ESAT6 (Early Secretory Antigenic Target 6); CFP10 ( Culture Filtetrate Protein 10) và CFP21 ( Culture Filtetrate protein 21) là những kháng nguyên được nhận biết bởi tế bào T [31] Sự vắng mặt của chúng trên chủng vắc xin BCG có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến hiệu quả bảo vệ của BCG Xóa vùng gen biệt hóa RD1 trên các chủng vi khuẩn lao gây bệnh làm giảm khả năng sinh trưởng của vi khuẩn cũng như làm giảm độc lực của vi khuẩn Hệ thống tiết RD1 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn lao liên quan đến độc lực của vi khuẩn và cơ chế miễn dịch bảo vệ của vật chủ [38, 42, 55] bao gồm sự hình thành các u hạt (granulomas); giảm chức năng của các tế bào gai, đại thực bào, tế bào T bằng cách ức chế quá trình tiết các cytokine kích hoạt hệ thống miễn dịch của vật chủ [56]

Hình 1.5 Vùng gen RD [31]

Trong khi các kháng nguyên được mã hóa bởi vùng RD1 được biết đến như là một trong những yếu tố quyết định độc tố vi khuẩn lao thì bức tranh toàn cảnh về mối quan hệ giữa các kháng nguyên này và cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn lao vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ Vai trò của kháng nguyên ESAT6 liên quan

đến quá trình xâm nhập của vi khuẩn lao vào hệ thống miễn dịch của vật chủ vẫn chưa rõ ràng Tuy nhiên nhiều nghiên cứu hiện tại đã chứng minh vai trò của vùng gen biệt hóa RD1 trong quá trình sản xuất kháng nguyên ESAT6 và CFP10 của vi khuẩn lao

1.5 PROTEIN ESAT6/CFP10

1.5.1 Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10

ESAT6 có trọng lượng phân tử 6kDa, được tinh sạch lần đầu tiên bởi L.Sorensen và cộng sự vào năm 1995 bao gồm 95 amino axit ESAT6 được tiết ngay trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm, liên quan đến cơ chế xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào vật chủ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các vùng nhận biết trên protein ESAT6 có vai trò kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên [46] CFP10 có trọng lượng phân tử 10kD bao gồm 100 amino axit Gen mã hóa protein CFP10 và ESAT6 là 2 gen Rv 3874 và Rv 3875 nằm trên vùng gen biệt hóa RD1 Hai gen này được phiên mã và biểu hiện thành một phức hệ protein CFP10/ESAT6 với tỷ lệ 1:1 [31, 36, 58] Đoạn gen mã hóa protein CFP10 và

ESAT6 phân lập từ các chủng M.tuberculosis trên bệnh nhân lao phổi dương tính

tại nhiều vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết và đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) Cấu trúc của phức hệ protein CFP10/ESAT6 được mô tả trong hình 1.6

Hình 1.6 Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49]

1.5.2 Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng

Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học Biểu hiện gene thành protein tái

tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vacxin cũng được quan tâm nghiên cứu Năm 2007 một nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Columbia, Hoa Kỳ đã nghiên cứu tạo vacxin tái tổ hợp ESAT6/CFP10 thử nghiệm trên mô hình động vật Theo đó vacxin tái tổ hợp ESAT6/CFP10 gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn BCG Hai kháng nguyên CFP10 và ESAT6 đã được chứng minh là các kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao Hiện nay, chức năng của protein CFP10 và ESAT6 của vi khuẩn lao vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên một số nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan giữa sự có mặt của hai kháng nguyên này và độc lực của vi khuẩn lao [40]

Kết quả một nghiên cứu trên mô hình động vật đã chứng minh kháng nguyên ESAT6 được nhận biết bởi tế bào T ở giai đoạn đầu của quá trình nhiễm lao, khởi động quá trình tiết INF gamma [59], 64] Nghiên cứu trên mô hình chuột gây nhiễm

M tuberculosis của Brandt và cs cho thấy ESAT6 có khả năng bảo vệ chống lại vi

khuẩn lao sống [46] Một nghiên cứu khác cũng chứng minh CFP10/ESAT6 có khả năng kích thích tế bào T của bò đã bị nhiễm M.bovis sản sinh INF-γ ở nồng độ cao [66] Những phát hiện này đã khiến nhiều nhà khoa học nghĩ đến khả năng ứng dụng hai kháng nguyên CFP10 và ESAT6 trong việc phát triển vacxin thay thế vacxin BCG [48]

Kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng tuberculin skin test có phản ứng

chéo với non-tuberculosis mycobacteria, nên TST không phân biệt được giữa nhiễm Mycobacterium tuberculosis và nhiễm non-tuberculosis mycobacteria

Cho đến nay, chủng M bovis BCG vẫn được coi là ứng cử viên duy nhất cho việc phát triển vacxin chống vi khuẩn lao Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ của BCG đã được chứng minh chỉ đạt từ 0-80%

Do vậy, phát triển một vacxin mới, có hiệu quả bảo vệ cao, thay thế BCG là rất cần thiết, góp phần khống chế được sự lây lan của bệnh lao trên toàn cầu

CFP10 và ESAT6 đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu nhằm phát triển phương pháp chẩn đoán nhiễm lao thay thế phản ứng mantoux Một phương pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của hai kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT6/CFP10 là Quantiferon TB gold test (Celletist Limitted, Carnegie Victoria Australia) và T SPOT-TB assay (Oxford Immunotec, Oxford UK) đã được đánh giá

là có độ đặc hiệu cao hơn TST trong chẩn đoán nhiễm lao Cả hai bộ sinh phẩm thương phẩm này đều được xây dựng dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của vi khuẩn lao thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bởi T cells khi được kích thích với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT6/CFP10 Độ nhạy

và độ đặc hiệu của hai bộ kít trên cao nhưng ESAT6/CFP10 được sử dụng trong hai

bộ KIT có mặt trên thị trường (Quantiferon TB gold test, T Spot TB) là các overlapping peptides dẫn đến giá thành đắt, khó có thể đưa vào sử dụng đại trà đặc biệt là ở những nước đang phát triển như Việt nam Hill và các cộng sự [39] đã chứng minh rằng protein tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có tính đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch tương tự như overlapping peptides trong chẩn đoán nhiễm lao

Nhiều nghiên cứu khác trên thế giới cũng đã chứng minh tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp CFP10/ESAT6 Do vậy, tạo protein tái tổ hợp ESAT6/CFP10 là mục tiêu của đề tài này

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

 Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α và BL21(DE3) được

sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein ESAT6/CFP10, vector biểu hiện pET21a+ do Khoa sinh hóa tế bào, Trường Đại học Ohio, Hoa kỳ cung cấp

2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính

1 Hóa chất dùng trong tách chiết ADN

2 Hóa chất dùng trong PCR và PCR gắn BigDye

Deoxyribonucleoside triphosphate mixture Promega

3 Hóa chất trong điện di và soi gel

Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính

Quick Plasmid Miniprep Kit QIAGEN

ABI avant 3100 DNA analyzer Invitrogen

Gel Extraction kit (Cat No 28704) QIAGEN)

Máy chụp ảnh Gel – Doc Dolphin

Tủ cấy an toàn sinh học Nuaire

Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen

Sản phẩm Nguồn

CFP10

P1 5’-CCG GAT CCA TGG CAG AGA TGA

AGA C-3’

352bp [71] P2

5’-GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GAA GCC CTA TTG CGA GGA CAG CGC CT-3’

ESAT6

P3

5’-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC AGC ATG AAC GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG-3’

338bp [71] P4

5’CCA AGC TTT GCG AAC ATC CCA GTG A-3’

Ghi chú: GGA TCC: vị trí nhận biết của enzym BamHI

2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.4 PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu labo với các kỹ thuật sinh học phân tử để thiết kế vector và biểu hiện protein tái tổ hợp ESAT6/CFP10 của vi khuẩn lao

2.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử

2.4.2.1 Tách chiết ADN

Giết tế bào vi khuẩn lao ở 800C/30 phút, cho 20 μl lysozym, ủ qua đêm/370C Sau

đó sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp DNA

Kỹ thuật này tiến hành trong buồng vô trùng và cần có chứng âm để kiểm soát kỹ thuật cũng như hóa chất Các bước tiến hành như sau:

-Cho 20 μl dung dịch proteinase K vào tube 1,5 ml vô trùng có chứa vi khuẩn lao -Thêm 200 μl dung dịch đệm ly giải (AL), trộn kỹ trong 15 giây sau đó ly tâm nhanh và ủ 560C trong 10 phút

-Sau khi ủ, ly tâm nhanh, cho thêm 200 μl ethanol vào trộn đều

-Cho toàn bộ hỗn dịch vào cột ly tâm QIAamp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Cho vào cột 500 μl dung dịch đệm rửa (AW1) đã có ethanol, ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút

-Thêm 60 μl nước cất vô trùng hoặc dung dịch (AE) vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Lúc này, ADN đã được tách chiết và sử dụng để làm PCR

2.4.2.2 PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10

Nguyên lý:

PCR là phản ứng chuỗi trùng hợp dựa vào đặc tính hoạt động của enzym DNA polymerase Sử dụng cặp mồi đặc hiệu có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Các ADN mới lại được sử dụng làm khuôn

Gen mã hóa protein CFP10 ở vi khuẩn lao được khuếch đại từ ADN genome

H37Rv với cặp mồi có trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI:

P1: 5’-CCG GAT CCA TGG CAG AGA TGA AGA C-3’ và

P2: 5’-GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GAA GCC CTA TTG CGA GGA CAG CGC CT-3’

Gen mã hóa protein ESAT6 vi khuẩn lao được khuếch đại với cặp mồi:

P3: 5’-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC AGC ATG AAC GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG-3’ và

P4 mang trình tự nhận biết của HindIII: 5’CCA AGC TTT GCG AAC ATC CCA

GTG A-3’

Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P1 và P4, hỗn hợp sản phẩm gen mã hóa cho protein CFP10 và ESAT6 được sử dụng làm ADN khuôn Sản phẩm PCR có kích thước 638bp

Trong phản ứng PCR luôn tiến hành đồng thời một positive control (chứng dương) với ADN vi khuẩn lao H37Rv và một negative control (chứng âm) là nước

Thành phần phản ứng bao gồm 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM mồi, 200 mM deoxyribonucleoside triphosphate mixture, 1,5 u Tag polymerase, 1μl ADN mẫu tương đương 50-150 ng ADN, bổ sung nước cất vô trùng vừa đủ 50 μl dung dịch phản ứng

Điều kiện PCR: Giai đoạn biến tính ban đầu 950C/5 phút; 30 chu kỳ (biến tính

950C/45 giây; lai ghép 610C/45 giây, tổng hợp 720C/45 giây); giai đoạn tổng hợp cuối cùng: 720C/5 phút

Hiệu quả của quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% nhuộm bằng ethidium bromide

2.4.2.3 Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10

• Vùng gen đặc hiệu quyết định mã hóa protein ESAT6-CFP10 được khuếch đại Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào plasmid pGEM-T (kit A1360-Promega)

• Sau đó plasmid chứa đoạn ADN cần chèn được biến nạp vào tế bào khả biến DH 5α Các bước biến nạp:

-Bổ sung 1μl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến(50-100μl)

-Để ổn định trong đá trong 15 phút

-Sốc nhiệt ở 420C trong 90 giây, để trong đá 15 phút

-Bổ sung 400 μl môi trường LB lỏng, nuôi lắc 220v/phút trong 1 giờ, 370C

-Cấy trải 100-150μl trên môi trường thạch LB có chứa ampicillin

-Để trong tủ ấm 370C qua đêm

Sau đó tách chiết plasmid pGEMT-ESAT6/CFP10 bằng kit tách chiết plasmid (Quick Plasmid Miniprep Kit _Invitrogen)

Các bước tách chiết plasmid

-Chuyển các tế bào vi khuẩn vào ống li tâm nhỏ Cho 250μl Buffer P1

-Thêm 250 μl Buffer P2 và đảo trộn 4-6 lần

-Thêm 350 μl Buffer N3 và đảo trộn 4-6 lần

-Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch nổi

-Ly tâm 13000v/p trong 30-60 giây Bỏ phần dịch bên dưới

-Thêm 0,5 ml Buffer PB và ly tâm 30-60 giây Loại bỏ phần dịch bên dưới

-Thêm 0,75 ml Buffer PE và ly tâm 30-60 giây Loại bỏ phần dịch dưới

Ly tâm 1 phút để loại bỏ phần đệm rửa còn lại

- Thêm 50μl Buffer EB ( 10 mM Tris.Cl, pH 8,5) Để 1 phút rồi ly tâm 1 phút Sau khi tách chiết, thu được vector pGEMT-ESAT6-CFP10

• Khẳng định kết quả quá trình tách dòng bằng cách kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với sản phẩm là plasmid vừa tách được, tạo sản phẩm PCR

có độ dài mong muốn khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu

dụng thêm dideoxynocleotid (ddNTP) là những dideoxynucleotid nhưng nhóm

3’-OH được thay thế bằng –H Vì vậy các dideoxynucleotid không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodieste nên nó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp

Mỗi một loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng một màu khác nhau

Các bước tiến hành theo sơ đồ sau:

Tinh sạch sản phẩm PCR

Chạy PCR gắn BigDye

Tinh sạch BigDye

Biến tính AND trong HiDi Formamid

Chạy máy giải trình tự tự động ABI3100 Avant

Phân tích trình tự gen

Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lao được tách dòng (sử dụng kit pGEMT), sau đó được giải trình tự để xác định chính xác toàn bộ đoạn gen mã hóa cho protein ESAT6/CFP10 không bị thay đổi Các khuẩn lạc mang vector pGEMT-ESAT6-CFP10, tách chiết bằng kit tách chiết plasmid và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự ADN

Bước 1: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit QIAGEN

Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

-Cho 5 lần thể tích đệm PB vào 1 lần thể tích của phản ứng PCR và mix

-Đặt cột QIAquick vào tube 2 ml

-Cho dung dịch mix trên vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30-60 giây Loại bỏ phần dịch qua cột

-Tiếp tục rửa cột bằng 750 μl đệm PE, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30-60 giây Loại bỏ phần dịch qua cột Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 30-60 giây

-Đặt cột QIAquick vào tube 1,5ml vô trùng

-Thu ADN bằng cách cho 50 μl đệm EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5), ly tâm tiếp

Bước 3: Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye (DyeEx 2.0 Spin kit của QIAGEN)

Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau:

-Nới lỏng nắp cột, trộn đều cột nhựa

-Bỏ phần nhựa bên dưới cột và để cột trong tube 2 ml đã cung cấp sẵn trong bộ kit,ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

-Cẩn thận chuyển sang một tube mới Cho dần phản ứng giải trình tự vào chính giữa cột, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

-Thu ADN trong tube sau khi ly tâm, làm khô ADN bằng máy hút chân không

Bước 4: Biến tính ADN trong HiDi Formanid và chạy Sequencing

-Sản phẩm tinh sạch sau khi đã làm khô, được thêm vào mỗi tube 20μl HiDi Sau đó biến tính ở 950C/5 phút, chuyển vào đá ngay lập tức trong 5 phút