❖ Hấp cách quãng 100oC phương pháp Tyndal Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm..... Phương pháp pha môi trường
Giới thiệu kính hiển vi quang học và quan sát vi sinh vật
GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ
QUAN SÁT VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC
I/ GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
1 KHÁI NIỆM KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
Kính hiển vi là dụng cụ quang học hỗ trợ mắt, gồm nhiều lăng kính có các độ phóng đại khác nhau, giúp mở rộng góc nhìn và quan sát các vật rất nhỏ mà mắt thường không thể thấy Nhờ vào cấu tạo này, kính hiển vi tăng khả năng phóng đại và làm rõ các chi tiết nhỏ, hỗ trợ hoạt động nghiên cứu và khám phá trong khoa học Việc sử dụng kính hiển vi là cần thiết để quan sát các sinh vật nhỏ, các mẫu vật trong phòng thí nghiệm hoặc các hiện tượng siêu nhỏ mà mắt thường không thể nhìn thấy rõ ràng.
Kính hiển vi gồm có 4 hệ thống:
Hệ thống giá đỡ gồm:
Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu bản
Hệ thống phóng đại gồm:
- Thị kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi mà người ta để mắt và để soi kính, có
Ống đôi và ống đơn là hai loại thiết bị quang học cùng bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn, được sử dụng để tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát Chúng thường xuyên được ứng dụng trong các thiết bị kính hiển vi và các dụng cụ khoa học để phóng đại hình ảnh chính xác Việc chọn dùng ống đôi hay ống đơn phù hợp sẽ tùy thuộc vào mục đích quan sát và yêu cầu về độ phóng đại của người dùng.
Vật kính là bộ phận của kính hiển vi quay về phía vật thể cần quan sát, giúp phóng đại hình ảnh một cách chi tiết Có ba mức độ phóng đại chính của vật kính là x10, x40 và x100, trong đó x100 thường sử dụng cho quan sát cấu trúc cực nhỏ như vi sinh vật Vật kính hoạt động như một thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, giống như kính lúp, nhằm tạo ra ảnh thật rõ nét để quan sát rõ các đặc điểm của mẫu vật.
Hệ thống chiếu sáng gồm:
- Nguồn sáng (gương hoặc đèn)
- Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua tụ quang
Tụ quang là thiết bị dùng để tập trung và hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát, giúp nâng cao chất lượng hình ảnh Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản, thuận tiện cho việc điều chỉnh ánh sáng Người dùng có thể di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng phù hợp, đảm bảo quan sát rõ nét trên kính hiển vi.
- Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống
- Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của tụ quang
- Núm điều chỉnh màn chắn
- Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu bản (trước, sau, trái, phải)
3 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
- Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ 1 giọt dầu soi để soi chìm trên phiến kính khi soi vật kính x100
- Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp
- Điều chỉnh tụ quang: đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100
- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính
- Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản)
- Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của vi trường
- Điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét
4 BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
- Sử dụng và bảo quản kính hiển vi một cách thận trọng
- Đặt kính ở nơi khô thoáng, vào cuối ngày làm việc đặt kính hiển vi vào hộp có gói hút ẩm silicagel để trách bị mốc
- Lau hệ thống giá đỡ hàng ngày bằng khăn lau sạch, lau vật kính dầu bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen hoặc cồn.
- Bảo dưỡng, mở kính lau hệ thống chiếu sáng phía trong
II/ QUAN SÁT VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC BẰNG KÍNH HIỂN VI
- Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học
- Xác định sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nước
2/ CHUẨN BỊ a/ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
- Kính hiển vi quang học
- Nước cất b/ NGUYÊN VẬT LIỆU
Ba mẫu nước: Nước thải sinh hoạt, nước giếng, nước ao hồ
Lấy một giọt nước từ các loại nước đã thu thập bằng que cấy hoặc ống hút để đặt lên trên lam Đậy lamelle bằng cách nghiêng 45 độ, sau đó hạ từ từ xuống để tránh tạo bọt khí trong kính Việc này giúp chuẩn bị mẫu sạch sẽ và chính xác cho quá trình quan sát dưới kính hiển vi, đảm bảo kết quả nghiên cứu được chính xác và hiệu quả.
- Quan sát ở vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất (4X, 10X) Chuyển sang vật kính có độ phóng đại lớn hơn (40X, 100X)
- Xác định các thành phần cấu tạo nên kính hiển vi quang học và chức năng của chúng
- Cách tiến hành quan sát vi sinh vật trong mẫu nước bằng kính hiển vi quang học
- So sánh mật độ vi sinh vật trong các loại mẫu nước: nước sông, nước mưa, nước uống tiệt trùng, nước thải,
- Vẽ phát họa hình ảnh vi sinh vật xem được trên kính hiển vi
CHUẨN BỊ DỤNG CỤ- PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
- Biết cách bao gói, làm nút bông, khử trùng dụng cụ bằng nồi hấp khử trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy
- Nắm vững yêu cầu, nguyên tắc, các bước thực hiện pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật
II THỰC HÀNH BAO GÓI DỤNG CỤ
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch, khô và không bị nứt mẻ
Bao bì cần phải kín và cẩn thận để đảm bảo vô trùng cho dụng cụ sau quá trình khử trùng Lớp giấy gói giúp duy trì tính vô trùng, dễ dàng thao tác lấy dụng cụ khi cần thiết Việc đóng gói đúng quy trình đảm bảo an toàn, vệ sinh và tránh nhiễm khuẩn trong quá trình sử dụng.
2 Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet,
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh a Cách làm nút bông
➢ Lấy một ít bông (gòn) không thấm nước cuộn lại
➢ Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm
➢ Nút có kích thước và độ chặt vừa phải
➢ Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong
➢ Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng lượng bông nhiều hơn
- Với các pipet: dùng một sợi dây thép nhỏ nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet b Cách bao gói dụng cụ
Sau khi làm nút bông, cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để tránh bị ướt trong quá trình khử trùng, từ đó đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Việc sử dụng giấy báo để bọc giúp giữ vệ sinh cho dụng cụ, hạn chế nguy cơ nhiễm khuẩn và duy trì độ vô trùng cần thiết trong quá trình xử lý.Sau khi làm nút bông, nên bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để đảm bảo quá trình khử trùng hiệu quả và giữ cho dụng cụ luôn sạch sẽ, vô trùng Việc này giúp tránh tình trạng ẩm ướt, hạn chế nguy cơ nhiễm khuẩn trong quá trình bảo quản và sử dụng.
➢ Cắt các mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói
➢ Quấn quanh phần đầu của nút bông
➢ Gập giấy sát vào nút bông
➢ Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
➢ Bao bằng giấy dầu hoặc giấy nhôm hoặc bao bằng giấy báo rồi cho vào nylon bóng có khả năng chịu nhiệt với dụng cụ hấp ướt
➢ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ Có thể dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng
Thực hành làm nút bông và bao gói các dụng cụ của mỗi nhóm?
1 Việc bao gói dụng cụ phải đảm bảo những nguyên tắc cơ bản nào?
2 Trình bày cách thức làm nút bông với tất cả các dụng cụ đã học?
3 Việc làm nút bông phải đạt những yêu cầu nào?
4 Trình bày cách thức bao gói các dụng cụ đã học?
5 Bao gói dụng cụ phải đạt yêu cầu nào?
III CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ
➢ Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm
➢ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật
➢ Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người
2 Các phương pháp khử trùng
Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt a Phương pháp nhiệt khô
❖ Khử trùng bằng tủ sấy
- Được thực hiện trong tủ sấy với các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt
➢ Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào tủ sấy
➢ Bật công tắc tủ hoạt động
➢ Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp (160oC trong 2h hoặc 180oC trong 30 phút)
Để đảm bảo an toàn và giữ gìn dụng cụ thủy tinh, cần tắt tủ sấy và để nguội đến khoảng 60°C trước khi mở tủ lấy dụng cụ ra Tránh mở tủ khi nhiệt độ còn cao, vì điều này dễ gây vỡ dụng cụ thủy tinh.
Các dụng cụ sau khi sấy, nếu giấy bao có màu hơi vàng, chứng tỏ đạt yêu cầu về chất lượng Ngược lại, nếu giấy bao có màu nâu, điều này cho thấy nhiệt độ khử trùng quá cao làm bông và biến đổi giấy thành gondron, một hợp chất sát trùng không phù hợp để nuôi cấy vi sinh vật (VSV) Việc kiểm tra màu sắc giấy bao sau khi sấy là bước quan trọng để đảm bảo dụng cụ đã được khử trùng đúng tiêu chuẩn và an toàn cho quá trình nuôi cấy.
❖ Khử trùng bằng cách đốt trên lửa nóng đỏ :
- Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra
Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại từ 3 đến 4 lần để đảm bảo nhiệt độ đều Đối với các dây ở đầu que cấy, cần nung cho thật đỏ hết chiều dài dây để tăng cường khả năng vô trùng và đảm bảo an toàn trong quá trình cấy vi sinh.
➢ Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống b Khử trùng bằng sức nóng ướt (nhiệt ướt)
Phương pháp này được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc
➢ Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ
➢ Đun sôi từ 10 phút đến 1h
❖ Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)
Phương pháp này được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độ cao
➢ Đun nóng môi trường lên 65 – 70oC trong 15 – 30 phút
➢ Phương pháp này chỉ có tác dụng ức chế VSV không có bào tử
❖ Hấp cách quãng 100oC (phương pháp Tyndal)
Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm
➢ Hấp môi trường ở 100oC từ 30 – 40 phút
➢ Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển
➢ Hấp môi trường lần thứ hai ở 100oC trong 30 – 40 phút tiêu diệt các bào tử vừa nẩy mầm
➢ Lặp lại quá trình này 3 – 4 lần
Kết quả: môi trường vừa được khử trùng vừa được đảm bảo không thay đổi chất lượng
❖ Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (Autoclave)
Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vô trùng áp suất cao, được làm bằng kim loại chịu nhiệt cao, đảm bảo khả năng chịu nhiệt và độ bền vượt trội Thiết bị có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ và thời gian hấp nhằm đảm bảo quá trình tiệt trùng diễn ra hiệu quả, an toàn và đạt tiêu chuẩn vệ sinh cao nhất.
- Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường cần khử trùng
- Cho 3l nước cất vào nồi hấp rồi kiểm tra mức nước cho phù hợp
- Lần lượt đưa các dụng cụ, môi trường cần hấp vào bên trong nồi
- Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian và áp suất về vị trí mong muốn
- Bật công tắc khử trùng nồi hấp để tiến hành hấp
- Khi kết thúc quá trình hấp, nồi sẽ báo hiệu bằng còi
- Gạt công tắc khử trùng về vị trí “dry”
- Chờ kim chỉ áp suất trở về 0 mới mở nắp nồi lấy dụng cụ ra
- Ghi nhãn ngày - tháng – năm vào dụng cụ sau khi khử trùng
CHÚ Ý: Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc khử trùng, người thực hiện cần phải:
- Kiểm tra lại nồi hấp trước khi sử dụng
- Thực hiện đúng quy trình hướng dẫn
- Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ, nguyên liệu hoặc gây nổ nguy hiểm
- Trực tiếp theo dõi quá trình khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện
- Định kỳ kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế và van an toàn
Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong các kỹ thuật khử trùng Nhờ khả năng tiêu diệt cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật, phương pháp này đảm bảo vệ sinh an toàn tối đa Đây là lựa chọn hàng đầu trong các ứng dụng cần đảm bảo diệt khuẩn triệt để và nhanh chóng.
Ngòai ra có thể khử trùng bằng lọc hoặc bằng bức xạ c Khử trùng bằng sự lọc
Màng lọc thích hợp sử dụng cho môi trường lỏng, trong, có độ nhầy yếu và không chịu được nhiệt độ cao hơn 60°C Quá trình lọc diễn ra bằng cách cho môi trường đi qua một màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ hơn kích thước của vi khuẩn, giúp loại bỏ vi khuẩn và giữ lại trên màng lọc, trong khi dung dịch vô trùng sẽ đi qua Thông thường, màng lọc là màng cellulose, được sử dụng phổ biến để đảm bảo hiệu quả lọc sạch vi khuẩn Ngoài ra, phương pháp diệt trùng bằng bức xạ cũng được áp dụng để đảm bảo tính an toàn và vô trùng cho sản phẩm hoặc chất lỏng.
- Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng nhất là tia UV Tia UV chỉ khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên trong mẫu vật
Thực hành khử trùng các dụng cụ vừa bao gói?
1 Trình bày nguyên tắc chung của phương pháp khử trùng dụng cụ?
2 Trình bày các phương pháp khử trùng?
3 Trình bày các phương pháp khử trùng bằng nhiệt khô?
4 Trình bày các phương pháp khử trùng bằng nhiệt ướt?
B CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
- Khái niệm môi trường dinh dưỡng
- Yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng
- Cơ sở phân loại môi trường dinh dưỡng
- Nguyên tắc cơ bản của việc chế tạo môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất nội bào của tế bào Ngoài ra, môi trường này còn chứa các chất giúp duy trì trạng thái oxy hóa khử ổn định, điều chỉnh áp suất thẩm thấu và giữ cho môi trường luôn có độ pH phù hợp, đảm bảo sự sống và hoạt động hiệu quả của tế bào.
Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào để nuôi cấy vi sinh vật cũng cần đạt được các yêu cầu cơ bản sau đây:
➢ Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết
➢ Có độ pH thích hợp
➢ Có độ nhớt nhất định
➢ Không chứa các yếu tố độc hại
3 Cơ sở phân loại môi trường dinh dưỡng
Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường dinh dưỡng a Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc : gồm 3 loại