PCR (polymerase chain reaction

Giới thiệu PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp  Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, cĩ độ chính xác cao, khơng cần sự hiện diện của tế bào  Phản ứng PCR cho phép k

PCR (polymerase chain reaction)

 Chương II

Taq

polymerase

Các bước PCR

1 phản ứng PCR

Nguyên tắc

máy PCR

Làm thế nào

để phân lập được gen

I Giới thiệu

Kary Mullis 1985 Nobel 1993

Giới thiệu

 PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp

 Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, cĩ độ chính xác cao, khơng cần sự hiện diện của tế bào

 Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại một đoạn DNA nằm giữa 2 mồi chuyên biệt, nhờ men DNA polymerase

Nguyên tắc

• Dựa trên sự hoạt động của emzyme

• Sự hiện diện của mồi chuyên biệt

• Khả năng nối dài mồi của taq polymerase

• Các nu tự do trong môi trường

Máy PCR

Thực nghiệm

http://users.ugent.be/~avierstr/pdf/PCR.pdf

III THỰC NGHIỆM

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html

III THỰC NGHIỆM

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html

Mồi (primers)

= oligonucleotide đơn mạch (18-24 b) bổ sung với 2 vùng trên trình tự DNA

Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với

mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều

phiên mã

Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã 5’3’ 3’5’

 Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khuôn

 Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên

DNA

 Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 tốt nhất là dưới 1000)

THIẾT KẾ MỒI

Cách thiết kế mồi:

với mạch mã

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Polymerase chịu nhiệt

Taq-polymerase : từ Thermus aquaticus

Nhiệt độ tối ưu : 72C

Có hoạt tính 5'->3' polymerase

Có hoạt tính terminal transferase : thêm 1

Adenosine ở đầu 3’ của mạch DNA mới

Không có khả năng sửa sai (2x10-5 , 0.25% sai sau 30 chu kỳ)

Sao chép ~ 2000b/min Không sao chép được trên 3kb Pfu-polymerase Nhiệt độ tối ưu : 72C : từ Pyrococcus furiosus

Có hoạt tính 5'->3' polymerase và 3’-> 5’

exonuclease

Tỷ lệ chép sai thấp (1.5x10-6)

Sao chép ~ 500b/min

 Có nhiều loại buffer sử dụng riêng

cho từng loại enzyme

 Một số buffer chứa chất hoạt

động bề mặt có thể ảnh hưởng

đến các phản ứng

 Nhiều loại buffer đã có sẵn ion

Mg2+

Nồng độ Mg2+ và dNTP

 Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất hiện thêm các sản

phẩm không đặc hiệu

 Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp

 Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA

polymerase, DNA mẫu và thành phần buffer

 gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM

 dNTPs là loại hóa chất kém bền

 Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác

Chất khác

GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide,

glycerol, and betaine trong thành

phần PCR

giảm nhiệt bắt mồi xuống

Một số vấn đề thường gặp

 Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp

 Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác

 Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ,

nhiệt độ biến tính

 Hạ nhiêt độ gắn mồi

 Primer, buffer

 Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp

hơn sản phẩm mong muốn

 Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt

mồi

 Tăng thời gian kéo dài thêm 30s

 Giảm nồng độ DNA polymerase

 Tối ưu hóa nồng độ Mg2+

 Tinh sạch DNA template

 Giảm nồng độ primer

 Thiết kế cặp primer mới

Một số vấn đề thường gặp

Real-time PCR

 Một máy luân nhiệt

huỳnh quang

tích kết quả

Quá trình nhân bản sao ADN trong một

phản ứng PCR

Thềm phát hiện

Trong pha Log : Q n = Q 0 (E) n

Qn = Số bản sao sau n chu kỳ

Q0 = Số bản sao khởi đầu

E = Hiệu suất PCR

n = số chu kỳ

PCR cổ điển : kết quả chỉ được

biết sau khi tất cả các vòng

phản ứng đã hoàn thành

thuật này, ADN ban đầu được định lượng một cách chính

xác.

Tín hiệu huỳnh quang được đo sau giai đoạn kéo dài của mỗi chu kỳ PCR

Ưu điểm : rẻ, đơn giản Nhược điểm : không đặc hiệu

Phương pháp tạo huỳnh quang dùng SYBRGreen

SYBRGreen phát huỳnh quang khi chèn giữa 2 mạch của ADN

Kích thích

490nm

Phát quang 530nm

Aùp dụng của PCR

Tạo dòng DNA

Tìm hiểu mức biểu hiện của gen

(Reverse Transcription PCR)

Chẩn đoán bệnh (của người, súc vật, cây cối)

Phát hiện đột biến

Kiểm tra chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm nước…)

Phát hiện khác biệt giữa các bộ gen (Đa dạng gen):

áp dụng trong nông nghiệp để chọn lọc cây, con

Dấu ấn gen (Tìm cha mẹ, thủ phạm vụ án, giải đáp những bí mật lịch

sử…)

TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN

MỘT PHẢN ỨNG PCR

1. Thiết kế mồi

3. Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau:

5. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt

của thang chuẩn

6. Phân tích kết quả

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Escherichia coli : 4 x 106Saccharomyces cerevisiae : 1,4 x 107Drosophila melanogaster : 1,6 x 108Caenorhabditis elegans : 108

Homo sapiens : 3,4 x 109Arabidopsis thaliana : 108Oryza sativa 4,3 x 108Phaseolus vulgaris (đậu) : 2 x 109Triticum vulgare (lúa mì) 7 x 109Tulipa 3,5 x 1010

Kích thước bộ gen của một vài sinh vật (pb)

Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Tulipa

Caenorhabditis elegans

có trình tự bổ sung với trình tự của các primer

 Trên thị trường hiện nay có rất nhiều mồi ngẫu nhiên được tổng hợp nhân tạo

Nguyên tắc

 Dùng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi là các sợi

oligonucleotide đơn gồm 10 mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên

 SV cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, sẽ khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR.

 SV khác nhau ít nhiều về kiểu gen _ đa dạng về sinh hoc, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kích thước khác nhau.

Ứng dụng

 Nghiên cứu đa dạng di truyền

 Phát hiện sự liên kết giữa gen với tính trạng

 Thiết lập bản đồ di truyền

 Phát hiện đột biến

Ưu điểm

 Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết

trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản

 Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao

Hạn chế

 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định

 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR

cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp

và độ tin cậy không cao

 Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và

có độ tin cậy không cao

Sản phẩm điện di RAPD

Hãy thiết kế mồi để khuyếch đại đoạn DNA sau, tính Tm của mồi?

ttcatgatccaagggtttctcgcgtcaacagtatgttctgagctttttgttgttgtcatatctacttattcatgtttggaatgaaatgtcaattgtctcatcttcctaaagtgtatacaagtttttgttctacaatagaactctacaacagctgaatataatgataaaaatagatattttcttggctctttttttcattttacttttcttgacttctcatatggaaccacctccagcaacaaacggacctgttattgcaggttactttgctaattggtaacattgcataacaaaggcaaaaggggagcttaactcaactaactagaatgtaataggggaatctacgatagaaaatacaatgttgttgatgtagctactcaagccaataagttgactcatattttatatgcatttgctaatgtccaaccggatggtcaagttgttcttggggtagtataaattattgcaagatatagaatataataataataattataaatataggacgcttatgcagatattgaaaagcattttccagcaagtaaaaaaataataataaacaaatataaaacctctccctaattcatacataatatgtagaccaagcagtcaaccgaaaagaagatggatggaatgatccaggcaagaacctttacggtaactttaagcagttctatttactcaagcaacaacaccgtcatctcaaagtgtcgcttagcattggcggatatacatggtccactcattttggcccggttgcgcgtgatcctcagaaacgcagattgtttgtagatagcagcatcaaacacctagccaacttgggtctggacgggctagatattgactgggagtaccccaaagatgatgaggaagcgttttattatgtgcatctgctctatgagttgcgactggcgcttgacagatatcaacaacagtgccaacaactgattcagtcgcgactattactcacagtagccgtgccttgtggccctgaccattatcgtaaattgagattgaccgaaatgcaaccttacgtggacctattttacctcatggcatacgactatgctggttcatgggattctttcgcagatcatcaagcggctgtttatggtggcagattgaatacagaacaagcagtacagcactatatcgcctgtggtatccctccatataagctagtcgtaggcatgcctttatatggtcgaggattctgcaatacggcggggccaggtcatcctttccaaggactgcctcgcggtacctgggaagagggtcaatttaattacaagacattgccaaaaccgggcgctgtagaataccacgactttaatcgactagcctcatggtcttatgaccctcaggctcgtgaatttatcacctatgatactacgagatacattaacgt 3’