Xác định loài sán dây trên chó lây truyền sang người bằng kỹ thuật PCR polymerase chain reaction

MỤC LỤC CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH SÁN DÂY BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN 4.1 TỔNG QUAN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TNTN

-

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KH & CN CẤP CƠ SỞ

XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN DÂY TRÊN CHÓ LÂY TRUYỀN SANG

NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

ThS NGUYỄN PHI BẰNG

AN GIANG, THÁNG 08 NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TNTN

-

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KH & CN CẤP CƠ SỞ

XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN DÂY TRÊN CHÓ LÂY TRUYỀN SANG

NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

THÀNH VIÊN THAM GIA

LÊ THỊ THÚY HẰNG

Đề tài nghiên cứu khoa học “XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN DÂY TRÊN CHÓ LÂY TRUYỀN SANG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)”, do tác giả Nguyễn Phi Bằng công tác tại khoa Nông Nghiệp và TNTN thực hiện Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng khoa học và Đào tạo Trường Đại Học An Giang thông qua ngày 16/08/2017

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2 Tỷ lệ nhiễm giun sán từ động vật sang người 24 Bảng 3 Tỷ lệ nhiễm sán dây trên chó theo các tỉnh tại các địa bàn khảo sát 25 Bảng 4 Tỷ lệ nhiễm sán dây trên chó theo lứa tuổi khảo sát 26 Bảng 5 Tỷ lệ nhiễm ghép sán dây trên chó theo lứa tuổi khảo sát 26 Bảng 6 Thành phần loài sán dây ký sinh ở chó theo lứa tuổi 28

Bảng 8 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ trong năm 30

TÓM TẮT

Nghiên cứu này nhằm xác định đặc điểm dịch tễ của loài sán dây ký sinh trên chó tại một số tỉnh khu vực Đồng Bằng Sông Cữu Long như: An Giang, Đồng Tháp, Kiên Giang và Sóc Trăng Xác định tỷ lệ nhiễm và định danh phân loại sán dây dựa trên hình thái được thực hiện bằng phương pháp Skrjabin Các mẫu sán dây có hình thái không nguyên vẹn được định danh và phân loại bằng phương pháp PCR và giải mã trình tự DNA Kết quả nghiên cứu cho thấy chó tại khu vực khảo sát có nhiễm sán dây với tỷ lệ 26,30% và tỷ lệ này có liên quan mật thiết đến lứa tuổi, giống và mùa vụ nuôi chó

Dipylidium caninum là loài sán dây chủ yếu gây tác hại trên chó tại khu vực này với tỷ

lệ 25,74% Phương pháp khuyếch đại cặp mồi DC28S của gen 28S rRNA kết hợp với giải trình tự kiểm tra và định danh vùng 28S rRNA của sán dây cho thấy tỷ lệ mẫu sán dây khuyếch đại được cặp mồi DC28S của gen này là 91% Có 621 trình tự nucleotide được giải mã thu được 581 nucleotide có độ điện di tốt, kết quả Blast có hơn 100 đoạn DNA có trình tự gần giống với DNA mẫu Kết quả so sánh trình tự nucleotide được xác

định là trình tự của DNA của D.caninum với độ tương đồng 96% Xác định tỷ lệ nhiễm DNA của sán dây D.caninum trên ký chủ trung gian bằng phương pháp PCR và giải

trình tự là 10%, trình tự của DNA giải mã phù hợp với trình tự DNA của sán dây

D.caninum công bố của Mỹ tại Ngân hàng gen thế giới với số đăng ký AF023120.1

Từ khoá: chó, sán dây, PCR, trình tự gene, đặc điểm dịch tễ, 28S rARN

ABSTRACT

This study aimed to determine the epidemiological characteristics of tapeworms in dogs

at An Giang, Dong Thap, Kien Giang and Soc Trang in Mekong Delta of Viet Nam Postmortem method of Skrjabin was used to determine the intection rate and morphological identification (phenotype) of intact samples The non-intact ones were identified by sequencing technique The results showed that dogs in the survey area had tapeworm infection rate of 26% and the rate was closely related to age, breeding

and season of dogs Dipylidium caninum is the dominant tapeworm infected in dogs

(25,74%) The result was supported by PCR technique Using amplification DC28S primer of 28S rRNA gene associated sequencing of 28S rRNA area of tapeworm showed that the prevalence of tapeworm amplification by the DC28S primer was 91%

Comparative results of nucleotide sequences were identified as D caninum DNA sequences with 96% homology Determination of D caninum DNA on host mediated

by PCR and nucleotide sequencing The infection rate is 10% The sequence of the

DNA sample matches with the DNA sequence of D caninum tapeworms published by

the United States at the World Genealogical Center with registration number AF023120.1

Keyword: dogs, tapeworms, D caninum PCR, sequences gene

MỤC LỤC CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH SÁN DÂY BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN

4.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI CHÓ T I CÁC ĐI M ĐI U TRA VÀ

CÁC ĐỊA BÀN KHẢO

4.2.2 Tình hình nhiễm sán dây trên chó tại địa bàn khảo sát theo lứa tuổi 26

4.2.3 Kết quả khảo sát thành phần loài sán dây ký sinh theo lứa tuổi 28

4.2.4 Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó 29

4.2.5 Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ trong năm 30

4.3 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH SÁN DÂY TRÊN CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH

4.3.3 Kết quả Blast kiểm tra định danh trình tự nucleotide được giải mã trên ngân hàng

4.3.4 Kết quả so sánh với ngân hàng gen thế giới

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2 Vòng đời sán dây Diphyllobothrium mansoni 9

Hình 17 Sản phẩm PCR được chụp trên thạch Ararose 1% 34 Hình 18 Kết quả điện di Bazonito của mẫu khảo sát giám định 35 Hình 19 Kết quả Blast trình tự nucleotide trên NCBI 35 Hình 20 Danh sách các mã gen tương đồng với DNA mẫu phân tích đã đăng ký trên

Hình 21 So sánh sự sai khác trình tự nucleotide mẫu so với mã đã đăng ký của Mỹ 36

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

OD: Optical Density (mật độ quang học)

(1) NCBI thuộc NLM (National Library of Medicine - Thư viện Y khoa Quốc gia), đặt tại NIH (National Institutes of Health - Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA NHIỆM VỤ KH & CN

Chó mèo từ lâu được xem là thú cưng, là người bạn rất thân thiết và gần gũi của con người nên việc lây nhiễm bệnh từ động vật cưng này được được cảnh báo từ rất lâu, ký sinh trùng từ chó sang người là rất dễ dàng nếu như chó nuôi bị nhiễm sán dây, trong đó có thể bệnh ấu trùng có rất phức tạp và rất khó điều trị, đặc biệt là trẻ nhỏ (Huỳnh Hồng Quang, 2010)

Zoonosis hay zoonose là các bệnh truyền nhiễm có thể truyền từ các động vật (kể

cả vật nuôi và động vật hoang dại) sang người hoặc từ người sang động vật Động vật đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự nhiễm bệnh hoặc ổ chứa mầm bệnh tự nhiên (McCarthy & Moore, 2000) Hiện nay, việc kiểm soát vệ sinh thú y trong chăn nuôi chó và kiểm soát giết mổ vẫn chưa được nhiều địa phương quan tâm đúng mức nên nguy cơ lây lan bệnh sán dây và bệnh ấu trùng trên chó sẽ rất lớn Thêm vào đó, mỗi loài sán khác nhau sẽ có vòng đời và sự lây truyền khác nhau, cách ký chủ trung gian hoàn toàn khác nhau nên việc định danh để phân biệt chính xác loài sán dây ký sinh có ý nghĩa rất quan trọng nhằm giám sát loài sán dây đang lưu hành phổ biến gây tác hại chủ yếu cho chó và có nguy cơ lây được cho con người

và nhằm cắt đứt vòng đời của chúng ngăn chặn sự lây lan là một trong những khâu then chốt trong công tác phòng bệnh và kiểm soát bệnh này Định danh sán dây trên chó từ trước đến giờ chỉ bằng phương pháp định danh bằng hình thái học nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc giám định phân biệt các loài trong cùng giống có cấu tạo hình thái khá giống nhau, sán dây đang ở giai đoạn ấu trùng và đang

ký sinh trong cơ thể ký chủ trung gian, mẫu thu thập được không còn nguyên vẹn cấu tạo, những mẫu rời bị đứt khúc hay chỉ một phần nhỏ của sán dây Hơn nữa chưa có nghiên cứu nào đánh giá được mức độ biến đổi hình thái của cung một loài ở những vùng sinh thái, địa lý hay những vật chủ khác nhau

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định trực tiếp hệ gen của sán dây cho phép giám định chính xác loài sán đang lưu hành vì DNA là vật chất di truyền có tính ổn định rất cao, ít bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và bất kỳ giai đoạn này trong vòng đời của chúng, có thể nói phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử đã bổ sung được tất cả khiếm khuyết của phương pháp định danh hình thái truyền thống

TRÊN CHÓ LÂY TRUYỀN SANG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)”

1.2 MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ KH VÀ CN

- Xác định đặc điểm dịch tễ của bệnh sán dây trên chó

- Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc nhận diện loài sán dây gây tác hại chủ yếu trên

chó có khả năng lây truyền sang người

1.4 NỘI DUNG CHỦ YẾU CỦA NHIỆM VỤ KH & CN

- Xác định mức độ lưu hành của sán dây trên chó tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang

- Xác định loài sán dây gây bệnh trên chó tại các tỉnh bằng phương pháp mỗ khám ở các tỉnh khảo sát

- Một số đặc điểm dịch tễ của sán dây trên chó tại các tỉnh khảo sát

- Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán nhận diện bệnh sán dây gây tác hại chủ yếu trên chó

- Giải trình tự nucleotit của loài sán dây đã thực hiện phản ứng PCR

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NHIỆM VỤ KH & CN

- Làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu và giảng dạy

- Kết quả nghiên cứu sẽ được công bố trên các tạp chí chuyên ngành và các hội thảo khoa học để tăng cường kiến thức về khoa học thú y

- Kết quả của nhiệm vụ là cơ sở khoa học về loài sán có khả năng gây bệnh ở vùng khảo sát

- Ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán giám định loài sán dây gây bệnh

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

Agnieszka Tylkowska, Bogumila Pilarczyk, Aneta Gregorczyk, Ewelina Templin

(2010) tìm thấy trứng nhiễm Dipylidium caninum (4,07%), Taenia sp (3,45%),

Uncinaria stenocephala (11%), Toxocara canis (20.62%), Toxascaris leonina

(2.91%), Ancylostoma sp.(4.61%) trong phân chó ở phía tây Pomerania, Ba Lan, mẫu

phân được phân tích bằng phương pháp lắng cặn Nghiên cứu cho rằng trứng giun sán trên chó có khả năng đề kháng rất tốt với các điều kiện bất lợi từ môi trường, nên biện pháp tốt nhất để ngăn chặn sự bài thải trứng giun sán trên chó ra môi trường ngoài là phải kiểm soát quản lý tốt đàn chó không cho chó phóng uế tự do ngoài môi

trường, tạo ra những nguy cơ truyền lây bệnh giun sán từ chó sang người

Alimohammad Bahrami et al (2011) Nghiên cứu này khảo sát mức độ giun sán trên

chó mèo trong thời gian 10 năm ở tỉnh Ilam, Iran và so sánh sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm giữa các yếu tố như: nuôi nhốt và thả rong, cách chăm sóc nuôi dưỡng, độ tuổi khác nhau Nghiên cứu cho thấy, mẫu phân lấy từ những con chó ở các độ tuổi khác nhau và giới tính có tỷ lệ nhiễm bệnh khác nhau có ý nghĩa thống kê và tỷ lệ nhiễm

sán dây ở chó khá cao với Taenia hydatigena (19,64%), Echinicoccus spp (6,25%),

Dipylidium caninum (10,71%)

Tadiwos Abere et al (2013) nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán trên chó ở thị trấn

Bahir Dar, Ethiopia xác định tỷ lệ và loài ký sinh trùng đường tiêu hóa (GI) giun sán

ở vật nuôi và con chó đi hoang là một nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người trong thị trấn Bahir Dar, tây bắc Ethiopia Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm

sán dây trên chó Dipylidium caninum (29,75%), Taeniidae (23,87%),

Diphyllobothrium latum (10,25%), tác giả cho rằng, chó hoang có nhiều khả năng

phóng thích trứng và ấu trùng ra ngoài môi trường phương thức cho ăn ở nhóm có kiểm soát có tỷ lệ nhiễm sán ít hơn nhóm không có kiểm soát Nghiên cứu cũng kết luận rằng ký sinh trùng đường tiêu hóa khác nhau là nguyên nhân có tiềm năng lây nhiễm sang người Cần phải có kiểm soát chặt chẽ chó nuôi và phải biện pháp tuyên truyền cho những người nuôi chó ý thức được các bệnh lây truyền từ chó sang người

Beunet et al (2013) cho rằng các xét nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Dipylidium caninum trên bọ chét ký sinh

trên chó là phương pháp mới và đặc hiệu, nó phát hiện sự tồn tại của DNA của

Dipylidium caninum trên bọ chét một cách chính xác và nhanh chóng, tác giả nhận

thấy xác suất để chó ăn phải bọ chét có chứa ấu trùng của sán dây dipylidium

caninum là khá cao nếu bọ chét có nhiễm ấu trùng sán dây chó dipylidium caninum

Beugnet et al (2014), đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để phát hiện DNA của Dipylidium canium trên bọ chét, đây là phương pháp khá mới trong việc định

danh ký sinh trùng trên chó mèo, tác giả đã thu thập 2828 bọ chét từ 396 con chó, có

đến 9,1% số bọ chét ký sinh có chứa DNA của Dipylidium canium Tác giả cho rằng

bọ chét cắn, hút máu gây ngứa ngáy nên chó thường hay cắn vào chổ ngứa va vô tình nuốt phải bị chét làm gia tăng nguy cơ tái nhiễm bọ chét

Tại tỉnh Gansu (Trung Quốc), Wen et al (2013) đã xác định đặc điểm sinh học phân

tử của loài sán dây T multiceps thông qua hệ gen ty thể của gen Cytochrome C Oxidase Subunit 1 Tác giả đã giám định 16 mẫu Taenia multiceps ký sinh trên vật

chủ trung gian là cừu Đây là loài sán có thể gây bệnh cho tất cả các loài động vật có

vú kể cả người nhưng rất khó xác định về mặt hình thái ở giai đoạn ấu trùng Hơn

nữa đây là loài sán có kiểu hình rất giống loài D.caninum ở giai đoạn trưởng thành

gây khó khăn trong công tác kiểm soát và phòng bệnh sán dây trên người và động vật

Công trình nghiên cứu của Muhammad et al (2014) cho rằng giun sán trên chó là

nguyên nhân chính của các bệnh từ động vật sang trên toàn cầu Nghiên cứu phân tích mẫu phân và mẫu đất cùng với cây cỏ đã nhiễm phân chó trong thành phố Lahore, Pakistan Các mẫu phân được phân tích bằng phương pháp phù nổi và kỹ

thuật lắng cặn nghiên cứu cho thấy dương tính với Dipylidium caninum là 7,25%,

Echinococcus granulosus là 4,75 Nghiên cứu phản ánh tình trạng ô nhiễm trứng

giun sán của đất ở thành phố này Tác giả đề nghị kiểm tra thường xuyên của động vật nuôi và loại bỏ những con chó hoang (chó vô chủ) để phát hiện tình hình nhiễm giun sán của chó ở nơi này nhằm giảm thiểu nguy cơ các bệnh từ động vật sang

người

Các kết quả chính và tồn tại của những nghiên cứu ngoài nước

Qua lược khảo các công trình nghiên cứu sán dây ký sinh trên chó cho thấy các đa số các báo cáo khoa học đều thể hiện tỷ lệ nhiễm sán trên chó hay thú cưng thông qua giám định hình thái, có nghiên cứu ứng dụng Sinh học phân tử để giám định loài gây nhiễm bằng kỹ thuật PCR nhưng hầu hết các nghiên cứu ngoài nước có tỷ lệ nhiễm sán dây trên chó khá thấp Vài nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCR là công cụ giám định bệnh sán dây trên ký chủ trung gian để kiểm soát, theo dõi những có rất ít nghiên cứu xác định loài gây nhiễm chủ yếu gây tác hại trên khu vực khảo sát và giải trình tự gene của các loài sán dây ký sinh tại khu vực này Chưa có nhiều nghiên cứu kết hợp giữa khảo sát tình hình nhiễm và các đặc điểm dịch tễ của sán dây ký sinh trên chó cũng như kết hợp mô tả giám định sán dây bằng hình thái với giám định sán dây bằng phương pháp giải trình tự gen

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Trước năm 1975, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về sinh trên chó tạ

các nghiên cứu về xác định tỷ lệ lưu hành, thành phần loài sán dây ký sinh có thể kể đến như: et al., (1977), Đỗ

Dương Thái và Trịnh Văn Thịnh (1978), Phạm Sỹ Lăng và Đào Hữu Thanh (1990), Nguyễn Thị Kỳ (1994), et al., (1995), Ngô Huyền Thúy (1996), Ôn

Hòa Thịnh (1999), Lê Hữu Nghị và Nguyễn Văn Duệ (2000)

Các nghiên cứu gần đây có liên quan đến sán dây trên chó là nghiên cứu của Lê Hữu

Lan, Nguyễn Thị Quyên và Phạm Công Hoạt (2011), Nguyễn Quốc Vinh (2010), Nguyễn Thị Kim Lan và ctv (2015)

Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu sán dây từ động vật lây sang người

là nghiên cứu của Phạm Văn Đề (2005) đã bước đầu áp dụng sinh học phân tử trong định danh loài sán dây gây bệnh trên người; Nguyễn Thị Lan và Phạm Thanh An

(2010) trên sán dây Echinococus thu được từ cừu, chó và con người Thông qua giải

trình tự gen, nghiên cứu đã xác định được đặc tính sinh học phân tử và xác lập bản

đồ phả hệ cho loài sán này

et al., (1977)

Diphyllobothrium reptans, Mesocestodes lineatus

Đỗ Dương Thái và Trịnh Văn Thịnh (1978) đã tổng hợp tất cả các nghiên cứu trước đây về ký sinh trùng ở Việt Nam của nhiều tác giả và đã tổng kết được có 9 loài sán dây ký sinh trên chó có tại Việ

Dipylidium caninum, Diphyllobothrium mansoni, Taenia hydatigena, Taenia pisiformis, Tetrathiridium baillieti, Echinococcus granulosus và Cysticercus cellulosae, các tác giả đã bổ sung thêm được loài mới là Taenia multiceps Echinococcus polymorphus (ấu trùng)

Phạm Sỹ Lăng và Đào Hữu Thanh (1990) đã làm xét nghiệm 453 chó và mổ khám

17 chó tại khu vực Hà Nội trong 2 năm 1986-1987 Kết quả cho thấy có 50,56% chó

bị nhiễm sán dây, trong đó có 184 chó nhiễm Dipylidium caninum (40,61%)

Nguyễn Thị Kỳ (1994) đã tổng kết các tài liệu và mô tả các mẫu vật sán dây ký sinh

ở động vật nuôi, chim và thú hoang tại Việt Nam Tác giả đã liệt kê được 7 loài sán

dây ký sinh ở chó là: Dipylidium caninum, Diphyllobothrium mansoni, Taenia

hydatigena, Taenia pisiformis, T multiceps, Echinococcus granulosus và Mesocestoides lineatus

et al., (1995)

Taenia pisiformis

Ngô Huyền Thúy (1996) làm xét nghiệm 1.092 mẫu phân chó và mổ khám 516 chó tại Hà Nội Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giun sán rất cao (92,10%), trong đó có các

loài sán dây như Dipylidium caninum, Taenia hydatigena, Taenia pisiformis,

Diphyllobothrium mansoni Tác giả cũng đã thử nghiệm 4 loại thuốc, trong đó

Lopatol liều 50 mg/kg thể trọng tẩy sán dây đạt hiệu quả 76%, Niclosamide liều 100 mg/kg thể trọng đạt hiệu quả tẩy sán dây 77-81%

Nguyễn Thị Lê và ctv (1996) đã tổng hợp các tư liệu và mô tả những mẫu giun sán

có mặt tại Việt Nam Các tác giả đã thống kê được 7 loài sán dây ký sinh trên chó ở

Việt Nam Tác giả khẳng định chỉ có 1 loài sán dây thuộc Pseudophyllidea (bộ giả diệp) được tìm thấy ở Việt Nam là Diphyllobothrium mansoni

Ôn Hòa Thịnh (1999) tiến hành điều tra tình hình nhiễm giun sán ký sinh ở ống tiêu hóa chó tại thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang, qua kết quả xét nghiệm 244 mẫu phân chó đã phát hiện 1 loài thuộ Dipylidium caninum Ngoài ra,

tác giả thực hiện mổ khám 124 chó cho thấy tỷ lệ nhiễ

Dipylidium caninum (33,87%), Multiceps multiceps (17,74%), Mesocestoides lineatus Taenia hydatigena

Lê Hữu Nghị và Nguyễn Văn Duệ (2000) đã kiểm tra phân 132 chó ngoại, lai và chó nội thuộc các lứa tuổi tại thành phố Huế, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giun sán chung

là 55,38%, trong đó có 2 loài sán dây là Dipylidium caninum và Diphyllobothrium

mansoni, với tỷ lệ nhiễm tăng dần theo lứa tuổi

Lê Hữu Khương (2005) khảo sát giun sán ký sinh trên chó ở một số tỉnh miền nam Việt Nam có tỷ lệ nhiễm rất cao có đến 1563 chó bị nhiễm giun sán trong 1598 số chó khảo sát chiếm tỷ lệ 97,81%, riêng số chó nhiễm nhiễm lớp giun tròn lên đến 96,24% tổng số chó khảo sát Trong đó đáng chú ý nhất là tỉnh Đồng Nai, Phú Yên,

Thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ nhiễm sán dây Dipylidium caninum lần lượt là

63,00%, 51,51% và 36,50% Các loài giun sán nhiễm trên chó rất đa dạng và tỉ lệ nhiễm ghép 3-4 loài giun sán trên một cá thể lên đến 50,37% Nghiên cứu này cũng cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ nhiễm của địa bàn khảo sát, độ tuổi của chó và có sự khác biệt lớn về thành phần và cường độ nhiễm loài giun sán

gây bệnh cho người và gia súc Chúng thuộc hai bộ Cyclophyllidae và

Pseudophyllidae Căn cứ vào quá trình phát triển của chúng có liên quan đến thú y và

y tế, người ta đã nghiên cứu đặc điểm, hình thái và vòng đời phát triển của chúng

Trong đó, loài phổ biến ký sinh trên chó mèo và người là Dipylidium canium và

Diphyllobothrium latum, tác giả đã mô tả chi tiết về đặc điểm hình thái, vòng đời của

hai loài sán dây nói trên

Nghiên cứu của Nguyễn Quốc Vinh (2010) cho thấy tại thành phố Cầ

ới tỷ lệ nhiễ-

Dipylidium caninum, Spirometra mansoni, Taenia pisiformis Taenia hydatigena

Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Quyên và Phạm Công Hoạt (2011) đã mổ khám

646 chó ở ba huyện/thành của tỉnh Phú Thọ cho thấy tỷ lệ nhiễm sán dây Taenia

hydatigena là 35,14% Mổ khám 1273 trâu, bò, lợn ở các dịa phương trên phát hiện

29 con nhiễm ấu trùng của sán là Cysticercus tenuicollis (23,10%), cuờng dộ nhiễm

từ 1 - 56 ấu sán/con Tác giả xác dịnh, tương quan giữa tỷ lệ nhiễm sán dây Taenia

hydatigena ở chó và tỷ lệ nhiễm ấu sán Cysticercus tenuicollis ở trâu, bò, lợn là

tương quan thuận khá chặt chẽ với R = 0,881; 0,990 và 0,997 bằng phần mềm Statgraphics

Nguyễn Thị Kim Lan và ctv (2015) đã khảo sát chó tại tỉnh Thái Nguyên đã phát

hiện 5 loài ký sinh là sán dây ký sinh là Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758)

Spirometra erinacei-europaei (Rudolphi, 1819), Taenia hydatigena (Pallas,1766); Multiceps multiceps (Leske, 1780), Taenia pisiformis (Bloch, 1780) Tỷ lệ chó nhiễm

sán dây là 23,90%, biến động từ 17,65-27,82% Tác giả mô tả triệu chứng chủ yếu

của bệnh sán dây Taenia hydatigena do là xuất huyết tại vị trí đầu sán bám, viêm

ruột cata, có nhiều nốt loét nhỏ, niêm mạc ruột có phủ lớp nhầy màu nâu vàng

Những kết quả chính và các vấn đề tồn tại của các nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu trong nước hầu hết khảo sát tình hình nhiễm giun sán, sán dây trên chó tại các vùng khảo sát, công bố thành phần loài của vùng nhiễm sán dây Hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp nhận diện loài sán dây qua hình thái, rất ít nghiên cứu giám định sán dây bằng phương pháp PCR và giải trình tự gene Đa số nghiên cứu trong nước thường giới hạn vùng khảo sát ở phạm vi cấp tỉnh và chưa thấy nghiên cứu kết hợp giữa nhận diện sán dây bằng kiểu hình với giám định sán dây bằng phương pháp giải trình tự gen trên sán dây

Platyhelminthes (Schneider, 1973)

Cestoda (Rudolphi, 1808)

Eucestoda (Southwell, 1930) Cyclophyllidea (Braun, 1900) Taenidae (Ludwing, 1886) Taenia (Linnaeus, 1758) Taenia hydatigena (Pallas, 1766) Taenia pisiformis (Bloch, 1780) Dilepilidae (Fuhrmann, 1907)

Dipylidium (Leuckart, 1863) Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758) Pseudophyllidea (Carus, 1863)

Diphyllobothriidae (Luhe, 1910) Spirometra hay Diphyllobothrium (Mueller, 1937) Spirometra mansoni hay còn có tên gọi khác là Diphyllobothrium mansoni (Cobbold, 1882)

Diphyllobothrium reptans (Dies, 1850) Multiceps multiceps (Leske, 1790) Mesocestoides lineatus (Geoze, 1782) Echinococcus granulosus (Pascais, 1786)

Spirometra mansoni (Diphyllobothrium mansoni) Dipylidium caninum

DÂY KÝ SINH TRÊN CHÓ

2.4.1 Spirometra mansoni (Cobbold, 1882)

Đây là loài thuộc bộ Pseudophyllidea được tìm thấy, loài này còn có tên khác là

- Sán dây Spirometra mansoni

(Nguồn: http://www.bioon.com/Article/Class741/38948.shtml)

-Coracidia Cyclops stremus, Diaptomus racilis

phát triển thành ấu trùng đốt (Procercoid larvae

trùng, ấu trùng đốt sẽ phát triển thành ấu trùng đốt sán trưởng thành (Sparganum)

bê

Vòng đời sán dây Spirometra mansoni

(Nguồn: http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=936&ID=2253

Coracidia Cyclops stremus, Diaptomus racilis

phát triển thành ấu trùng đốt (Procercoid larvae

trùng, ấu trùng đốt sẽ phát triển thành ấu trùng đốt sán trưởng thành (Sparganum

D mansoni

guyễn Phước Tương, 2002)

2.4.2 Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758)

-Hình 3 Dipylidium caninum

1,2 Đầu; 3.Đốt lưỡng tính (Mathevosian, 1963)

Trứng sán dây Dipylidium canium (Mathevosian, 1963)

Ctenocephalus canis Ctenocephalus felis, Pulex irritans

dây (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2001)

Dipyllidium caninum Ctenocephalus canis

Hưng, 2009)

uốt phải kén Cysticercoid

2.4.3 Taenia hydatigena (Pallas, 1766)

Taenia hydatigena dài tới 5 m, rộng 7 mm, đầu có 26 - 44 móc, xếp thành 2 hàng

Móc lớn có kích thước 0,17 - 0,22 mm, móc nhỏ dài 0,11 - 0,16 mm, đường kính đầu

1 mm Đốt chửa dài 10 - 14 mm, rộng 4 - 7 mm Tử cung phân nhánh 5 - 10 đôi Buồng trứng phía lỗ sinh dục nhỏ hơn phía không có lỗ sinh dục Cổ dài 0,50 mm, đường kính giác bám 0,11 mm

Hình 6 Vòng đời các loài sán dây Taenia spp

(Nguồn: http://www.cdc.gov)

2.4.4 Taenia pisiformis (Bloch, 1780)

Đầu sán có 34 - 48 móc, xếp thành 2 hàng, móc lớn dài 0,225 - 0,294 mm, móc nhỏ dài 0,13 - 0,17 mm, đường kính đầu 1,30 mm Đốt chửa dài 8 - 10 mm, rộng 4 - 5

mm, núm sinh dục nhô ra Tử cung phân nhánh 8 - 14 đôi Buồng trứng có 2 thùy

Cổ dài 1,70 mm Đường kính giác bám 0,31 mm

Cysticercus pisiformis ( et al., 1977)

Hình 7 Trứng Taenia pisiformis (Bloch, 1780) 2.4.5 Taenia multiceps (Leske, 1780)

Hình 8 Multiceps multiceps (Leske, 1780)

1 Đầu; 2 Móc vòi; 3 Đốt lưỡng tính; 4 Đốt già (Abuladze, 1964)

Sán dài 40 - 100 cm, rộng tối đa 5 mm Đầu sán có 4 giác bám và có 22 - 32 móc xếp thành 2 hàng Móc lớn dài 0,15 - 0,17 mm, móc nhỏ dài 0,09 - 0,13 mm Đốt già có

9 - 26 nhánh tử cung

2.4.6 Diphyllobothrium latum (Janicki and Rosen, 1917)

Hình 9 Cấu tạo hình thái của sán Diphyllobothrium latum (Shuns và Guorde, 1970)

- Ký chủ: Mèo, sư tử, chó, lợn, người

- Nơi ký sinh: ruột

- Vật chủ bổ sung: cá

- Vật chủ trung gian: các loài giáp xác Cyclops stremus, Diaptomus racilis

- Cả thân dài từ 3 - 10m, khoảng 3000 đốt Có màu trắng ngà hoặc xám khói

- Đầu sán hình thuỗn, kích thước 2 – 3 mm x 0,7 mm, không có đĩa hút, mà có 2 rãnh hút Đốt trưởng thành có hình thang, chiều ngang lớn hơn chiều dài Lỗ sinh dục ở giữa đốt, lỗ tử cung gần lỗ sinh dục Đốt sán mang trứng: chiều ngang lớn hơn chiều dài (3 x 11mm), có 1 lỗ sinh dục ở chính giữa Tử cung là 1 ống uốn thành những vòng cuốn nằm ngay ở giữa đốt sán, chứa đầy trứng

- Vòng đời phát triển: Đây là 2 loại sán dây thuộc bộ giả diệp Pseudophillidea nên có

đặc điểm chung về vòng phát triển Sán trưởng thành bài xuất trứng qua phân ra ngoại cảnh ra ngoài Trứng sẽ hình thành Coracidium và chui ra khỏi trứng sau 21 ngày Trong môi trường nước, ấu trùng xâm nhập vào vật chủ trung gian là các loài

giáp xác Cyclops stremus, Diaptomus racilis, phát triển thành Procercoid Ấu trùng

phát triển trong thời gian 20 ngày có thể gây nhiễm được cho vật chủ bổ sung là các

loài ếch nhái, tạo thành các ấu trùng dạng Plerocercoid Chó, mèo ăn phải ếch nhái

có ấu trùng thì sau 13 ngày sẽ có sán trưởng thành trong ruột Theo Đỗ Dương Thái,

ở Việt Nam có tới 75% ếch nhái mang ấu trùng của D latum Ngoài ếch, nhái thì ấu

trùng còn ký sinh ở chuột và một số động vật khác (Nguyễn Hữu Hưng, 2010)

Hình 10 Vòng đời sán dải cá Diphyllobothrium latum

––

(Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2001)

2.5.3 Bệnh do sán dải cá Diphyllobothrium latum (D latum)

Trong quá trình phát triển, D latum đòi hỏi phải qua hai ký chủ trung gian sống dưới nước Một là loài giáp xác (cyclops hay Diaptomus), trứng sán theo phân ra môi trường, gặp nước nở thành ấu trùng lông (coracidium) được giáp xác nuốt và chuyển thành ấu trùng procercoid trong thân giáp xác Ký chủ trung gian thứ hai là loài cá (cá hồi, cá măng, )ăn phải giáp xác có mang ấu trùng proceroid Trong mô cá, procercoid chuyển thành ấu trùng plerocercoid (còn gọi là sparganum) có hình con sâu Nếu cá bị loài cá lớn hơn ăn thịt thì ấu trùng plerocercoid sẽ sang cá lớn và vẫn

ở trong trạng thái chờ dịp bị nuốt bởi ký chủ vĩnh viễn Chu trình sẽ được khép kín khi người hoặc chó, mèo, chồn,… ăn phải thịt cá sống có chứa ấu trùng plerocercoid Vào ruột non, ấu trùng plerocercoid sẽ bám vào thành ruột bằng hai rãnh hút, hấp thụ các chất dinh dưỡng qua thẩm thấu đặc biệt, sán hấp thụ vitamin B12 rất nhiều, phát triển thành sán trưởng thành trong thời gian 30 ngày Một người có thể chứa nhiều sán, có khi lên đến 70 - 80 con D.latum có thể ký sinh cùng các loài sán khác (sán dải heo, bò) trong cùng một người Sán trưởng thành sống được khoảng 20 năm (Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê, 2009), (Nguyễn Hữu Hưng, 2010)

Đa phần bệnh nhân nhiễm D latum thường không có triệu chứng khi nhiễm ít Khi

nhiễm nhiều bệnh sẽ có triệu chứng rõ ràng hơn như bị đau bụng, rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, liệt chi,…và có thể dẫn đến những biến chứng nặng như tắc ruột, ói mửa ra

nhiều thước sán làm nghẹt thở, đôi khi gây trụy tim mạch Bệnh do sán dải D latum

có đặc điểm là gây ra hội chứng thiếu máu do thiếu hụt vitamin B12, kiểu Biermer, hồng cầu to và non, tăng sắc

Phòng ngừa bằng cách không ăn cá sống hoặc cá chưa được nấu chín Nếu ăn sashimi hay sushi, đầu tiên cần đông lạnh cá tại -10 ° C (hoặc thấp hơn) trong hai ngày để diệt ấu trùng Không phóng uế trong nước (sông, hồ,….) (Trần Mỹ Duyên, 2015)

2.5.4 Bệnh do Taenia spp

Trứng sán được vật chủ trung gian (chuột, cừu, thỏ, bò, heo…) ăn vào, trứng sán

phát triển thành ấu trùng, ấu trùng Taenia hydatigena ký sinh trong bụng và tổ chức

gan, ấu trùng được ăn bởi động vật ăn thịt (chó, mèo) chúng phát triển thành sán trưởng thành ký sinh trong ruột sau 6-8 tuần và bài thải các đốt sán qua phân Sơ đồ cho thấy sự phát triển hoàn chỉnh từng giai đoạn trứng đến giai đoạn trưởng thành và

bài thải trứng để phát triển thành chu trình mới Trong sơ đồ Taenia sp cần có hai

loại vật chủ trung gian khác khác nhau đó là vật chủ trung gian và vật chủ chính, sơ

đồ trên cũng cho thấy người vừa là vật chủ chính vừa là vật chủ trung gian của

Taenia sp nhưng đối với Taenia hydatigena thì người chỉ là vật chủ chính, không có

bệnh ấu trùng do Taenia hydatigena trên người (Triệu Nguyên Trung và ctv, 2014)

2.6 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

- Tình hình nhiễm sán dây trên chó ở một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long?

- Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm sán dây trên chó ở địa bàn khảo sát?

- Loài sán nào là loài phổ biến nhất chủ yếu gây tác hại trên chó?

- Ứng dụng sinh học phần tử trong chẩn đoán giám định sán dây ký sinh ở chó?

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định mức độ lưu hành của sán dây trên chó tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang

- Xác định loài sán dây gây bệnh trên chó tại các tỉnh bằng phương pháp mỗ khám ở các tỉnh khảo sát

- Một số đặc điểm dịch tễ của sán dây trên chó tại các tỉnh khảo sát

- Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện sán dây gây bệnh chủ yếu trên chó

- Giải trình tự nucleotide của loài sán dây đã thực hiện phản ứng PCR

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Thời gian và địa điểm

- Z: Độ tin cậy của kết quả ước tính (Z=1.96 với mức độ tin cậy 95%)

- d: mức khác biệt tối đa giữa tỉ lệ bệnh quan sát được và tỉ lệ bệnh có thật, d=5%

Số mẫu cần khảo sát tối thiểu của nghiên cứu là: 100 x 4 = 400 cá thể chó

3.2.3 Mẫu PCR và giải trình tự nucleotide

- Mẫu được sử dụng thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự là những mẫu có kiểu hình không điển hình, khó định danh phân loại bằng hình thái học bao gồm trứng/đốt sán hay đoạn đứt khúc của sán, được thu thập từ chó còn sống bằng phương pháp đãi phân và gạn rữa sa lắng

- Thu mẫu từ vật chủ trung gian: Nghiên cứu thu thập mẫu ấu trùng sán dây trên ký

- Mẫu được cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh âm 20 0C

3.2.4 Thu thập và bảo quản mẫu

3.2.4.1 Cách tiến hành

Áp dụng phương pháp mổ khảo sát của viện sĩ Skrjabin (1963), theo các trình tự như sau:

Chó sau khi được giết chết sẽ được mổ khám ở

- Tách riêng các bộ phận như: thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già, gan, tụy, màng treo ruột

- Thực quản và dạ dày: quan sát bên ngoài thực quản và dạ dày, nếu có các khối u sẽ

mổ ra, thu nhặ ọ nước sạch để ết tự nhiên, sau đó mổ dọc thực quản và dạ dày, quan sát và gắp nhữ ạc

nước xả vào lòng ruột để dồn chất chứa vào xô, đồng thời dùng tay vuốt mạnh dọc theo chiều dọc của ruột để dồn các chất chứa vào trong xô Sau đó lộn ngược ruột, quan sát niêm mạc ruột để thu nhặt sán dây Gạn rữa, sa lắng chất chứa để tìm sán dây

- Ruột già: mổ dọc manh tràng và trự ạc ruột

- Gan và mật: cắt dọc túi mật và ống dẫn mật, sau đó cho toàn bộ gan và mật vào chậu nước, dùng tay bóp nhẹ gan đẩ ất chứa trong chậu,

Mỗi chó mổ khám được lập phiếu điều tra bao gồm nội dung như sau: tuổi, giới tính, trọng lượng, ngày lấy mẫu, tình trạng sức khỏe, số lượng sán dây thu nhặt được

3.2.4.2 Phương pháp bảo quản và định danh mẫu vật

Để thực hiện bảo quản đối với sán dây, ta cần phải lấy cho được đốt đầu, để chúng chết tự nhiên, rữa sạch bằng nước muối sinh lý, bảo quản trong cồn 700

Cách định danh phân loại: dùng kẹp trải sán dây đặt lên phiến kính, cẩn thận để không bị đứt phần đầu, nhỏ vài giọt Glycerin 50% và quan sát dưới kính hiển vi Việc định danh phân loại mẫu sán dây qua kiểu hình được thực hiện dựa vào một số đặc điểm về hình thái, cấu tạo của sán dựa theo mô tả của các tác giả: Phan Thế Việt

và ctv., (1977), Bowman et al., (2003) và Soulsby (1977)

3.2.4.3 Phương pháp làm tiêu bản vĩnh viễn

Mẫu sán dây được thu thập và bảo quản, kẹp, ống nghiệm, lọ chứa mẫu, cồn các nồng độ : 500, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 960, 99,90, nước cất, Carmin, Baume Canada, HCl đậm đặc, KOH tinh chất, N-butyl alcohol, Xylen, Acid alcohol, phiến kính, lá kính, thước kẹp, giấy lọc

Thuốc nhuộm Carmin:

Cách nhuộm

Quy trình nhuộm như sau:

- Làm trong mẫu bằng dung dịch KOH 0,1N (5 - 10 phút)

- Vớt ra và rữa với nước 2 lần cho sạch KOH

- Rút nước bằng cồn 500, 600, 700, mỗi công đoạn mất khoảng 15 - 30 phút

- Nhuộm với thuốc nhuộm carmin Tùy theo độ nhuộm màu của sán, khoảng 5 - 10 phút

- Rút nước bằng cồn qua các nồng độ 700, 800, 850, 900, 950, 960, 990; mỗi công đoạn khoảng 15 - 30 phút

- Làm khô mẫu nhanh bằng xylen (3 lọ, mỗi lọ 5 phút)

- Dán mẫu bằng Baume Canada

Nếu mẫu sán sau khi nhuộm bắt màu quá đậm, tẩy bớt màu của carmin bằng acid alcohol (1ml HCl + 1 ml cồn 700)

3.2.4.4 Chỉ tiêu theo dõi

- Ghi nhận hình thái các cơ quan, bộ phận bên trong sán dây hỗ trợ việc định danh phân biệt loài sán dây

- Xác định thành phần loài sán dây ký sinh ở chó theo tuổi

- Xác định giống chó dựa vào atlas giống chó Lê Văn thọ (2010)

- Mùa vụ trong nghiên cứu nghiên cứu được quy ước:

+ Mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10 âm lịch

+ Mùa nắng từ tháng 11 đến tháng 4 âm lịch năm sau

3.3 PHƯƠNG PHÁP PCR

Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng từ những năm đầu 1990

và thực sự là phương tiện có hiệu uqả trong nghiên cứu di truyền phân tử của các loài sinh vật Chỉ cần lượng nhỏ AND, PCR có thể nhân lên hàng triệu bản sao DNA vùng cần nghiên cứu Thông thường, nếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn giản, đoạn DNA thu nhận được có độ dài cao nhất đến 2000-3000 nucleotide PCR là phản ứng enzym, xúc tác bởi đoạn DNA polymeraza chịu nhiệt, sử dụng nhiều nhất là Taq polymeraza trong môi trương có nồng độ Mg++

thích hợp với các thành phần nucleotide đầy đủ làm nguyên liệu, có hai đoạn nucleotide ngắn làm mồi (gọi là primer)

Phản ứng sẽ tiến hành tổng hợp các đoạn DNA tương ứng trên khuôn DNA, trong giới hạn giữa các primer Sự tổng hợp DNA tăng theo cấp số 2n, sau 25-40 chu kỳ, sẽ cho ra số lượng hàng triệu bản sao Phương pháp PCR không đòi hỏi DNA với số lượng lớn nên có thể sử dụng trực tiếp DNA mẫu vật để làm khuôn, mà không cần phải nuôi cấy, do vậy loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường đối với đối tượng nghiên cứu Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phân tử phải được đảm bảo, tránh lẫn tạp nhiều loại DNA khác nhau

3.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH SÁN DÂY BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR) VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE

3.4.1 Thu và trữ mẫu ly trích DNA

- ẫu đã ủ qua đêm đượ

10000 vòng/phút trong 10 phút ở 250C Pha lỏng phần trên mẫu sau li tâm được chuyển sang tube mới sau đó thêm vào 700

2mM Ly tâm 10.000 vòng

3.4.3 Kiểm tra nồng độ DNA

Nồng độ DNA được xác định bằng máy UV-180 (Shimadzu corporation, Kyoto, Japan) Sản phẩm DNA được xác định nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm Nồng độ DNA được tính theo công thức sau:

và đạt nồng độ lớn hơn 50ng/µl cho các công đoạn tiếp theo

3.4.4 Thực hiện phản ứng PCR

Nghiên cứu sử dụng phương pháp truy cập ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để tìm kiếm các chuỗi nucletide hiện có của các loài sán dây ký sinh trên chó Cặp mồi (primer) dùng để nhân bản AND đích bằng phản ứng PCR được chọn trên các cơ sở các trình tự bảo tồn của gen này có trong Ngân hàng gen hoặc các tài liệu đã xuất bản

3.4.5 Điện di

- Phương pháp điện di trên gel aragose để kiểm tra sự khếch đại đoạn gen thành công

và đánh giá sơ bộ khích thước đoạn gen theo tính toán lý thuyết Kiểm tra băng rDNA trên gel với bước sóng 365nm

3.5 SỐ MẪU VÀ CÁC ĐOẠN MỒI TRONG THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE

3.5.1 Đối với sán dây chủ yếu gây tác hại trên chó

Nghiên cứu đã sử dụng 33 mẫu được nhận định là sán dây có kiểu hình không điển