PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

PCR Được phát minh bởi Kary Mullis Là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một gen hay một đoạn DNA. Ứng dụng : nghiên cứu sinh học và y học như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene và xác định huyết thống…

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

NGUYỄN HƯNG

• Phương pháp PCR (Polymerase Chain

Reaction) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Thực chất đây là một phương pháp

tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của

tế bào.

• Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học.

Enzyme dùng trong phản ứng PCR

Có nhiều enzym khác nhau được chọn tùy mục đích sử dụng:

Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus)

Stoffel DNA polymerase

Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis)

Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus)

Tth DNA polymerase

UITma DNA polymerase

Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR

Ống eppendorf “ thành mỏng” đầu típ có phin lọc

Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Chu kỳ 1

Chu kỳ 2

Chu kỳ ……30 chu kỳ (Thường 40 chu kỳ)

RT-PCR

Reverse transcriptase ( Enzyme phiên mã ngược)

Enzyme được sử dụng phổ biến nhất:

 AMV- RT ( Avian Myeloblastosis Virus) : là bền vững, chịu nhiệt tốt ( -> 55oC

MMLV –RT ( Moloney Murin Leukaemia Virus) : hoạt tính RNase H thấp hơn

Nested PCR/semi nested PCR

Sử dụng một cặp mồi “ ngoài” và 1 mồi/1 cặp mồi “ trong” để tăng tính đặc hiệu

và độ nhạy của phản ứng PCR

Multiplex PCR

Sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR để phát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA của một tác nhân hay nhiều tác nhân

Inverse PCR ( PCR “đảo”)

AP-PCR ( Arbitrary Primed PCR)/ RAPD ( Random Amplified polymorphic DNA)

Sử dụng tổ hợp các primer “ ngẫu nhiên” để xác định “ dấu ấn di truyền” của loài

3’/5’ RACE ( Rapid Amplification of cDNA Ends)

Nhân bản hai đầu mút 5’ và 3’ của một trình tự exon với một mồi đặc hiệu và một mồi “chung”

In situ PCR

Thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô / tế bào

In situ PCR

In situ RT - PCR

Recombinant PCR ( PCR tái tổ hợp)