Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Phát Hiện Nhanh Thực Phẩm Chứa GMO

Nghiên cứu, đánh giá cây biến đổi gen cho các loại nông sản quan trọng như lúa, bắp, đậu nành, bông vải, cải dầu và rau quả, cũng như chẩn đoán có hay không gen biến đổi genetically modi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE

CHAIN REACTION) PHÁT HIỆN NHANH THỰC

PHẨM CHỨA GMO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

LỚP: CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 04/2010

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

Trần Thị Xuân Mai Phan Hữu Thông

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Tôi xin chân thành cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Xuân Mai

đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ những tri thức khoa học bổ ích, tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi làm tốt luận văn tốt nghiệp này

Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên và cô Nguyễn Thị Pha phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Thực Vật - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin cảm ơn tất cả các Thầy, Cô của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu cho tôi trong 4 năm học ở trường

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn Hà Minh Luân, Trương Quỳnh Trang, Trần Thị Hoàng Yến, Lý Tiến, Nguyễn Thị Hoàng Nhung, Danh Xuyên, Nguyễn Thị Hồng Ngọc đã hết lòng giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong quá trình hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn tất cả các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K32 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Phan Hữu Thông Cần Thơ, ngày 08 tháng 05 năm 2010

Quá trình ly trích DNA ở nhiều loại thực phẩm còn gặp nhiều khó khăn do có chứa nhiều tạp chất như polysaccharid, protein, lipid… làm ảnh hưởng đến chất lượng

và số lượng DNA, điều này gây trở ngại lớn trongquá trình thực hiện phản ứng PCR

Vì vậy, qui trình phát hiện thực phẩm chứa GMO bằng kỹ thuật PCR cần phải khắc phục được các khó khăn trên Trong nghiên cứu của chúng tôi, một qui trình phát hiện thực phẩm chứa GMO đã được xác định

Có hai qui trình trích DNA đã được sử dụng tùy theo loại nguyên liệu Việc xử lý mẫu trước khi trích DNA tùy theo dạng nguyên liệu cũng đã thành công Cặp mồi chuyên biệt được sử dụng trong các phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự của 35S promoter có nguồn gốc từ virus Cauliflower mosaic Sản phẩm PCR 200 bp và

528 bp được khuếch đại từ vùng 35S promoter này Có tất cả 16 mẫu thực phẩm được

sử dụng để phát hiện GMO, trong đó có 10 mẫu được xác nhận có chứa GMO bao gồm: Bắp hạt dùng trong thức ăn gia súc, đậu nành xay thô dùng cho gia súc, bắp xay thô dùng cho gia súc, thức ăn gia súc hỗn hợp, thức ăn gia súc đậm đặc, bắp hạt cấp đông, bột sữa dinh dưỡng bắp, đậu nành hạt (chợ Bình Thủy, Cần Thơ), đậu nành hạt (chợ Xuân Khánh, cần Thơ), bột sữa dinh dưỡng đậu nành

Từ khóa: PCR, 35S promoter, GMO…

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1.GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Hiện trạng cây trồng chuyển gen 3

2.1 1 Hiện trạng cây trồng chuyển gen trên thế giới (từ năm 1996 – 2008) 3

2.1.2 Hiện trạng cây trồng chuyển gen ở trong nước 8

2.2 Phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) vào thực vật 11

2.2.1 Điều kiện cho chuyển gen ở thực vật 11

2.2.2 Các phương pháp biến nạp gen 12

2.3 Phương pháp phân tích thực vật mang gen biến nạp 15

2.3.1 Phương pháp phân tích tính kháng thuốc 16

2.3.2 Phương pháp phân tích hoá tế bào 16

2.3.3 Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật phân tích di truyền 17

2.3.4 Phương pháp phân tích chức năng sinh học của gen chuyển 19

2.4 Các đề tài nghiên cứu có liên quan 20

2.4.1 Các đề tài nghiên cứu trong nước 20

2.4.2 Các đề tài nghiên cứu ngoài nước 20

2.5 Sơ lược về kỹ thuật PCR 21

2.5.1 Khái niệm chung về PCR 21

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 22

3.1.1 Thời gian 26

3.1.2.Địa điểm 26

3.2 Phương tiện 26

3.2.1 Thiết bị 26

3.2.2 Hóa chất 26

3.2.3 Vật liệu 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Thu thập mẫu 27

3.3.2 Chuẩn bị mẫu 27

3.3.3 Trích DNA 27

3.3.4 Kiểm tra sản phẩm DNA 29

3.3.5 Thiết kế đoạn mồi – Thực hiện phản ứng PCR 30

3.3.6 Kiểm tra sản phẩm PCR 31

3.4 Bố trí thí nghiệm 32

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các qui trình ly trích DNA 32

3.4.2 Thí nghiệm 2: Thiết kế mồi và kiểm tra tính đặc hiệu của mồi 32

3.4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát hiện thực phẩm có chứa GMO 32

3.4.4 Cải thiện điều kiện PCR 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các qui trình ly trích DNA 34

4.2 Thí nghiệm 2: Thiết kế mồi và kiểm tra tính đặc hiệu của mồi 36

4.3 Thí nghiệm 3: Ứng dụng cặp mồi để phát hiện thực phẩm có chứa GMO 37

4.4 Thí nghiệm 4: Cải thiện điều kiện PCR 39

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Phụ lục 1 Thành phần và nồng độ các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

Phụ lục 3 Các hình ảnh về một số thiết bị chủ yếu phục vụ cho đề tài

Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu năm 2008 phân theo nước

(triệu ha) 5

Bảng 3 1.Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR trình tự 35S promoter (25 µl) 31

Bảng 4 1 Tổng số mẫu DNA đã được ly trích 34

Bảng 4 2 Kết quả đo độ hấp phụ tử ngoại của các mẫu DNA được ly trích 36

Bảng 4 3 Kết quả kiểm tra GMO bằng PCR trên các mẫu DNA đã ly trích 38

Tên hình Trang

Hình 2 1 Bản đồ phân bố các nước trồng cây chuyển gen & các nước có diện tích

trồng lớn năm 2008 7

Hình 2 2 Thiết bị xung điện Gen Pulser của Hãng BioRad (a) và sơ đồ nguyên lý hoạt động (b) 13

Hình 2 3 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen 14

Hình 2 4 Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 15

Hình 2 5 Các giai đoạn của phản ứng PCR 22

Hình 3 1 Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1380 27

Hình 4 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR thử tính đặc hiệu của cặp mồi 37

Hình 4 2 Điện di trên gel Agarose 1,5% sản phẩm PCR với cặp mồi Sense - Antiense 38

Hình 4 3 Kết quả cải thiện điều kiện PCR 40

Hình 4.4 Máy PCR

Hình 4.5 Máy ủ lắc

Hình 4.6 Máy chụp hình gel BioRad UV 2000

Hình 4.7 Bồn điện di

A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes

A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

DOPE : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine

EDTA : Ethylenediamine-tetraacetic acid

GMO : Genetically modified organism

RB : Right border RNase : Ribonuclease, enzime phân hủy RNA

TE : Tris-EDTA

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Các thực phẩm biến đổi gen GMF (Genetically modified food) là những thực

phẩm hay chất phụ gia được sản xuất hoặc xử lý qua một kỹ thuật biến đổi gen Các

sinh vật biến đổi gen GMO (Genetically modified organism) là những sinh vật trong

đó các gen được biến đổi bởi một kỹ thuật biến đổi gen chứ không phải do lai tạo tự

nhiên hay tái tổ hợp DNA

Trong những năm gần đây, các kỹ thuật biến đổi gen đã được cải thiện rất nhiều

Một số cây trồng biến đổi gen (cây trồng GM) chịu được thuốc diệt cỏ, kháng sâu

bệnh và cải thiện chất lượng dinh dưỡng đã và đang phát triển và được trồng rộng rãi ở

một số nước Trong khoảng thời gian 1996-2005 cây trồng chuyển gen đã được triển

khai trên một diện tích rất rộng lớn – khoảng 900.000 km2, có tới 55% là ở Hoa Kỳ

Đến năm 2005 tại Braxin đã có 94.000 km2 đậu nành chuyển gen được gieo trồng

Theo thống kê năm 2003 thì cây trồng chuyển gen chủ yếu được triển khai tại Hoa Kỳ

(63%), Argentina (21%), Canada (6%), Braxin (4%), Trung Quốc (4%), Nam Phi

(1%) Từ năm 2000 đã có 13 nước thực hiện việc triển khai cây trồng chuyển gen

Ngoài các nước nói trên còn có Australia, Bulgaria, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây

Ban Nha và Uruguay (Nguồn http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoa

hoc/thucphamchuyengen.htm)

Theo dữ liệu của tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD (Organisation for

Economic Co-operation and Development), phần lớn các cây trồng GM được trồng thử

nghiệm trên đồng ruộng phổ biến hiện nay là: Đậu nành, cà chua, bắp, khoai tây, lúa

mì, bông vải, củ cải đường, cải dầu, dưa leo, dưa hấu, rau diếp, cây hướng dương, lúa

và thuốc lá

Mục đích của sự phát triển cây trồng GM nhằm sản xuất những sản phẩm theo

mong muốn bằng cách biến đổi những tính trạng đặc biệt của cây trồng Nói chung,

mục tiêu nghiên cứu để sản xuất ra những cây trồng GM có thể phân thành bốn loại:

(1) Cải thiện chất lượng sản phẩm, (2) Kháng sâu bệnh, (3) Chống chịu điều kiện bất

lợi của môi trường, (4) Chống chịu được các kim loại nặng

Kể từ khi cây trồng GM phát triển, một số thực phẩm biến đổi gen GMF cũng đã

được tung ra thị trường Điều này đã đưa đến việc cần phải phát triển một số kỹ thuật

phát hiện thực phẩm GMF và cây trồng GM nhằm giúp thuận tiện hơn trong việc quản

lý các đối tượng này

Theo điều tra mới đây của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam,

hầu hết các mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trường Việt Nam hiện đều chứa sản phẩm

biến đổi gen (như bắp và đậu nành) với một tỷ lệ nào đó (Nguồn: http://www.vietsciens.f-

ree.fr) Phần lớn chúng được nhập chính thức qua các công ty liên doanh với nước

ngoài và chưa được kiểm soát Từ tháng 8/2005, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành

Qui chế quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, sản phẩm, hàng hoá có

nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Theo đó, cho phép nghiên cứu, sản xuất, kinh doanh sinh vật biến đổi gen hoặc sản phẩm của chúng đã được cấp giấy chứng nhận an

toàn song trên nhãn phải ghi rõ bằng Tiếng Việt: "Thực phẩm có gen đã bị biến đổi”

(Điều 87 Luật bảo vệ môi trường sửa đổi 2005 và điều 20 Pháp lệnh an toàn vệ sinh

thực phẩm 2003) Nhưng đến nay, do thiếu văn bản hướng dẫn thực hiện nên qui chế

trên vẫn chưa thực sự phát huy tác dụng Cũng qua điều tra trên, Bộ Nông nghiệp và

Phát triển nông thôn cũng nhận định, rất có thể một số thực phẩm chế biến từ đậu

nành, bắp, cải dầu đang được lưu hành trên thị trường có chứa sản phẩm biến đổi gen

mà ngoài nhãn mác không được ghi rõ

Nghiên cứu, đánh giá cây biến đổi gen cho các loại nông sản quan trọng như lúa,

bắp, đậu nành, bông vải, cải dầu và rau quả, cũng như chẩn đoán có hay không gen

biến đổi (genetically modified gene) trong thức ăn nhập khẩu như sữa, bơ, phó mát,

khoai tây chiên, xốt cà chua, margarine, và dầu ăn… là những việc rất quan trọng mà

Việt Nam cần phải làm ngay, chuẩn bị cho đến khi giới tiêu thụ thế giới chấp nhận

thực phẩm biến đổi gen, thì Việt Nam cũng đã có sẵn cán bộ và các kỹ thuật công nghệ

sinh học về giống, tạo giống và nhân nhanh giống biến đổi gen, phục vụ kịp thời cho

nông nghiệp Việt Nam, phát triển xuất khẩu (Nguồn: http://vietsciences.free.fr/timhieu/k-

hoahoc/gene/chuyengenecayluongthuc.htm)

Trong tình hình này, một trong những việc cần ưu tiên tiến hành đó là phải xác

định mức độ hiện diện của các sản phẩm biến đổi gen trên thị trường Do đó đề tài

”Ứng dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) phát hiện nhanh thực

phẩm chứa GMO” là cấp thiết và cần được tiến hành

Mục tiêu đề tài: Tìm ra một qui trình thích hợp phát hiện nhanh GMO và bước

đầu khảo sát được mức độ hiện diện của sản phẩm chuyển gen đang tồn tại trên thị

trường tại thành phố Cần Thơ

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Hiện trạng cây trồng chuyển gen

2.1 1 Hiện trạng cây trồng chuyển gen trên thế giới (từ năm 1996 – 2008)

Năm 1984, trên thế giới đã có một số nghiên cứu thành công khi chuyển gen vào

cây trồng Đến nay, vấn đề cải biến giống cây trồng đã phát triển vượt bậc Theo thông

báo tóm tắt của tổ chức ISAAA trong giai đoạn 1986 – 1997, trên toàn cầu có tới

25.000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền Trong đó,

72% các cuộc thử nghiệm được tiến hành tại Hoa Kỳ, tiếp đến là Canada, châu Âu,

châu Mỹ la tinh và châu Á Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên

đối tượng là 60 loại cây trồng (Lê Trần Bình, 2008)

Năm 2003, diện tích cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng với tỉ lệ hơn 15% so với

năm 2002 Theo đánh giá, diện tích cây trồng chuyển gen trên toàn cầu năm 2003 là

67,7 triệu ha tăng 40 lần so với năm 1996 là 1,7 triệu ha, thu hút khoảng 7 triệu nông

dân ở 18 nước tham gia Có 5 quốc gia chính trồng cây chuyển gen là Hoa Kỳ (48,2

triệu ha), Argentina (13,9 triệu ha), Canada (4,4 triệu ha), Braxin (3 triệu ha) và Trung

Quốc (2,8 triệu ha) Trong đó, Braxin là nước đầu tiên tham gia trồng thử nghiệm và

thương mại hóa cây chuyển gen với diện tích 3 triệu ha đứng hàng thứ 4 trên thế giới

Nhìn chung hiện nay, thương mại hóa các sinh vật GM (Genetically Mordified)

trong nông nghiệp chủ yếu tập trung vào các giống khác nhau của các cây trồng chính

là đậu nành (36,5 triệu ha), bắp (12,4 triệu ha), bông (6,8 triệu ha) và cải dầu ( 3 triệu

ha) Trong đó, hai tính trạng được tập trung chuyển gen nhiều nhất là kháng thuốc diệt

cỏ và kháng côn trùng Vào năm 2003, diện tích cây trồng chuyển gen kháng thuốc

diệt cỏ là 44,2 triệu ha (73%) chủ yếu là cây bắp, đậu nành, bông và 12,2 triệu ha (18%) trồng cây chuyển gen kháng sâu, tăng 2,1 triệu hecta so với năm 2002 tập trung

chủ yếu vào 2 loại cây trồng là bông và bắp Bt Ngoài ra, một số thử nghiệm nhỏ trồng

cây đu đủ, bí , khoai tây chuyển gen kháng virus, gen chín chậm và một số tính trạng

khác Hiện nay, trừ những giống cây công nghiệp như bông vải, các giống cây lương

thực kia đều có mặt trong tất cả các loại thực phẩm cho con người và thức ăn dùng cho

chăn nuôi Các sản phẩm GM này đã được phân phối khắp nơi, không những có mặt ở

châu Mỹ, châu Úc, châu Âu mà còn ở các nước thứ ba thông qua hình thức viện trợ

Cần chú ý rằng trong năm 2008, số nước trồng cây chuyển gen đã lên tới 25 nước, một mốc kỷ lục mới (Bảng 2.1 và Hình 2.1) Số lượng các nước trồng cây chuyển gen liên tục tăng kể từ khi được đưa vào thương mại hoá trên thị trường, từ 6

nước năm 1996 – năm đầu tiên cây chuyển gen được đưa vào canh tác – lên đến 18

nước năm 2003 và 25 nước năm 2009 Làn sóng ứng dụng công nghệ sinh học

(CNSH) này do một số yếu tố thúc đẩy như: số nước trồng cây chuyển gen gia tăng (thêm 3 nước trong năm 2008), châu Phi đạt được những tiến bộ vượt bậc trong

lĩnh vực CNSH từ 1 nước năm 2007 lên tới 3 nước năm 2008 (bên cạnh Nam phi có

thêm Burkina Faso và Ai Cập đưa cây trồng chuyển gen vào canh tác), Bolivia lần đầu

tiên trồng đậu nành chuyển gen, các nước đã trồng cây chuyển gen tiếp tục trồng thêm

những giống cây mới (Braxin trồng bắp Bt, Australia trồng cải canola chuyển gen,

Hoa Kỳ và Canada cũng bắt đầu sử dụng củ cải đường chuyển gen), gia tăng việc sử

dụng tính trạng tổng hợp ở cây bắp và bông, đưa số nước triển khai tính trạng này lên

10 nước Làn sóng ứng dụng giống cây trồng đa tính trạng mới này nối tiếp với

làn sóng trồng cây chuyển gen đầu tiên, tạo nên sự phát triển nhanh chóng của cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới (Clive James, 2008)

Bảng 2 1 Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu năm 2008 phân theo

nước (triệu ha)

(triệu ha)

Loại cây chuyển gen được canh tác

đủ, cỏ alfalfa, củ cải đường

* 14 nước có diện tích trồng thuộc loại lớn, từ 50.000 ha trở lên

Nguồn: Clive James, 2008

Những nước mới tham gia vào cộng đồng CNSH nông nghiệp ngày càng sử

dụng nhiều những giống cây chuyển gen đa tính trạng thay vì những giống chỉ mang

tính trạng đơn lẻ như trước đây, tỉ lệ ứng dụng tính trạng tổng hợp này ở cây bắp và

đậu nành đạt mức cao nhất Cụ thể trong năm 2008, 85% trong tổng số 35,3 triệu ha

trồng bắp của Hoa Kỳ là các giống bắp chuyển gen, 78% trong số đó là những

giống lai mang từ 2 đến 3 tính trạng; chỉ có 22% còn lại là những giống lai đơn tính

trạng Bắp SmartStaxTM có chứa 8 gen qui định nhiều tính trạng khác nhau, dự kiến

sẽ được đưa vào canh tác tại Hoa Kỳ từ năm 2010 Tương tự, bông chuyển gen cũng

chiếm hơn 90% diện tích trồng bông của Hoa Kỳ, Australia và Nam Phi, tỷ lệ

những giống bông nhiều tính trạng ở 3 nước này lần lượt là 75%, 81% và 83% Rõ

ràng là đặc tính tổng hợp ở cây chuyển gen ngày càng trở nên quan trọng và góp

phần quan trọng trong việc tính mức tăng diện tích một cách chính xác theo đặc tính

được triển khai cũng như diện tích trồng đơn thuần Đáng chú ý cây trồng chuyển

gen là công nghệ được áp dụng nhanh nhất trong nông nghiệp với diện tích đất canh

tác cây chuyển gen tăng 74 lần từ năm 1996 đến năm 2008 (Nguồn:

http://www2.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ids=2265&ur=dothiloi)

Hình 2 1 Bản đồ phân bố các nước trồng cây chuyển gen & các nước có diện tích trồng lớn năm 2008

Đậu nành chuyển gen tiếp tục là giống cây chính được trồng trong năm 2008 với

diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích đất trồng cây chuyển gen trên toàn

cầu, tiếp theo là bắp chuyển gen (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông chuyển gen

(15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện

tích đất trồng cây chuyển gen trên toàn cầu)

Kể từ khi được đưa vào canh tác đại trà từ năm 1996 đến năm 2008, tính trạng

chịu thuốc diệt cỏ tiếp tục là tính trạng được ứng dụng rộng rãi nhất Năm 2008, tính

trạng này được triển khai ở đậu nành, bắp, cải canola, bông và alfalfa, chiếm 63%,

tương đương với 79 triệu ha tổng diện tích đất trồng cây chuyển gen trên toàn cầu

Trong vòng 2 năm liên tiếp, các giống cây mang 2 tính trạng và 3 tính trạng phát

triển mạnh mẽ, được trồng trên diện tích lớn (26,9 triệu ha, tương đương với 22%

diện tích cây trồng chuyển gen trên toàn cầu), nhiều hơn so với cây đơn tính trạng

kháng sâu bệnh (chỉ được trồng trên diện tích 19,1 triệu ha, tương đương với 15%

tổng diện tích đất) Cây đa tính trạng là nhóm cây chuyển gen tăng số lượng nhanh

nhất trong năm 2007 và 2008, với tỉ lệ tăng trưởng 23%, cao hơn nhiều so với cây

đơn tính trạng chịu thuốc diệt cỏ (tăng 9%) và kháng sâu bệnh (giảm 6%)

2.1.2 Hiện trạng cây trồng chuyển gen ở trong nước

Lĩnh vực công nghệ sinh học đã có những đóng góp quan trọng góp phần nâng

cao hiệu quả của sản xuất và đáp ứng nhu cầu đời sống của con người Chỉ tính riêng

trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều giống cây trồng vật nuôi có giá trị đã được chọn tạo

bằng con đường công nghệ sinh học Nhiều gen quý như: các gen qui định năng suất,

chất lượng, chống chịu đã được phân lập chuyển vào cây trồng vật nuôi tạo nên những

giống lý tưởng

Sinh vật chuyển gen (GMO) cho năng suất cao, đem lại lợi ích cho người sản

xuất là điều đã được khẳng định qua khoa học và thực tiễn Ở nước ta, trước năm

2001, các dự án nghiên cứu công nghệ sinh học quốc gia vẫn được hỗ trợ từ các Chính

phủ và tổ chức quốc tế Từ năm 2001, Chính phủ đã đầu tư 3 dự án nghiên cứu về

GMO Những dự án này liên quan đến nhiều cây trồng quan trọng của Việt Nam như:

cây bông, hoa, cây có củ và cây rừng Tuy nhiên, trong lĩnh vực chuyển gen tạo các

sinh vật biến đổi di truyền, Việt Nam vẫn còn xuất phát chậm hơn so với thế giới hàng

chục năm Do điều kiện còn hạn chế nên các công trình nghiên cứu về chuyển gen còn

ít (Lê Trần Bình, 2008)

Một số phòng thí nghiệm đã và đang được nhà nước đầu tư bước đầu và có điều

kiện gửi các cán bộ đi thực tập ở những phòng thí nghiệm tiên tiến của nước ngoài Do

vậy, chúng ta đã làm chủ được các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và

xác định trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, động vật, thực

vật, nghiên cứu biểu hiện gen v.v

(Nguồn:http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Nghi%c3%aan_c%e1%bb%a9u_c%c3

%a2y_tr%e1%bb%93ng_bi%e1%ba%bfn_%c4%91%e1%bb%95i_gene:_B%e1%bb%a9c_tr

anh_Vi%e1%bb%87t)

Hiện tại, một số công trình nghiên cứu là cơ sở để tạo GMO đang được triển khai

như nghiên cứu gen thủy phân và lên men tinh bột, gen hormone sinh trưởng ở cá, gen

chịu hạn, lạnh ở lúa, gen mã hóa protein tinh thể độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của

vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và các gen có giá trị khác

Trong các lĩnh vực GMO, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp

cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của các Viện công nghệ sinh học và Viện sinh học Nhiệt đới (thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng

bằng Sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) Một số công

trình nghiên cứu chuyển gen chọn lọc như: Gen kháng kanamycin, hygromycin v.v

đã được tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện các qui trình chuyển gen vào một số cây

trồng quan trọng làm cơ sở cho các bước chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây

trồng này Một số phòng thí nghiệm đã thu được thành công nhất định khi nghiên cứu

tạo GMO Nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng

thành công để đưa các gen có giá trị vào hàng loạt cây trồng quan trọng như lúa, thuốc

lá, đu đủ, cà chua, khoai tây, cải bắp, v.v Năm 1994, Phan Tố Phượng et al, đã thành

công trong việc sử dụng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium

tumefaciens để chuyển gen vào cây Arabidopsis Vào năm 1998, cũng chính nhóm tác

giả này đã công bố kết quả chuyển gen Xa21 vào giống lúa Việt Nam bằng phương

pháp sử dụng súng bắn gen (Nguồn: http://www.khoahoc.com.vn/print/8454.aspx)

Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, nhóm nghiên cứu của Đặng Trọng Lương đã

tiến hành phân lập và thiết kế vector mang gen tổng hợp insulin để chuyển vào cây lúa

mì; thiết kế vector và chuyền gen cryIA (c) vào cây cải bắp Ngoài Đặng Trọng Lương

et al, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Uyển tại Viện Sinh học Nhiệt đới, Thành phố

Hồ Chí Minh cũng đã tạo được các cây thuốc lá, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cây

cà tím bằng phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens chủng

EHA105 Hầu hết các cây trồng biến đổi di truyền này mang gen bar, gen cryIA (c) và

gen chỉ thị gusA Trên lĩnh vực này, Viện Công nghệ sinh học nói riêng đã đào tạo

được đội ngũ cán bộ có chuyên môn sâu, đồng thời thu thập và phân lập được hàng

chục loại gen quý có giá trị Viện cũng đã và đang tiến hành nghiên cứu các giống cây

trồng chuyển gen Trong chương trình CNSH mang ký hiệu KHCN-02 giai đoạn 1996

– 2000, Viện Công nghệ sinh học đã thực hiện đề tài liên quan đến công nghệ chuyển

gen ở cây trồng, trong đó gen Xa21 kháng bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn gây ra và gen

cry mã hóa protein tinh thể độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã được chuyển

vào lúa Trước đó, Viện Công nghệ sinh học cũng tiến hành các nghiên cứu phân lập

gen chịu lạnh ở cây lúa và tham gia thực hiện đề án INCO18 với Bỉ, Pháp, Tây Ban

Nha và Trung Quốc về tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng công nghệ chuyển gen Cũng trong chương trình hợp tác quốc tế, được sự hỗ trợ của

ISAAA, Viện đã và đang tiến hành nghiên cứu chuyển gen kháng virus đốm vàng vào

cây đu đủ và đã thu được các cây đu đủ chuyển gen trong nhà lưới Gần đây, Viện

đang hợp tác với Viện Nghiên cứu và Phát triển cây Bông ở Nha Hố để triển khai chuyển gen cry và gen chịu hạn tạo cây bông kháng sâu và chịu hạn (Lê Trần Bình,

2008)

Kết quả của những nghiên cứu trên là những cây chuyển gen đã được tạo ra và

lưu trữ trong điều kiện in vitro và trong điều kiện nhà kính Tuy nhiên, tất cả các cây

trồng chuyển gen được tạo ra ở Việt Nam mới chỉ tồn tại ở qui mô thí nghiệm và chờ

thử nghiệm, trước khi qui chế cho việc tiến hành thử nghiệm cho các cây trồng này ở

ngoài đồng ruộng có hiệu lực

Việt Nam hiện nay và trong thời gian dài nữa đã và sẽ còn là một nước nhập

khẩu các sản phẩm công nghệ sinh học hiện đại là chính Hiện nay chưa có cơ quan

nào thống kê, đánh giá đầy đủ tình trạng các giống cây con thuộc GMO, số lượng vi

sinh vật lạ, các sản phẩm của chúng được sử dụng trong nông nghiệp, công nghiệp

thực phẩm, dược phẩm đã nhập vào việt Nam Do chúng ta chưa có văn bản pháp lý để

quản lý thống nhất trên cả nước nên các hoạt động nghiên cứu, ứng dụng, bảo quản,

sản xuất, xuất nhập khẩu, vận chuyển GMO hoặc sản phẩm, phụ phẩm của chúng đang

trôi nổi tự do, không thể quản lý hay kiểm soát được Mặc dù chúng ta chưa tạo ra được cây trồng chuyển gen ở qui mô thương mại và sản phẩm của GMO chưa nhiều

nhưng ở nước ta hiện nay đang tồn tại một số cây trồng chuyển gen cũng như lưu hành

trong thị trường một số sản phẩm biến đổi gen Trong số đó phải kể đến cây bông

chuyển gen cry được nhập không chính thức Ngoài ra, một phần khá lớn lượng dầu

đậu nành cũng như bắp trong thành phần thức ăn gia súc nhập vào Việt Nam đều chứa

một tỷ lệ sản phẩm biến đổi di truyền Năm 1995 – 1996 một số công ty chăn nuôi liên

doanh đã nhập hàng chục ngàn tấn bắp từ Hoa Kỳ Không ai có thể trả lời đó là GMO

hay không và cũng có nhiều thức ăn chín được nhập từ nước ngoài như: thịt, trứng,

sữa, v.v cũng có thể là sản phẩm của cơ thể sống biến đổi gen (LMO) (Tạp chí Hoạt

động Khoa học số 10/2000) Hiện nay, Quỹ Rockerfeller đang tài chợ cho Việt Nam

(và các nước châu Á khác) tiếp nhận cây lúa vàng (Golden Rice) giàu tiền vitamin A (

β- caroten) tạo được nhờ chuyển gen tổng hợp carotene từ cây hoa thủy tiên vàng vào

cây lúa Về vấn đề chuyển gen đối với vật nuôi, hiện tại, Viện Công nghệ sinh học

đang triển khai và tạo được giống cá chép trắng và cá bống mang gen sản xuất ra hoormon sinh trưởng tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm

Trong giai đoạn từ 2001 đến nay (2007) nhiều đề tài nghiên cứu về cây trồng

chuyển gen đã dược triển khai, trong đó đáng chú ý là kết quả của đề tài KC04.13 về

chuyển gen chủ yếu ở các cây trồng “không làm thực phẩm” và đề tài KC04-22 về cây

chuyển gen có củ Hiện tại, hướng phát triển cây trồng chuyển gen đang được tập

trung mạnh vào các đối tượng là cây lâm nghiệp như thông, bạch đàn, keo và cây công

nghiệp như bông và mía (Lê Trần Bình, 2008)

2.2 Phương pháp chuyển gen (biến nạp gen) vào thực vật

Genome của thực vật nằm trong các bào quan khác nhau, phần chính ở nhân,

một phần nhỏ nằm ở lục lạp và một phần nhỏ nữa nằm ở ty thể Hầu hết các nghiên

cứu chuyển gen đều thử nghiệm việc chuyển gen lạ vào trong nhân Tuy nhiên, gần

đây càng có nhiều quan tâm đối với việc chuyển gen vào cơ quan tử vì lý do an toàn

sinh học Gen lục lạp được biến nạp ở tảo lục Chlamydomonas (Boynton et al., 1988;

Blowers et al., 1989) Chuyển gen vào ty thể thành công ở nấm men (Butow và Fox,

1990)

2.2.1 Điều kiện cho chuyển gen ở thực vật

Các điều kiện cần thiết cho việc chuyển gen vào thực vật là yếu tố mang gen

cần chuyển (vector), gen cần chuyển, đoạn khởi động (promoter) và đoạn kết thúc (terminator) Vector cần có những bộ phận sau: Một đoạn khởi đầu tái bản; một gen

chỉ thị chọn lọc để thao tác trong E.coli và một gen chỉ thị khác được khống chế bởi

một promoter mạnh của thực vật để phục vụ cho việc chọn lọc ở thực vật Plasmid

T-DNA được dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium được gắn thêm một đoạn

khởi đầu, một đôi đoạn lặp lại của T-DNA biên trái và biên phải trợ giúp cho plasmid

được ghép nối vào DNA cây chủ (Horsch & Klee, 1985)

Có hai loại promoter dùng cho chuyển gen thực vật, đó là promoter thường

trực (constructive promoter) như CAMV 35S hoạt động thường xuyên trong mọi bộ

phận, mọi thời điểm và mọi hoàn cảnh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm

(Jerfferson et al., 1987; Benfey & Chua, 1989; Battraw & Hall, 1990) Đoạn khởi động

như vậy rất cần cho những nghiên cứu đầu tiên về cây chuyển gen Loại thứ hai là promoter chỉ hoạt động ở từng loại mô, ví dụ như; ở củ và hạt v.v.; ở từng thời điểm,

ví dụ như: khi ra hoa, khi ngủ nghỉ v.v.; và hoàn cảnh nhất định (Kuhlenmeier et al.,

1989) như sốc nhiệt (Baumann et al., 1987), ánh sáng (Kulenmeier et al., 1989), bị vết

thương (Keil, 1990), bị nấm (Schmid et al., 1990) Promoter thường có cấu trúc khá

đồng bộ cho phép nhận được những mức độ thể hiện gen khác nhau thông qua hoán vị

và tổ hợp các vùng khác nhau của một promoter Điều đó thể hiện rất rõ ở promoter

CAMV 35S (Benfey & Chua, 1989) Hoạt lực của promoter có thể được tăng cường

khi bố trí hai hoặc nhiều promoter nối tiếp hoặc tổ hợp với nhau (Comai et al., 1989)

Đoạn kết thúc phiên mã của thực vật thường chứa một tín hiệu polyadenyl hóa đó là

AATAAA; AATTAA hoặc AACCAA (Dean et al., 1986; Joshi, 1987) Hai đoạn kết

thường dùng trong biến nạp thực vật là đoạn kết của CAMV 35S và đoạn kết nos

Đuôi polyA có tác dụng bảo vệ các phân tử mRNA bền vững chống lại sự phân hủy

(Gallie et al., 1991) Gen chọn lọc giúp cho việc nhận biết thể biến nạp được dễ dàng

(Dekeyser et al., 1989)

2.2.2 Các phương pháp biến nạp gen

Có nhiều phương pháp biến nạp gen áp dụng cho thực vật, tuy nhiên những

phương pháp có giá trị thực tiễn quan trọng chỉ hạn chế trong hai nhóm phương pháp

chính Đó là (1) biến nạp trực tiếp DNA bằng tác nhân hóa học như polyethylene

glycol (PGE), xung điện và súng bắn gen và (2) biến nạp DNA gián tiếp thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens

i) Biến nạp trực tiếp bằng hóa chất

Trong nhiều năm, kỹ thuật chuyển gen thông qua tiếp nhận DNA tinh chế vào tế

bào trần là giải pháp kỹ thuật quan trọng của công nghệ gen thực vật Thuốc lá và hoa

mào gà là hai đối tượng đầu tiên cho chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của

poly-L-ornithine hoặc polyethylene glycol (PEG) Nguyên lý chung của phương pháp là

trong điều kiện dung dịch chứa nồng độ PEG phân tử lượng cao (~ 8000) thì tế bào

trần cạnh tranh với PEG các phân tử nước theo nguyên tắc thẩm thấu Kết quả là tế

bào trần mất nước và nhăn nhúm lại Khi pha loãng và rửa sạch PEG khỏi dung dịch

các phân tử nước được tế bào tiếp nhận trở lại các phân tử DNA qua màng nguyên

sinh chất

ii) Biến nạp bằng xung điện (Electroporation)

Thiết bị biến nạp gen bằng xung điện được goi là Gen Pulser hoạt động trên

sắp xếp thành từng chuỗi từ điện cực dương sang điện cực âm Khi một dòng điện

mạnh chạy qua trong một khoảng thời gian khoảng vài phần nghìn giây, màng nguyên

sinh chất giữa chúng bị đánh thủng thành lỗ (poration tức là khoan lỗ) và làm cho các

phân tử DNA mang điện tích âm thâm nhập vào trong tế bào

Hình 2 2 Thiết bị xung điện Gen Pulser của Hãng BioRad (a) và sơ đồ

nguyên lý hoạt động (b)

(Nguồn: http://www.ptf.okstate.edu/pulser.html)

Hiệu quả chuyển gen trực tiếp tăng lên đáng kể nhờ kỹ thuật xung điện này Tuy

nhiên, phương pháp này cũng thường được áp dụng cho những nghiên cứu nhanh đối

với quá trình biểu hiện tạm thời của các gen trong tế bào thực vật vì lượng DNA thâm

nhập vào tế bào không được xác định chính xác Mặc dù kỹ thuật này chủ yếu được

dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời các gen trong tế bào trần, đã có nhiều cải

tiến đối với kỹ thuật này để ứng dụng cho tế bào còn nguyên vẹn thành cellulose (Fromm et al., 1985) Tuy nhiên, để đạt hiệu quả cao tế bào và mô trước khi biến nạp

phải được xử lý trước như làm bị thương hoặc xử lý với dung dịch có áp suất thẩm

thấu cao hoặc có enzyme (macerozyme)

iii) Biến nạp bằng súng bắn gen

Klein (1987) là tác giả đầu tiên tiến hành chuyển gen vào tế bào biểu bì của cây

hành bằng kỹ thuật bắn gen Nguyên lý chính của kỹ thuật bắn gen là DNA được bọc

ra ngoài các hạt bụi vàng (hoặc Wolfram) kích thước khoảng 1μm, hạt vàng bọc gen

được bắn vào khối mô đặt phía trước luồng đạn nhờ áp lực cao (3.500psi) của một

luồng khí helium

Đến nay kỹ thuật bơm hạt có nhiều tên gọi khác nhau như: chuyển nạp sinh học

(biolistics), bơm vi tiêm (microprojectile bombardement), gia tốc hạt (particle acceleration) nhưng đều có chung nội dung là bắn gen Kỹ thuật bắn gen có những ưu

điểm chính như sau:

(1) Chuyển được gen cho các khối mô có tổ chức Ưu điểm này cho phép chọn

những loại mô có triển vọng tái sinh cây tốt để chuyển gen

(2) Hệ thống chuyển gen toàn năng: Về nguyên tắc có thể bắn gen cho bất kì loại

mô nào, cơ quan nào và kết quả nhuộm tạm thời khẳng định điều đó, nhưng kết quả tái

sinh cây còn phụ thuộc vào loài và loại mô chọn

(3) Chuyển được gen cho các giống cây trồng có giá trị Không những áp dụng tốt

cho cây mô hình mà ngay cả những giống cây đang phổ biến như: bắp, lúa (Chen et

al.,1993: Christou et al., 1991: 1995) v.v.cũng cho phép tiến hành chuyển gen

Hình 2 3 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen

(Nguồn: http:// artsci.wustl.edu/~anthro/blurb/B der.html)

iv) Biến nạp gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn đất Agrobacterium có hai loài được dùng trong kỹ thuật di truyền, đó là A

tumefaciens và gây tác động gây nên khối u crown gall của A tumefaciens và gây nên

búi rễ của A rhizogens đối với nhiều loại thực vật mà bản chất của nó là gen của vi

khuẩn được chuyển vào tế bào chất thực vật

Hiện tượng gen của vi khuẩn đất được chuyển vào tế bào thực vật được coi là

plasmid khổng lồ kích thước trên 400 kb có tên gọi là Ti - plasmid Không phải chỉ

toàn bộ DNA của Ti - plasmid thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ có một đoạn gen

nằm giữa biên trái ( left border LB) và biên phải (right border RB) của đoạn DNA vận

chuyển (transfer DNA, T-DNA) tách khỏi phân tử Ti và thâm nhập vào tế bào Hơn

thế nữa đoạn T-DNA này còn có khả năng hoà nhập vào DNA nhiễm sắc thể và trở

thành một bộ phận bền vững trong genome của thực vật

Hình 2 4 Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ

Agrobacterium

(Nguồn:http://www.shikshasetu.in/engineering/b cle4.htm)

2.3 Phương pháp phân tích thực vật mang gen biến nạp

Điều quan trọng sau khi chuyển gen là cần theo dõi gen chuyển vào cây sẽ được

bộ genome của tế bào chủ tiếp nhận như thế nào Hiện nay có nhiều nhóm phương

pháp cần được tiến hành trong quá trình tạo cây trồng chuyển gen Các nhóm phương

pháp đó bao gồm:

- Phân tích kháng thuốc

- Phân tích hoá tế bào

- Phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Phân tích hoạt động của gen chuyển (transgen)

2.3.1 Phương pháp phân tích tính kháng thuốc

Thực chất phân tích tính kháng thuốc là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính

kháng thuốc thông qua hoạt động của gen chuyển Thuốc được hiểu ở đây là thuốc

kháng sinh kanamycine khi dùng gen nptII hoặc hygromycine khi dùng gen hpt hoặc

thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar Bước phân tích này có thể áp dụng cho mỗi giai

đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái tế bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh

hay cây con gieo từ hạt Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung thuốc theo nồng độ

nhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của thuốc lên mô hoặc cây

Thông thường là mô và cây mất khả năng quang hợp rồi sau đó chết, có màu nâu đen

Phương pháp thử tính kháng thuốc còn được phát triển thành phương pháp tạo

vết tẩy trên lá Thuốc kháng sinh được pha ở nồng độ cao (2-5 lần so với thử invitro),

bổ sung Tween để tăng khả năng bám dính Sau đó dùng bút lông quét lên lá xanh của

cây cần thử Cũng có thể nhúng sợi chỉ bằng bông thấm dịch thuốc rồi vắt sợi chỉ qua

nhiều lá của nhiều cây Sau 3-5 ngày có thể quan sát thấy nơi bôi trơn hay nơi sợi chỉ

vắt qua hình thành các vết trắng hoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục Ở những cây

có tính kháng vết đó không hình thành Để bảo đảm độ chính xác cần tiến hành thử lại

những cá thể được chọn 2-3 lần lặp lại (Lê Trần Bình, 2008)

2.3.2 Phương pháp phân tích hoá tế bào

Có thể nhuộm hoá tế bào để khẳng định sự có mặt của sản phẩm gus thông qua

hoạt động biểu hiện của gen gus Nhuộm gus được thực hiên trong phòng thí nghiệm

xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh Nhuộm gus cũng

được thực hiện để khẳng định gen chuyển được di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm

phôi của hạt hình thành từ cây chuyển gen

Sản phẩm sơ cấp 5-Brom-4-Clo-3-indolyl vẫn còn là một chất dễ tan và không

màu Nhưng ngay sau đó sản phẩm này bị oxy hoá và dimer hoá thành một phức hệ

không tan có màu xanh Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm

gia tăng quá trình hình thành sản phẩm màu cuối cùng, đồng thời góp phần hạn chế

việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến những vùng không có mặt gus

2.3.3 Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật phân tích di truyền

Sau bước chọn lọc trên môi trường có chứa các tác nhân chọn lọc như kháng

sinh, thuốc trừ cỏ, vấn đề cốt yếu còn lại là phải phân tích được số phận của gen biến

nạp trong tế bào nhận bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như sau:

- PCR

- Lai Southern

- Phân tích biểu hiện gen

Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế

bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể

plasmid độc lập tự do nhân; (3) Ổn định như một đoạn DNA của một genome trong tế

bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp Đương nhiên

trạng thái thứ ba được ưa chuông nhất vì tính bền vững của thể biến nạp, nhưng nó

hoàn toàn phụ thuộc vào kết quả tái tổ hợp Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc

nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tượng nhân không tương hợp đối với đoạn gen lạ

khi hoà đồng vào DNA nhân Bởi vì vị trí đoạn gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến

biểu hiện của chính nó hay gen chủ gần đó cho nên người ta đang quan tâm nhiều đến

tái tổ hợp tương hợp hoặc là ghép nối định hướng (Yoder & Kmiec, 1991) Nếu kỹ

thuật này thành công thì khả năng thay thế gen trở thành hiện thực và sẽ có giá trị lớn

về mặt thực tiễn và lý luận

i) Phương pháp phân tích cây chuyển gen bằng PCR

Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với các phòng thí nghiệm chuyên về

gen công nghệ thực vật Gen chuyển là gen được biết vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi

đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có

thể tiến hành PCR Nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như dự kiến thì mẫu phân

tích được coi là dương tính Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển

gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích:

(1) Vi khuẩn Agrobacterium mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong các

gian bào của mẫu phân tích Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng Nếu là

mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính, tức qua thế hệ F1, F2 v.v dưới

dạng hạt rồi thì hoàn toàn loại trừ khả năng này, (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế

bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính; (3) Gen chuyển không hoạt động, tức

là không biểu hiện thành protein có chức năng sinh học Vì thế kết quả phân tích bằng

PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu (Hầu hết các tạp chí chuyên ngành không

chấp nhận những công bố chuyển gen khi tác giả mới đạt kết quả phân tích PCR)

ii) Lai Southern

Lai southern là việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genome của cây

nhận thông qua DNA tổng số của mẫu phân tích với mẫu DNA dò Mẫu dò chính là

một đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100-300 bp được đánh dấu phóng xạ hay

huỳnh quang Có thể tóm tắt các bước như sau:

i Tách chiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích

ii Xử lý cắt hạn chế với 1-2 enzyme

iii Điện di DNA trên gel agarose

iv Thấm truyền bản gel trên màng nitrosocellulose ( còn gọi là blotting)

v Tổng hợp DNA mẫu dò có đánh dấu bằng phóng xạ hay huỳnh quang bằng

PCR với mẫu ngẫu nhiên (6-mer oligo)

vi Lai mẫu dò với màng mang DNA

vii Hiển thị trên phim X quang

viii Phân tích kết quả

Lai Southern góp phần tiến xa hơn một bước trong việc đánh giá kết quả chuyển

gen: Một mặt kết quả dương tính khi lai khẳng định gen chuyển tồn tại trong genome

cây nhận, đồng thời số lượng band dương tính cho biết số lượng bản sao của bản gen

chuyển có mặt trong genome cây nhận Trong nhiều trường hợp lượng bản sao đó

không phải chỉ là 1 bản, mà là 2 hay nhiều bản

iii) Phân tích biểu hiện gen