Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Để Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Virus Đốm Trắng

TÓM TẮT Qua một số nghiên cứu cho thấy virus đốm trắng White Spot Syndrome Virus- WSSV có sự biến đổi về bộ gen theo vị trí địa lý, khi thay đổi ký chủ khác nhau thì cũng có thay đổi một

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ĐỂ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VIRUS ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS)

TRÊN TÔM BẠC (Fenneropenaeus merguiensis), TÉP TRẤU

(Macrobrachium lanchesteri) VÀ TÔM SÚ (Penaeus monodon)

VIỆN NC&PT CNSH MSSV: 3064388

LỚP:CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đển tất cả quý thầy cô trong trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ em trong suốt bốn năm dài trên con đường đi tìm tri thức Em xin cám ơn các thầy, cô, anh, chị của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo mọi đều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này Đặc biệt em xin chân thành cám ơn cô cố vấn Trần Thị Xuân Mai và cô Bùi Thị Minh Diệu- người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, luôn động viên và cung cấp nhiều tài liệu, kiến thức quý báu, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cám ơn thầy Nguyễn Thanh Phương- Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ; cô Kim Hường- Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, trường Đại học Trà Vinh và anh Phạm Văn Mười- Cà Mau và tất cả bà con nông dân đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thu mẫu thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cám ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K32 đã luôn bên cạnh em và cùng em chia sẻ biết bao buồn vui trong những ngày sống xa nhà Cám ơn các bạn đã cho mình rất nhiều kỉ niệm đẹp trong suốt quãng đời sinh viên

Và cuối cùng em vô cùng biết ơn Ba mẹ đã hi sinh thầm lặng để nuôi dưỡng, che chở cho con đến ngày khôn lớn cùng tất cả anh chị em trong gia đình đã yêu thương, thông cảm cho con và đã miệt mài cùng con trong suốt những chặng đường dài

Em xin chân thành cám ơn!

TÓM TẮT

Qua một số nghiên cứu cho thấy virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus- WSSV) có sự biến đổi về bộ gen theo vị trí địa lý, khi thay đổi ký chủ khác nhau thì cũng có thay đổi một số kiểu gen và có khả năng lây nhiểm trở lại tôm sú (Penaeus monodon) gây bùng phát dịch bệnh trên diện rộng…, gây thiệt hại nặng nề cho nghành nuôi tôm Do đó vấn đề đặt ra là cần phải tìm hiểu sự biến đổi di truyền của virus đốm trắng trên các ký chủ khác nhau để từ đó làm tiền đề định hướng cho các phương pháp ngăn ngừa và phòng trị đạt hiệu quả cao nhất góp phần tăng giá trị kinh

tế của tôm sú Nội dung của đề tài này là tìm ra các chỉ thị phân tử thể hiện sự khác biệt về di truyền trên các ORF thuộc vùng gen VNTRs ( variable number tandem repeats ) của các chủng WSSV (White Spot Syndrome Virus) trích trên tôm sú, tôm bạc (Fenneropenaeus merguiensis) và tép trấu (Macrobrachium lanchesteri) ở huyện Hồng Dân, Đông Hải thuộc tỉnh Bạc Liêu và huyện Đầm Dơi tỉnh Cà Mau Kết quả thu được có thể sử dụng ORF75 để so sánh sự khác biệt di truyền của các chủng WSSV trên tôm sú ở trong phạm vi từng ao và ORF125 để so sánh sự khác biệt về di truyền của WSSV trên tôm sú, tép trấu giữa các ao với nhau thông qua kiểu gen đặc trưng của từng ao Với tỉ lệ sự giống nhau cao về thông tin di truyền của các mẫu WSSV trên tôm sú và tôm bạc ở 3 ORF được khảo sát có thể cho rằng tôm bạc là nguồn lây nhiễm WSSV chính cho tôm sú trong ao

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược tình hình nuôi tôm và bệnh tôm ở nước ta 3

2.1.1 Diện tích và sản lượng tôm nuôi 3

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm sú 4

2.2 Sơ lược về các ký chủ trung gian 5

2.3 Bệnh đốm trắng 5

2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý 6

2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 6

2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên các ký chủ 12

2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)……… 13

2.5.1 Phản ứng PCR 13

2.5.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến sản phẩm PCR 14

2.5.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và hóa chất 16

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2.2 Dụng cụ 16

3.2.2 Mồi, hóa chất 16

3.3 Phương pháp tiến hành 17

3.3.1 Thu và bảo quản mẫu tôm và ký chủ 17

3.3.2 Ly trích và kiểm tra chất lượng ADN 17

3.3.3 Thực hiện phản ứng PCR và điện di 18

3.3.4 Xác định số đơn vị lặp lại của ORF94 và ORF125 19

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Đa dạng sinh học của WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng Dân 20

4.1.1 Đa dạng của WSSV trên tôm sú ở huyện Hồng Dân 20

4.1.2 Đa dạng của WSSV trên tép trấu ở huyện Hồng Dân 21

4.1.3 Mối liên hệ di truyền của WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng Dân 22

4.2 Đa dạng sinh học của WSSV trên tôm sú, tôm bạc và tép trấu ở huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu và huyện Đầm Dơi tỉnh Cà mau 24

4.2.1 Đa dạng của WSSV trên tôm sú ở huyện Đông Hải và Đầm Dơi 25

4.2.2 Đa dạng di truyền của WSSV trên tép trấu và tôm bạc ở Đông Hải và Đầm Dơi 26

4.2.3 Mối liên hệ di truyền giữa các mẫu WSSV trên tép trấu, tôm bạc và tôm sú ở 2 huyện Đông Hải và Đầm Dơi 26

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Thông tin mẫu thí nghiệm

Phụ lục 2 Số liệu đo OD của các mẫu phân tích

Phụ lục 3 Kết quả hình gel của các mẫu thí nghiệm

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Diện tích các vùng nuôi tôm năm 2001 và 2003 3 Bảng 2 So sánh các đơn vị lặp lại của các ORF mang các lặp lại có định hướng, thuộc vùng không tương đồng giữa ba chủng WSSV 9 Bảng 3 Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu của Dieu et al., 2004 11 Bảng 4 Các primer được sử dụng trong nghiên cứu 16 Bảng 5 Kiểu gen VNTRs của mẫu WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng Dân 22 Bảng 6 Kiểu gen VNTRs của mẫu WSSV trên tôm sú, tôm bạc và tép trấu ở huyện Đông Hải và Đầm Dơi 24 Bảng 7 Nguồn gốc và ký hiệu các mẫu dùng phân tích thí nghiệm Bảng 8 Kết quả OD của các mẫu phân tích

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Phân tích bootstrap (100 bản sao) của cây phát sinh loài không rễ của protein ADN polymerase tạo nên bởi thuật toán phân tích PAUP Đường đậm chỉ sự giống

nhau đến trên 70% (giá trị bootstrap >70) (van Hulten et al., 2001a) 7

Hình 2 Mô hình virion của WSSV (Mark, 2005) 8

Hình 3 Chu kì gia nhiệt của phản ứng PCR đối với primer VP26 18

Hình 4 Kết quả PCR với ORF75 của các mẫu WSSV trên tôm sú 20

Hình 5 Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu 25

Hình 6 Kết quả PCR với ORF75 của các mẫu WSSV trên tôm sú

Hình 7 Kết quả PCR với ORF75 của mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu

Hình 8 Kết quả PCR với ORF94 của các mẫu WSSV trên tôm sú

Hình 9 Kết quả PCR với ORF94 của mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu

Hình 10a Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm sú

Hình 10b Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm sú

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CBV Chinese baculovirus

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

FAO Food and Agriculture Organization

HHNBV Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Baculovirus

ICTV the International Committee on Taxonomy for Viruses

OIE Office International des Epizooties

ORF125 Open Reading Frame 125

ORF75 Open Reading Frame 75

ORF94 Open Reading Frame 94

PCR Polymerase chain reaction

OD Optical Density

PRDV Penaid rod-shaped DNA virus

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

RV-PJ Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus

SEMBV Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus

VNTRs Variable number tandem repeats

TH-96-II Chủng WSSV có ly trích từ mẫu tôm thu ở Thái Lan vào năm 1996 WSBV White Spot Baculovirus

WSD White Spot Disease

WSSV White Spot Syndrome Virus

WSSV-CN Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Trung Quốc

WSSV-TH Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Thái Lan

WSSV-TW Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Đài Loan

WSSV-VN Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Việt Nam

YHD Yellow Head Virus

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Ngày nay ngành nuôi trồng thủy hải sản đang phát triển rộng khắp trên toàn thế giới nhằm góp phần đáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế đồng thời đáp ứng nhu cầu tiêu dùng gia tăng, bên cạnh đó còn ngăn ngừa hiện tượng khai thác quá mức nguồn tài nguyên thiên nhiên đang có nguy cơ cạn kiệt Trong đó, tôm sú là loài rất được chú trọng do phù hợp với thị hiếu và khẩu vị của người tiên dùng và tôm sú cũng đã mang lại giá trị lợi nhuận đáng kể cho người nuôi, tăng thu nhâp cho nền kinh tế quốc dân Tuy nhiên,trong khoảng thời gian gần đây hiện tượng nuôi bùng phát thiếu kiểm soát, người nuôi không đủ trình độ kỹ thuật đã gây nên nhiều vấn đề nghiêm trọng như không rà soát hết được nguồn gốc tôm giống do đó không đảm bảo tính ổn định về chất lượng, sử dụng các loại nhiều loại hóa chất gây ô nhiễm môi trường nuôi trầm trọng,… Từ đó các loại dịch bệnh có cơ hội bùng phát và lây lan nhanh chóng thành dịch gây nên nhiều khó khăn cho nhà quản lý và nhất là thiệt hại rất lớn về kinh tế cho người nuôi - thời vàng son của con tôm sú cũng từ đó trôi qua Trong đó phải kể đến các bệnh do virus và vi khuẩn gây ra, nó đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn định và lợi nhuận của nền công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới (van Hulten et al., 2001) Hiện nay, người ta biết được có trên 20 loại virus là tác nhân gây bệnh ở tôm

(Walker et al., 2009), hầu hết các loại virus này là thành viên của các họ Pavorividae,

Baculoviridae, Picornaviridae, Togaviridae và một số họ khác Phổ biến nhất hiện

nay phải kể đến virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV),

Baculovirus (MBV) và IHHNV (virus nhiễm dưới vỏ gây hoại tử cơ quan tạo máu)

Trong số đó thì virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là tác nhân gây ra thiệt hại nghiêm trọng nhất (Rosenberry, 2004 ),…

Một số nghiên cứu đã cho thấy các chủng WSSV ở các vị trí địa lý khác nhau có

sự khác biệt về bộ gen (Nadala and Loh, 1998; Lo et al., 1999; Wang et al., 2000; Marks et al., 2004; Dieu et al., 2004), và một chủng WSSV khi chuyển qua kí chủ khác cũng thay đổi một số kiểu gen (Dieu et al., 2004) WSSV có thể tồn tại trên nhiều

kí chủ khác nhau như cua, tép tạp và một số loài giáp xác khác (Lo et al., 1996a; Wang

et al., 1998) và theo các ký chủ này lây lan từ ao này sang ao khác, vùng này sang vùng khác,… rất khó kiểm soát gây bùng phát dịch trên diện rộng Do đó vấn đề cấp thiết đặt ra là cần phải tìm hiểu thông tin di truyền của virus đốm trắng trên các ký chủ

khác nhau để từ đó hiểu được mối liên hệ di truyền giữa chúng hầu làm tiền đề định hướng cho các phương pháp ngăn ngừa sự lan truyền virus Vì vậy đề tài “ đa dạng di truyền của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) trên tôm bạc

(Fenneropenaeus merguiensis), tép trấu (Macrobrachium lanchesteri) và tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Sử dụng các kỹ thuật SHPT để xác định các dấu phân tử cho thấy sự đa khác biệt

về bộ gen của WSSV trên các mẫu ký chủ thường tồn tại trong ao nuôi tôm khác nhau Góp phần làm sáng tỏ các nguyên nhân đẫn đến dịch bệnh lan rộng trên các ao nuôi nhanh chóng từ đó định hướng nghiên cứu cho các phương pháp khống chế, ngăn ngừa

sự phát dịch, làm giảm rủi ro trong sản xuất, làm tăng giá trị kinh tế con tôm, mang lại lợi nhuận nhiều hơn cho người nuôi

Tìm ra dấu phân tử thích hợp để khảo sát sự khác biệt di truyền của các chủng WSSV trên các ký chủ khác nhau

Nội dung đề tài

Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích các mẫu ADN chiết tách từ tôm sú, tép trấu

và tôm bạc thu được ngẫu nhiên trong các ao tôm đang phát triển hoặc các ao bị nhiễm WSSV

Sử dụng các dấu phân tử mang các đơn vị trình tự lặp lại thuộc các vùng biến đổi chính trên bộ gen WSSV để khảo sát sự đa dạng di truyền của WSSV trên các ký chủ này

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược tình hình nuôi tôm và bệnh tôm ở nước ta

2.1.1 Diện tích và sản lượng tôm nuôi

Hiện nay, Việt Nam là một trong những nước có nghành nuôi trồng thủy sản phát triển trên thế giới Theo thống kê của Bộ thủy sản năm 1999, tổng diện tích nuôi tôm

sú ở miền Bắc là 39.429 ha, ở miền Trung là 12.530 ha và ở miền Nam là 238.279 ha trong đó Cà Mau và Bạc Liêu có diện tích nuôi lớn nhất cả nước Diện tích thả nuôi ngày càng tăng nhanh thể hiện trong năm 2001 và 2003 ở các vùng khác nhau trong cả nước như sau:

Bảng 1 Diện tích các vùng nuôi tôm năm 2001 và 2003

Đồng bằng sông Hồng Bắc trung bộ

Duyên hải nam trung bộ Đông nam bộ

Đồng bằng sông Cửu Long

12.421,7 8.879.9 13.312,6 7.165,5 429.927,2

15.171 12.081 13.477,6 10.363 518.557 (Nguồn: Bộ thủy sản, 2005 http://www.fistenet.gov.vn , ngày 22/05/2009)

Tính đến năm 2006, đồng bằng sông Cửu Long (ĐSCL) có hơn 600.000 ha đất nuôi trồng thủy sản trong đó có hơn 450.000 ha đất nuôi tôm sú Tỉnh Cà Mau hiện có gần 250.000 ha nuôi tôm sú Trong khi đó, diện tích nuôi tôm của tỉnh Bạc Liêu là 120.000 ha trong đó việc bố trí nuôi công nghiệp là 11.000 ha, bố trí nuôi tôm lúa là 22.000 ha, dự kiến sẽ nâng lên 30.000 ha (http://vovnews.vn/, ngày 12/03/2009)

Sản lượng tôm nuôi cũng tăng theo diện tích nuôi Năm 2001, sản lượng tôm toàn quốc là 154.911 tấn, năm 2003 tăng lên 237.880 tấn Riêng ở vùng ĐBSCL có sự tăng trưởng đáng kể nhất với sản lượng năm 2001 là 118.432,4 tấn tăng lên 182.221 tấn vào năm 2003 (Bộ thủy sản, 2006, www.fistenet.gov.vn, ngày 22/05/2009) Và ở hầu hết các nơi thì tôm đều được nuôi đưới nhiều hình thức khác nhau như thâm canh, bán thâm canh, nuôi tôm luân canh trồng lúa, nuôi quảng canh cải tiến,… và nổi bật nhất là mô hình nuôi công nghiệp và bán công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế rất cao

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm sú

Cùng với mức độ thâm canh và sự mở rộng diện tích nuôi tăng lên tràn lan thiếu kiểm soát thì dịch bệnh cũng theo đà đó gia tăng Ngay từ đầu những năm 90, với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, dịch bệnh trên tôm ở Việt Nam cũng bắt đầu xuất hiện và lây lan nhanh chóng Theo thống kê của bộ Thủy sản năm 1995 thì từ năm 1993-1995, dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc làm thiệt hại số tiền lên đến hàng ngàn tỉ đồng Trong năm 1994 tổng diện tích có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn với tổng trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến nay, dịch bệnh vẫn còn tồn tại và tiếp tục lây lan trên diện tích ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi tôm Ước tính đến 06/2006, cả nước có khoảng 100.000

ha diện tích tôm nuôi bị thiệt hại, tập trung nhiều nhất ở các tỉnh như Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng,… Bộ Thủy Sản cho biết tình hình nuôi tôm trên cả nước vẫn diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là tình trạng tôm chết xảy ra phổ

biến ở các vùng nuôi tôm thâm canh và công nghiệp (www.thitruong.vnn.vn, ngày

22/05/2009)

Năm 2003, cả nước có 546.757 ha tôm nuôi nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích ao nuôi tôm bệnh và chết là 30.083 ha, tập trung nhiều ở các tỉnh ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha tôm chết nhiều, chiếm tỉ lệ 97,06% diện tích tôm chết cả nước Trong năm 2003-2004 tỉnh Cà Mau có tỉ lệ diện tích bị bệnh trên 50%, và tập trung nhiều ở các mô hình nuôi với mật độ cao như công nghiệp, bán công nghiệp, thâm canh,… và ở từng khu vực khác nhau trong tỉnh thi tỉ lệ thiệt hại cũng khác nhau Tương tự ở tỉnh Trà Vinh tính đến tháng 03/2006 toàn huyện Duyên Hải có 8.250 ha thả nuôi (chiếm trên 50% số hộ của huyện năm 2006) với trên 452 triệu con giống trên diện tích gần 11.050 ha Trong đó đã có 1.910 hộ thả tôm bị chết dưới 45 ngày tuổi với số lượng khoảng 100 triệu con trên diện tích khoảng 1.350 ha Toàn tỉnh

bị gần như mất trắng (Trần Vũ và Trần Phương, 2006)

Vào năm 2008, mùa tôm mới của ĐBSCL đã bước vào hơn hai tháng, vậy mà tình trạng tôm sú chết hàng loạt đã diễn ra gay gắt, trên khoảng 100.000 ha, trong đó hơn 85% là diện tích luân canh lúa - tôm sú kết hợp Tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, mức độ thiệt hại từ 20%-90%, cá biệt có nhiều vùng tôm ở Kiên Giang mức thiệt hại đến 100% diện tích Tại các tỉnh Trà Vinh, trong 1,8 tỷ con tôm sú giống thả nuôi trên diện tích 22.620 ha có 11.280 ha bị thiệt hại, số

tôm bị chết hơn 818 triệu con, chiếm gần 50% diện tích thả nuôi Tôm chết do bệnh đốm trắng, đỏ thân,… nên nông dân thu hoạch non ở giai đoạn 30 đến 60 ngày tuổi Thiệt hại nặng nhất trong cơn dịch bệnh này là các huyện Duyên Hải, Cầu Ngang và Châu Thành.Theo các nhà khoa học, tôm chết phần nhiều do chất lượng con giống kém, bị nhiễm virus MBV (tôm không có sức đề kháng, chậm lớn), có đốm trắng, đỏ thân, Ngoài ra, còn có yếu tố thời tiết và môi trường

( http://tintuc.timnhanh.com/xa_hoi/, ngày 22/05/2009)

Tóm lại trên hầu hết các diện tích bị thiệt hại trên thì nguyên nhân chủ yếu phải

kể đến là các bệnh do virus gây nên Nhất là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng,… Bệnh lây lan nhanh chóng và gây tổn thất nặng nề đến thu nhập của người nuôi tôm Bệnh có thể lây lan qua nhiều đường khác nhau như nguồn giống, từ mẹ sang con, qua nguồn nước hay thông qua các kí chủ mang mầm bệnh Chính vì vậy gây nên tâm lý hoang mang cho người nuôi cũng như đặt vấn đề lớn cho các nhà quản

lý và nghiên cứu

2.2 Sơ lƣợc về các ký chủ trung gian

Trong các ao tôm nuôi thường có tồn tại nhiều ký chủ khác nhau như: còng

(Geocarcinus ruricola), ghẹ xanh (Portunus pelagicus); tép trấu (Macrobrachidium

lanchesteri); tép bạc (Fenneropenaeus merguiensis), Các ký chủ này cùng thuộc lớp

giáp sát, cư trú trong ao tôm và dễ bị nhiễm WSSV Nhưng khác với tôm sú, các đối tượng này thường không bị ảnh hưởng nhiều khi bị nhiễm WSSV, vì vậy đây là các bộ máy trung gian chứa và lan truyền virus (Lo et al., 1996a.; Wang et al., 1998) Hơn nữa các ký chủ trung gian này luôn di chuyển và mang WSSV từ các vùng bị nhiễm đến nơi không bị nhiễm, chúng chẳng những là mối đe dọa lớn cho các vùng nuôi tôm

mà còn có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh thái biển trên toàn thể giới (Flegel, 1997)

2.3 Bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD) là bệnh trên đối tượng tôm he

(penaeid) gây ra do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome virus

-WSSV) hiện là một trong những vấn đề lớn và gây nhiều khó khăn cũng như thiệt hại cho nghành nuôi tôm (Rosenberry, 2004) Khi tôm bị nhiễm và phát bệnh thường gây nên hiện tượng chết đồng loạt với tỉ lệ lên tới 100% trong vòng 3- 10 ngày (Lightner, 1996) Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1991 (Nakano et al., 1994), rồi sau đó lan nhanh đến Đài Loan, hầu hết các nước nuôi tôm ở Châu Á vào

năm và một số tiểu bang của Mĩ vào năm 1995 (Rosenberry, 1996) Năm 1999 dịch bệnh bùng phát trên những khu vực nuôi tôm ở Nam Mỹ (Rosenberry, 2000) Đến năm

2002 WSSV đã được tìm thấy ở các nước châu Âu và các nước Trung Đông (Rosenberry, 2002) Như vậy từ khi có phát hiện đầu tiên về WSSV thì trong vòng 11 năm virus này đã lây lan nhanh chóng khắp thế giới

2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý

- Tôm yếu, ăn giảm

- Bơi lên mặt nước hoặc vào bờ

- Bơi không định hướng

- Xuất hiện nhiều đốm trắng (đường kính cỡ 2-3mm) ở vùng mang (khu vực đầu)

và vùng thân (đốt cuối thân)

- Đôi khi toàn thân có màu đỏ

- Tôm chết khá nhiều trong khoảng thời gian 5-7 ngày

- Trước khi xuất hiện triệu chứng 2-3 ngày, tôm ăn nhiều một cách không bình thường

- Tôm vào vó nhiều so với bình thường

2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV)

a Phân loại

WSSV (White Spot Syndrome Virus) là một trong những virus gây dịch bệnh

trên toàn cầu ở tôm (penaeid) Virus này được gặp ở hầu như bất cứ nơi nào có nuôi

tôm (Mark, 2005) Vị trí của WSSV trong hệ thống phân loại được xác định bằng cách

sử dụng phép phân tích sự phát sinh loài dựa trên các gene đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép và cấu trúc của WSSV, bao gồm các tiểu đơn vị lớn và nhỏ của

ribonucleotide reductase (van Hulten et al., 2000b), protein kinase (Liu et al., 2001),

endonuclease (Witteveldt et al., 2001), chimeric thymidine-thymidylate kinase (Tsai et

al, 2000b) và ADN polymerase (van Hulten et al, 2001a) ADN polymerase của các họ virus khác nhau được dùng để xây dựng cây không rễ (hình 1) biểu hiện mối quan hệ

họ hàng (Tidona and Darai, 2000) Không có mối quan hệ gần nào giữa WSSV với các thành viên của họ ADN virus (van Hulten et al, 2001a) Cùng với các dữ liệu về phân loại học của gene các WSSV, cây hình thái này đã cho thấy sự khác biệt của WSSV so với các loại virus khác

Hình 1 Phân tích bootstrap (100 bản sao) của cây phát sinh loài không rễ của protein ADN polymerase tạo nên bởi thuật toán phân tích PAUP Đường đậm chỉ sự giống nhau đến trên 70% (giá trị bootstrap >70) (van Hulten et al., 2001a)

Các gene ADN polymerase được dùng và lượng thêm vào của chúng: EHV1: Equine herpesviRUs 1 (NP_041039), HHV1: Human herpesviRUs 1 (NP_044632), CIV: Chilo iridescent

viRUs (AAD48150), SAV: Spodoptera frugiperda ascoviRUs 1 (CAC19170), ASFV: African swine fever viRUs (NP_042783), PbCl: Paramecium bursaria Chlorella viRUs 1 (NP_048532), Bov: Bos

tauRUs (P28339), Hs: Homo sapiens (S35455), CuniNPV: Culex nigripalpus nucleopolyhedro

baculoviRUs (AF274291), XcGV: Xestia c-nigrum granulo baculoviRUs (NP_059280), PxGV:

Plutella xylostella GV (NP_068312), SeMNPV: Spodoptera exigua multiple NPV (NP_037853),

AcMNPV: Autographa californica MNPV (NP_054095), MsEPV: Melanoplus sanguinipes

enTômopoxviRUs (NP_048107), VACV: Vaccinia viRUs (NP_063712), FPV: Fowlpox viRUs (NP_039057)

Dựa trên những phân tích phân loại học mở rộng, cùng với cấu trúc bộ gene cơ bản và thành phần cũng như đặc điểm hình thái khác biệt của virion, năm 2002, “Hội Đồng Quốc Tế về Phân Loại học của Virus” (the International Committee on Taxonomy for Viruses–ICTV) đã phê chuẩn đề xuất ý kiến xem xét WSSV như một

họ virus mới gọi là Nimaviridae, để chỉ phần mở rộng dạng sợi trên phần tử virus

(Nima: tiếng Latin nghĩa là sợi) (hình 2) Họ virus này chỉ có một giống (Whispovirus)

và trong đó White spot syndrome virus I (WSSV) là loài duy nhất Có lẽ tất cả các chủng WSSV đã biết là các biến thể của cùng một loài (Mark, 2005)

Hình 2 Mô hình virion của WSSV (Mark, 2005)

Các chủng địa lý WSSV đã nhận biết rất giống nhau về hình thái học và bộ gene, cho thấy rất ít khác biệt qua phân tích RFLP Việc so sánh trình tự cả bộ gene của những chủng WSSV có nguồn gốc từ Thái Lan (WSSV-TH) >< chủng WSSV có nguồn gốc từ Trung Quốc (WSSV-CN) >< chủng WSSV có nguồn gốc từ Đài Loan (WSSV-TW) cho thấy sự giống nhau về nucleotide đến 99.32% (Mark, 2005)

b Bộ gen của WSSV

Virion của WSSV chứa một ADN sợi đôi, siêu xoắn, dạng vòng, ước tính khoảng

300 kilobase pairs (kb) Một số sự đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn giữa các chủng WSSV khác nhau về địa lý đã chỉ ra một số biến đổi trong bộ gene (Wang et al, 2000b)

Bộ gene WSSV-TH là bộ gene đầu tiên được xác định trình tự một cách hoàn

chỉnh và gồm khoảng 292,967 cặp base (bp) (van Hulten et al., 2001a) Những phân

tích với sự giúp đỡ của máy tính về bộ gene WSSV-TH đã nhận biết 184 ORF được cho là mã hóa cho những protein có trên 50 acid amin, những protein này có kích thước từ 50 đến 6077 acid amin Trong số những ORF này, có 10 họ gene chứa 2 đến

4 ORF có sự tương tự về các base đến 40% hay hơn, đã nhận biết được Dựa trên sự tương đồng với những gene khác trong GenBank, chỉ 10 trong số 184 WSSV ORF là đảm nhận một chức năng nào đó Đa số các gene được biết này mã hóa cho các enzyme liên quan đến sự sao chép ADN, biến dưỡng nucleotide và biến đổi protein Bên cạnh những ORF này, các gene mã hóa cho 6 protein cấu trúc chủ yếu (VP664, VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15) và khoảng 40 protein cấu trúc thứ yếu của virion

được nhận biết trong bộ gene của WSSV (van Hulten et al., 2000a) Gần đây, ORF170 được chứng minh là mã hóa protein kháng sự chết theo chương trình (Wang et al.,

Chuyên nghành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2004) Tuy nhiên, chức năng của hầu hết các ORF của WSSV vẫn chưa được xác định (Mark, 2005)

c Các vùng gen biến đổi chính trên bộ gen WSSV

Bốn trong số 9 vùng tương đồng (homologous repeats- hr) cho thấy sự khác biệt

ở số lần lặp lại giữa WSSV-TH, WSSV-CN và WSSV-TW Khi được so sánh với WSSV-CN và WSSV-TW, WSSV-TH có một đơn vị lặp lại ở hr1 và hr8, và thêm 2 đơn vị lặp lại nữa ở hr3, trong khi WSSV-CN có thêm một đơn vị lặp lại ở hr9 so với 2 chủng kia Các biến thể của WSSV, cũng như baculovirus và ascovirus, có sự khác biệt về số đơn vị lặp lại trong vùng tương đồng (Bigot et al., 2000), đây có lẽ là nét đặc biệt phổ biến ở các virus sợi đôi ADN vòng kín lớn

Bảng 1 So sánh các đơn vị lặp lại của các ORF mang các lặp lại có định hướng, thuộc vùng không tương đồng giữa ba chủng WSSV

So sánh WSSV-CN với WSSV-TH nhận thấy 16 khác biệt có kích thước từ 3 đến

324 bp, chỉ được nhận biết tại các trình tự lặp lại trực tiếp, từ đó chỉ ra rằng những vùng này dễ bị đột biến nhất trong bộ gene của WSSV Chỉ một vùng lặp lại trực tiếp

có thể biến đổi là hiện diện ở vùng giữa hai gene trong khi tất cả những vùng khác

Vị trí trong bộ gene

(WSSV-TH)

Chiều dài đơn vị lặp lại (bp)

Số đơn vị lặp lại (chiều dài đơn vị)

hiện diện trong các ORF 6 trong số 16 khác biệt được nhận biết trong những lặp lại không trực tiếp không phải vùng tương đồng Những đơn vị lặp lại này là những trình

tự 100 bp hiện diện ít nhất hai bản sao trên cùng một sợi và theo một hướng duy nhất, với tính đồng nhất giữa những bản sao này đến 80% hay hơn (Mark, 2005) 10 lặp lại không thuộc vùng không tương đồng theo một hướng duy nhất, tất cả đều là lặp lại liên tiếp, hiện diện trong bộ gene của WSSV-TH, ít nhất một lặp lại hiện diện trong WSSV-TW mà không hiện diện ở WSSV-CN và WSSV-TH Trong 10 ORF có chứa các đoạn lặp lại theo một hướng thuộc vùng không tương đồng hiện diện trong bộ gene của WSSV-TH (bảng 2) thì 6 ORF có chứa sự khác biệt giữa 3 chủng (in đậm trong bảng 2) Trong 6 ORF đó thì 5 lại có sự khác biệt về số đơn vị lặp lại trong những lặp lại này (gạch dưới trong bảng 2) 3 sự thay đổi lớn nhất định vị trong vùng bộ gene mã hóa cho ORF75, ORF94 và ORF125 (Mark, 2005)

Ba vùng gen mang các đơn vị lặp lại liên tục, không tương đồng, trong vùng mã hóa ORF75, ORF94 và ORF125, được chứng minh là có thể biến đổi ở số đơn vị lặp lại (RUs) giữa các chủng WSSV đã nhận biết (Mark et al., 2004) Các lặp lại có vị trí ở giữa của các ORF, mà không có lặp lại ở đầu 5’ và 3’ Cả ORF75 và ORF94, khoảng 50% vùng mã hóa có chứa các lặp lại, trong khi ORF125, khoảng 20% vùng mã hóa chứa các lặp lại Sự khác biệt ở số RUs không gây thay đổi các ORF tương ứng, vì chiều dài của những RU này luôn là đa phân của 3 bp Protein mã hóa bởi ORF75 được trình bày hiện diện trong virion WSSV (Huang et al., 2002b) ORF94 có thể có chức năng tương tự như ORF75, vì đơn vị lặp lại của cả hai ORF cùng đóng góp một kiểu chung ở cấp độ protein bao gồm 4 amino acid cơ bản (R hay K) theo sau bởi 2 alanine, 2 hay 3 proline và sự kéo dài của các amino acid có tính acid (E hay D) (Mark, 2005)

a ORF75

Với tất cả các chủng được mô tả rõ, ORF75 có hai loại RUs với chiều dài lần lượt là 102 bp và 45 bp 45 nucleotide đầu tiên của RUs 102 bp giống với RUs của 45

bp So sánh tất cả các RUs trong một chủng, chúng có chứa SNP ở vị trí 3, 15, 30, 40,

42 và 44, RUs của 102 bp có thêm SNP ở vị trí 83 Mỗi RUs có thể được nhận biết bởi SNP đặc trưng của nó (Mark et al., 2004)

Số RUs được nhận biết ở mỗi chủng phù hợp với kích thước tương ứng của các đoạn PCR của chúng Chủng K, T, L và X ở VN giống nhau ở điểm này Chủng A ở

VN có thêm 1 RUs 45 bp, mà dựa trên các SNP, được xác định nằm sau đơn vị lặp lại thứ hai Chủng S ở VN có số RUs cao hơn và, dựa trên các SNP, giống với genotype của WSSV -CN hơn (Dieu et al., 2004)

Bảng 2 Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu của Dieu et al., 2004

TW, WSSV-CN, WSSV-TH, và 55 chủng khác từ Thái Lan Số RUs thay đổi từ 6 đến

20 đơn vị lặp lại (Mark et al., 2004)

Các chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Việt Nam central) chứa từ 7 đến 17 RUs, phù hợp với kích thước các sản phẩm PCR tương ứng của chủng Chủng X và S giống nhau, trong khi các chủng khác, mặc dù có cùng số RUs, tất cả đều có mô hình khác biệt về nucleotide tại vị trí 48 Chủng K, T và L ở VN

(WSSV–VN-có sự mất 1 thymine tại vị trí 143149 (cùng vị trí với WSSV-TH), tại đầu 3’ cùng (WSSV–VN-có

sự lặp lại Vì nó nằm ngoài vùng mã hóa nên sẽ không gây thay đổi ORF94 (Dieu et al., 2004)

c ORF125

ORF này chứa các RUs liền kế dài 69bp, với hai RUs đầu tiên cũng như cuối cùng có thể nhận biết bằng các SNP đặc trưng của chúng khi so sánh các RUs trong một chủng Những RUs khác (từ RUs thứ ba đến RUs áp chót) có SNP ở vị trí 8, 18,

25, 66 và 69 Các chủng WSSV–VN-central chứa 5 đến 7 RUs, phù hợp với kích thước tương ứng với các đoạn PCR của chúng Chủng X và S ở VN (Việt Nam), cũng

như chủng A và L ở VN, giống nhau ở locus này Genotype của chủng A và L ở VN thì giống với genotype của WSSV-TH (Dieu et al., 2004)

2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, tép trấu và tôm bạc

Balakrishnan Pradeep et al (2008) đã miêu tả sự biến đổi của ở các vùng gen của WSSV ở Ấn Độ Đề tài tập trung nghiên cứu các biến đổi ở ORF23/24 và ORF14/15 trên 81 chủng WSSV thu được ở Ấn Độ Dựa trên phản ứng khuyếch đại PCR, kết quả cho thấy các chủng Ấn Độ bị xóa mất một đoạn 10.970 bp ở ORF23/24 cho thấy có liên quan đến chủng WSSV-TW và WSSV-TH đã được giải trình tự trước đó Khi phân tích ở vùng ORF14/15 cho thấy có sự tái kết hợp, đồng thời không có chủng nào

có sự chuyển đổi hoặc VP35 giống chủng WSSV-TW Từ đó rút ra kết luận các chủng WSSV ở Ấn Độ có liên quan chặt chẽ với các chủng đến từ Thái Lan, hay nói cách khác chủng WSSV-TH có sự lây lan rộng đến nhiều nơi trên thế giới trong đó bao gồm

Hoa et al (2005) đã thiết lập và sử dụng qui trình PCR - genotyping để kiểm tra

sự khác nhau của các chủng WSSV phân lập từ tôm và các loài giáp xác khác thu ở các khu vực khác nhau của ĐBSCL Kết quả này cho thấy rằng qui trình PCR - genotyping có thể giúp xác định được những chủng WSSV đặc trưng và có thể giúp truy ra nguồn gốc lây nhiễm, dịch bệnh bộc phát

Rajendran et al (1999) thử nghiệm về cảm nhiễm của WSSV trên các đối tượng

khác như cua (Scylla sp.), tôm hùm (Panulirus sp.), tôm nước ngọt (Macrobrachium

Rosenbergii) ở Ấn Độ bắng cách tiêm hoặc cho ăn WSSV có từ các mẫu tôm sú nhiễm

WSSV thu từ phía đông nam bở biển Ấn Độ Sau đó tiến hành theo dõi và xét nghiệm,

kết quả tất cả các đối tượng được cảm nhiễm đều có mang WSSV nhưng có sự khác biệt về mức độ biểu hiện bệnh và tỉ lệ chết khác nhau

Tóm lại, qua nhiều nghiên cứu khác nhau về sự biến đổi kiểu gen ở một số vùng nhất định thể hiện sự đa dạng di truyền của WSSV có sự phụ thuộc vào vị trí địa lý và mức độ độc tính trên đối tượng tôm sú đã gợi mở thêm nhiều khía cạnh mới có liên quan Trong đó vấn đề nguồn gốc lây nhiễm của WSSV và sự đa dạng hay sự biến đổi

về kiểu gen của WSSV trên các ký chủ khác nhau được đặt ra Do đó vấn đề tìm ra sự

đa dạng di truyền của các chủng WSSV trên các ký chủ khác nhau, làm cơ sở so sánh với vật chủ về kiểu gen, mức độ độc lực, nhằm tìm ra định hướng khống chế sự lây lan và ngăn chặn sự tái nhiễm của WSSV giữa các vụ nuôi, cũng như các biện pháp để hạn chế ảnh hưởng của WSSV lên đối tượng nuôi chính là tôm sú

2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật in vitro để tổng hợp ADN dựa trên khuôn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm

1985

2.5.1 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba bước:

Bước1 (bước biến tính-denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm

các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 – 950C trong vòng 30 – 60 giây Mạch đôi ADN tách ra thành dạng mạch đơn

Bước2 (bước lai- anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước3 (bước tổng hợp - elongation): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp ADN polymerase (là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút