ứng dụng pcr đa mồi đặc hiệu này xác định mức độ methyl hóa 3 promoter điều hòa biểu lộ gen ebna1 của ebv trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô khôngbiệt hóa và duy trìcác thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quantrọng là EBNA1, LMP1 và LMP2.. E

EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô khôngbiệt hóa và duy trìcác thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quantrọng là EBNA1, LMP1 và LMP2 EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bàochủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫntruyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinhung thư cho các tế bào bị nhiễm Các gen này nằm cách xa nhau trong bộ gen EBV

và được biểu lộ bởi sự hoạt hóa các promoter khác nhau EBNA1 được biểu lộ ở cácthể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: Cp, Wp và Qp Tuy nhiên, trongung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điềuhòa biểu lộ gen EBNA1

Methyl hóa ADN vùng promoter là một trong các yếu tố ngoại di truyền có vaitrò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ genMức độ methyl hóa diễn ra ở các vị trícủa đảo CpG tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thểlàm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn đượcbiểu lộ Việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter của một gen có ý nghĩaquan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đótrong nhiều quá trình bệnh lý ác tính , đồng thời dấu ấn này cũng có thể góp phầntrong chẩn đoán sớm các bệnh ung thư Ngoài ra, khi dùng các chất hóa học để làmmất methyl hóa thì có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng củachúng, giúp cho việc điều trị những rối loạn hay các bệnh lý khác nhau

2Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định đượcmức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen Các kỹ thuật này dựavào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có những kỹthuật đơn giản và thông dụng Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóasau khi xử lýADN bằng phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa cácpromoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR

đa mồi đối với các promoter đó Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóakhông chỉ giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của EBV mà cònrất nhiều gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt là các gen ức chế ung thư

Đề tài này nhằm mục đích sau:

1 Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ methyl hóa ở các promoter Wp, Cp và Qp của EBV ở các tế bào dòng B95-8, Namalwa

và Raji.

2 Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu này xác định mức độ methyl hóa 3 promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 của EBV trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng.

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu mônằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại bệnh đứng hàng đầu trong số các ungthư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên quan tới địa lý[3]

Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau: Khuvực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ

30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹchỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm [4] Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưngngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam

Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5 trong cácung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt cổ [1]

1.2 Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH

1.2.1 Vai trò của virut Epstein-Barr

Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được nghiên

cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH Người ta pháthiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu môkhông biệt hóa (UCNT) Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 vàLMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thươngquá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điềunày phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong

cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [5]

Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng, người

ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân.Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn 8 - 10lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàngĐặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi,thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam có giá trị để theo dõi vàphát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng

4theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao [6,7] Người ta cho rằng sự tái hoạthóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triểncủa UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA

1.2.2 Môi trường sống và thói quen sinh hoạt

Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễmliên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống Nhiềunghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ýkiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) lànguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muốingay từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5lần [8] Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóaEBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyểndạng do EBV [9] Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde cógiá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng

1.2.3 Yếu tố di truyền

Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắc thấphơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ mắc chuẩn vẫncao hơn dân số nói chung Điều đó cho thấy rằng yếu tố di truyền có vai trò trongbệnh sinh của UTVMH Nghiên cứu ở Trung quốc chỉ ra rằng UTVMH có mối liênquan đến HLA-A2, B14 và B46[10] Ở Việt Nam, các kháng nguyên A11, A2, B17

và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 có liên quan đến UTVMH [2] Việc xácđịnh các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu: CYP2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 Cơ chế tác động củachúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang đượckhẳng định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố là môitrường sống, EBV và HLA

1.3 Virut Epstein-Barr

1.3.1 Sinh học của EBV

Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nó tồntại lâu dài trong cơ thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ở

5lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng Ngoài ra,EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của mẹ truyềnsang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục EBV nhân lên trong tế bào biểu

mô tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho Bqua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạngvòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào Tuy nhiên, EBV cũngtích hợp vào ADN của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nótích hợp vào nhiễm sắc thể ở vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBVbiểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bàolympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch Khi ở thể dunggiải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào lymphokhác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên EBV trong cơ thể

Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằngvirut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp cậngiữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV Tế bào B đi vào chu trình dunggiải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới chocác tế bào khác trên một diện rộng Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu môbởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao Ngoài ra,phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu

mô Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởicác tế bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (NaturalKiller cell)

1.3.2 Cấu trúc của EBV

EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng

172-kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tửDNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TR (terminal repeat) của nó (hình 1A).Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạngen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình1B) Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu cho từngđoạn (A, B …), khung đọc mở trái hoặc phải và tiếp theo là thứ tự (0,1,2,3…) ví dụ

6như BARF0 và BARF1 Toàn bộ bộ gen EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình

tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555

Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử proteinlớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được sảnxuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn Reddy, Raslan, Gooneratne, Kathuria and Marks[2]

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc của EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị các vùng promoter và các

gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen, LMP1

và2: Latent Membrane Protein B) EBV ở dạng thẳng gồm các đoạn gen được tạo ra sau khi xử lý

với enzym giới hạn BamH1 và vị trí các gen của thể tiềm ẩn

1.3.3 Thể tiềm ẩn của EBV

Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt độngtrong tế bào bị nhiễm Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong sốnày được dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên nhân(EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protenin màng tiềm ẩn(Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A và 2B; 2 loại RNA không mã hóa protein(EBV Early RNA): EBER1 và2 Có bốn thể tiềm ẩn được phân loại dựa trên sự biểu lộgen của virut,được liệt kê ở bảng dướiđây

BamHI

B

A

A

Bảng 1: Các thể tiềm ẩn của EBV

Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường và các bệnh liên quan

UTVMH, U lympho Hodgkin,

U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt

III EBER1&2

EBNA1- 6LMP1LMP2A & B

U lympho sau ghép tạng U lympho ở bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn,LCL

1.3.4 Các gen EBV của thể tiềm ẩn

1.3.4.1 EBNA1

Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng

66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin Kích thước này được thay đổi ở các chủngkhác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) Hennessy andKieff Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng

cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin,vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ axit amin 459-641Ambinder, Mullen, Chang, Hayward and Hayward (Hình 2)

Hình 2 Cấu trúc của EBNA1

Basic Gly-Ala repeats Basic DNA-binding

EBNA1 là protein biểu lộ hầu như tất cả các tế bào nhiễm EBVAndersson-Anvret, Klein, Forsby and Henle và nó đóng một vai trò quantrọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân tế bào chủ,cũng như chức năng phiên mã của virut Yates JL Vùng gắn ADN của proteinEBNA1 tương tác với hai khu vực nằm ở vùng oriP của promoter Cp, baogồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleotid

có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng có hai

vị trí gắn sau promoter của Qp

Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp vàkhi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA Các gen này đượcbiểu lộ dưới sự kiểm soát của promoter Cp hay Wp EBNA1 cũng có thể liênkết với các intron đầu tiên xuôi chiều của promoter Qp làm tự điều hòa biểu

lộ protein EBNA1 Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Cp và Wpkhông hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp Cp và Wpkhông hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN Robertson,Hayward, Ling, Samid and Ambinder

1.3.4.2 EBNA2

Protein EBNA2 có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tựgen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A vàEBNA2B, cũng là dấu ấn quan trọng để xếp loại EBV typ I và typ II Aitken,Sengupta, Aedes, Moss and Sculley Các protein EBNA2A và EBNA2Bchứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứng và giống nhau về trình tựkhoảng 57% EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu lộ

ở các tế bào lympho B bị nhiễm EBV, nó xuất hiện khoảng 24-48 giờ sau khi

nhiễm EBV trong nuôi cấy tế bào in vitro Murray and Young Protein này là

một chất kích hoạt phiên mã một số gen của virut và tế bào bao gồm cả nhữnggen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc, và là cần thiết cho sự bất tử của tế

bào B trong in vitro EBNA2 không gắn trực tiếp với ADN, nhưng tác động

thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1 các protein khác của tếbào

1.3.4.3 Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C)

Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ởgiữa bộ gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử

từ 140-180 kDa Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ I và

II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng Các protein nàyhoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các proteinRBP-JK Robertson ES

1.3.4.4 EBNA-LP

Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ

20-130 kDa, là kết quả của hoạt động promoter Wp Cùng với EBNA2,

EBNA-LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bàolympho B in vitro

1 3.4.5 LMP1

Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủngvirus [104, 105] Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386axit amin và chia thành ba vùng,(i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii)sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và haivòng nội bào(iii) một vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chứcnăng quan trọng Hennessy, Fennewald, Hummel, Cole and Kieff được gọi làvùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194-232) vàCTAR2 ( aa 351-386)

LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lạichết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư

vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm Biểuhiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tếbào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái của một sốdòng tế bào biểu mô , và làm tăng biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng biểu

bì EGFR Miller WE

1.4 Yếu tố ngoại di truyền

Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu lộ gen màkhông liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen Những biến đổingoại di truyền có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác.Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methylhóa ADN, sửa chữa histon và nucleosom Các thay đổi này là độc lập vớinhau và methyl hóa xảy ra ở mức độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ởmức độ protein

1.4.1 Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen

Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một gốc CH3 liên kết đồng hóatrị với vị trí cacbon số 5 của Cytosin nằm ở vị trí hai nucleotid Cytosin-Guanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodieste) Khi CpG tập hợp nhiềutrong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì

người ta gọi là đảo CpG Khoảng 10-15% CpG ở động vật có vú nằm ở vùngđảo CpG và nó thường xuất hiện ở vị trí vùng promoter và exon1của khoảng40% các gen của động vật có vú Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN trong quátrình phân bào nhờ các enzym methyltransferase (DNMT) Có 4 loại DNMTđược xác định ở động vật có vú và cả 4 enzym đều chuyển nhóm CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN Trong các mô bình thường các đảo CpGthường không bị methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa ở vùng promoter dẫnđến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu tố điều hòa biểu

lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin, cơ chế này đượcminh họa trong Hình 3 sHai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG methylhóa dẫn đến cơ chế làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin

co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đócủa DNA

Hình 3: Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.

A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện phiên mã trong các tế bào bình thường B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng

promoter

1.4.2 Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1

EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của cácpromoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu

kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạthóa, trong khi các promoter khác không hoạt động Ngược lại, trong thểnhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từngthể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạtđộng, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động Haipromoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thờigian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn.

Hình 4 Các promotor của EBV điểu khiển phiên mã EBNA1.

Việc các promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khácnhau, trong đó có methyl hóa các CpG vùng promoter Ở thể nhiễm tiềm ẩn I

và II, các promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do

Qp như trong trường hợp UTVMH Nghiên cứu về methyl hóa giúp tìm hiều

cơ chế biểu lộ gen, đồng thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho chẩn đoáncũng như điều trị liên quan đến ngoại di truyền vì rối loạn này có thể đượcsửa chữa nhờ những chất hóa học được bổ sung vào tế bàoRobertson,Hayward, Ling, Samid and Ambinder, Miyamoto and Ushijima Chúng tôiphát triển kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa trên mô hình của EBV

trong ung thư vòm mũi họng, đồng thời nó cũng có thể ứng dụng cho nhiềucác gen khác của các bệnh lý khác nhau

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011

- Mẫu được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội

- Các kỹ thuật phân tử được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh và Labo Y sinh , Trường Đại học Y Hà nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu.

2.2.1 Tế bào dòng

Các nguyên liệu tế bào dòng B95-8, Namalwa, và Raji được tài trợ bởi Labo nghiên cứu ung thư vòm mũi họng, MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thụy điển

2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.

- Bệnh nhân mới, được chẩn đoán xác định từ mô sinh thiết lấy từ khối uvòm họng là UTVMH thể không biệt hóa (UCNT)

- Những mô sinh thiết tươi và mô sinh thiết đúc farafin của bệnh nhân đãđược chẩn đoán là UTVMH thể không biệt hóa

2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ.

- Các thể mô bệnh học khác ngoài UCNT

- Bệnh nhân tái phát hoặc đến khám định kỳ