Xây dựng quy trình phát hiện clostridium perfringens trong thực phẩm bằng kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

Ngoài ra cũng cần có các phương pháp xét nghiệm tìm Để đáp ứng các nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh có thể tự động hóa đang từng bước được phát triển và phổ biến rộng nh

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2005

L ỜI CẢM ƠN

hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn này

nhiên Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Tp Hồ Chí

B ẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AOAC : Association of Official Analytical Chemist (Hiệp Hội các nhà hóa học

phân tích nhà nước)

CFU : Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

kDa : Kilo Dalton (1.000 da)

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : 2'- Deoxynucleoside - 5'- triphosphate (nucleotide dùng để tổng hợp

DNA)

ELISA : Enzyme - linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ miễn dịch

ISO : International Standards Organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc tế)

NordVal : Nordic System for Validation of Alternative Biological

PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase)

TAE : Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)

Taq : Thermus aquaticus

2.2.17 Xác định các thông số kĩ thuật tương đối của phương phấp PCR so với

3.2 XÁC NH ẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG

ĐỂ PHÂN TÍCH C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM0 56

3.2.3 Xác định các thông số kĩ thuật tương đối của phương pháp PCR so với

0

3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐE KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C

PERFRINGENS TRÊN MẪU THỰC TẾ0 63

M Ở ĐẦU

lượng dinh dưỡng, cảm quan của thực phẩm mà còn về mức độ an toàn vệ sinh của

năm gần đây lại xảy ra khá nhiều, chủ yếu là các vụ ngộ độc tập thể ở các công ty, xí

độc đến mức thấp nhất Ngoài ra cũng cần có các phương pháp xét nghiệm tìm

Để đáp ứng các nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh có thể tự động hóa đang từng bước được phát triển và phổ biến rộng như: phương pháp phân

phương pháp phát hiện dựa trên kĩ thuật phát quang sinh học [4] Góp phần vào việc

aureus, Shigella trong thực phẩm Hiện nay, chúng tôi tiếp tục hướng nghiên cứu này

được xếp vào hàng thứ ba sau Salmonella spp và Staphylococcus aureus Tại Phần

Các trường hợp ngộ độc do C perfringens gây ra phần lớn có liên quan đến

này

thường dựa trên các phương pháp nuôi cấy vi sinh, sinh hóa truyền thống Các phương pháp này tuy có độ ổn định cao nhưng hạn chế về mặt thời gian, tốn công lao động nên có thể làm tăng chi phí sản xuất, tồn đọng hàng hóa Do những hạn chế đó,

phương pháp mới này vẫn còn một số nhược điểm nhất định, chưa đạt được tất cả các

(Polymerase Chain Reaction) được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm nhất Có

cho đến nay những phương pháp này vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi và chưa được

xem như phương pháp chính thức sử dụng để xét nghiệm C perfringens trong hệ

Do đó, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện C

perfringens trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR nhằm khắc phục hạn chế của phương

bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để đưa phương pháp này trở thành phương pháp

C HƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 NG Ộ ĐỘC THỰC PHẨM

đau nhức người, sốt và đau đầu Những triệu chứng này có thể thay đổi tùy vào tác

1.2 KHÁI QUÁT VỀ GIỐNG CLOSTRIDIUM

1.2.1 Đặc điểm chung [4], [20]

người và động vật Các vi khuẩn này là loài kị khí không bắt buộc, không có

độc thực phẩm nguy hiểm ở người Hai loài liên quan đến ngộ độc thực phẩm là

Clostridium perfringens nhóm A, là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường xuyên

hơn loài C botulinum, là loài ít gây ra những vụ ngộ độc nhưng hậu quả nghiêm

Clostridium thường được phân loại dựa vào hình dạng tế bào, vị trí bào tử và các đặc điểm sinh lí như:

Clostridium thường nhiễm vào các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng như thịt, sữa,

tăng trưởng, vi khuẩn tạo và tiết ra độc tố gây độc cho người Ví dụ, C botulinum gây

chúng thường gây bệnh khi đã có các vi khuẩn khác xâm nhiễm mở đường

1.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

perfringens) trong thức ăn gây đau bụng và tiêu chảy nhẹ cho người

Năm 1892 người ta phát hiện C perfringens gây bệnh hoại thư sinh hơi, viêm

Năm 1933 nghiên cứu của Hobbs cho rằng ăn thực phẩm nhiễm C perfringens

Năm 1948 có nhiều trường hợp tử vong do viêm ruột và dạ dày xảy ra ở Đức

có liên quan đến C perfringens nhóm C

C perfringens

1.3.2 Đặc điểm sinh học

1.3.2.1 Hình thái sinh lí tế bào [1], [2]

C perfringens là trực khuẩn Gram (+), có vỏ, sinh bào tử, không có tiên mao,

kích thước khoảng 0,8 - 1 x 4 - 8µm (Hình 1)

perfringens được xem là vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất trong các loài vi

1.3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy [1]

C perfringens là loài vi khuẩn kị khí nhưng không đòi hỏi điều kiện kị khí

có khả năng phát triển trong môi trường có ít ôxi Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là

ướt Trong môi trường thạch sâu, khuẩn lạc của C perfringens có hình hơi tròn hoặc

1.3.2.3 Đặc điểm sinh hóa [8], [9]

C perfringens có khả năng lên men các loại đường như glucose, lactose, saccharose, làm đông tụ sữa, làm tan gelatin do chúng sản sinh enzym gelatinase, tinh

1.3.2.4 Phân loại [10], [16]

C perfringens có khả năng tiết ra khoảng 20 loại độc tố, trong đó có 4 độc tố

Trong đó, C perfringens nhóm A hiện diện phổ biến nhất trong môi trường và là tác

ATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATGTTAAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACTAGGGAAATCAATATACTATAG

Gen mã hóa độc tố đường ruột (enterotoxin) của C perfringens có thể nằm trên

cho người thì gen tạo độc tố đường ruột nằm trên nhiễm sắc thể, trong khi đó ở các

đường ruột là một protein có 391 axit amin và được hình thành trong quá trình tạo

Bảng 1 Phân loại C Perfringens

1.4 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERFRINGENS

[9]

C perfringens còn có biệt danh là "vi khuẩn quán ăn" vì hầu hết các vụ ngộ độc

độ trở nên thuận lợi, bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng tăng trưởng và tạo ra độc tố gây ngộ độc

Các trường hợp ngộ độc thực phẩm xảy ra đều do C perfringens nhóm A, một vài trường hợp do C perfringens nhóm C gây ra Ngộ độc thực phẩm do C

perfringens nhóm A được gây ra bởi độc tố đường ruột mà vi khuẩn này tiết ra trong

trường hợp bị sốt, buồn nôn hay ói mửa Bệnh thường chấm dứt sau 2-3 ngày và

C perfringens nhóm C gây ra triệu chứng của bệnh ở ruột non như: nôn mửa,

máu Độc tố đường ruột của C perfringens được hoạt hóa nhanh trong ruột gây ra

1.4.2 Độc tố đường ruột của C perfringens [9], [11]

ở ruột non nhờ môi trường pH thuận lợi Độc tố đường ruột được vi khuẩn C

perfringens ti ết ra sau khi bào tử được hình thành 10 - 12 giờ

Về mặt cấu trúc phân tử, CPE là một polypeptid mạch đơn có trọng lượng phân

chia làm 3 vùng (Hình 2):

Sau khi được tạo ra ở ruột non, đầu C của độc tố sẽ gắn vào các thụ thể protein

lượng 70 kDa tạo thành phức hợp lớn kị nước Phức hợp lớn hình thành các cấu trúc

Hình 3 Cơ chế tác động của độc tố đường ruột 1.4.3 Các chỉ tiêu về C perfringens trong thực phẩm [4]

perfringens trong một số mặt hàng thực phẩm là rất thấp và thậm chí không cho phép

2

10

20

* S ản phẩm chế biên từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ:

P

2

* Nhóm nước khoáng và nước giải khát đóng chai:

nước giải khát cồn, nước giải khát không cồn, nước

* Nhóm nước chấm: nguồn gốc động vật (nước

* Nhóm th ức ăn khô và chứa dinh dưỡng cho trẻ

em, th ức ăn thay thế đặc biệt: dùng trực tiếp không

1.5.1 Phương pháp nuôi cấy [4], [8]

Các phương pháp nuôi cấy truyền thống để xét nghiệm C perfringens được xây

như sau:

có màu đen, hình tròn Tuy nhiên, một số chủng Clostrdium khác cũng tạo khuẩn lạc

có đặc điểm tương tự nên cần phải qua bước khẳng định sinh hóa

trường thioglycolate broth, Ủ ở 37°C trong 24 giờ, sau đó tiến hành nhuộm gram và

Chuyển lml dịch nuôi cấy từ môi trường thioglycolate broth sang môi trường

trường

catalase âm tính, lên men lactose sinh axit và hơi, làm tan gelatin

vào môi trường ISA tronqg bước nuôi cấy phân lập để khẳng định C perfringens mà

1.5.2 Phương pháp ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) [18, 19]

Phương pháp ELISA cho phép phát hiện được 5 độc tố quan trọng của C

perfringens là alpha, beta, epsilon, iota và độc tố đường ruột Nguyên tắc của phương

1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7]

Năm 1997, Patrick Fach và Michel R Popoff đã thành công trong việc phát hiện

1.5.4 So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp

Phương pháp truyền thống phát hiện C perfringens trong thực phẩm gặp nhiều

Phương pháp ELISA thường cho kết quả nhanh và độ nhạy cao trong các trường

phương pháp này là đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các

trường hợp cho kết quả âm tính giả Trong phương pháp này, mẫu cần được tăng sinh trong môi trường và điều kiện đặc biệt để chủng hình thành bào tử và tạo độc tố Điều

Trong khi đó, các phương pháp phát hiện C perfringens dựa trên kĩ thuật sinh

đòi hỏi bước tăng sinh để tăng mật độ tế bào của vi khuẩn nhưng phương pháp này

PCR đang được khuyên khích sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện C perfringens

1.6 KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG TH ỰC PHẨM

1.6.1 Nguyên tắc của kĩ thuật PCR [3], [4]

Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một

quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Nhờ

DNA đủ để tạo cặp mồi chuyên biệt Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer)

Hình 4 Các bước của phản ứng PCR

- Bước 1: (biến tính, denaturation): được thực hiện ở nhiệt độ cao để hai mạch

- Bước 2: (lai, anealation): các cặp mồi bắt cặp vào khuôn Trong bước này,

- Bước 3: (tổng hợp, elongation): DNA polymerase xúc tác việc tổng hợp DNA

tăng đến 72°C giúp cho DNA polymerase tổng hợp tốt nhất Thời gian của bước này

6 P

bước sóng 312nm

1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4]

- DNA b ản mẫu

không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần Mặc dù vậy, để đạt được kết quả

- DNA polymerase

Đây là enzym có vai trò trong việc kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn

DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trên thị trường nhưng việc sử dụng loại

polymerase Enzym này được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus và có khả

năng chịu được nhiệt độ cao

Đối với phương pháp PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng Do đó, cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại,

20 - 30 base

vào điều kiện phản ứng chung nhưng nếu sử dụng ở nồng độ cao dễ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh

động cùa enzym

Ion MgP

2+

ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà tự bắt cặp với nhau,

các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới cho phản ứng PCR

1.6.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR trong phát hiện vi sinh vật

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên

đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh làm giàu để có được mật độ vi sinh

1.7 XÁC NH ẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ

phương pháp thay thế và kết quả thu được từ phương pháp tham chiếu cho cùng một

- Phương pháp thay thế (alternative method)

Phương pháp thay thế là phương pháp mới hay phương pháp cải tiến từ phương

đối tượng phân tích

- Phương pháp tham chiếu (reference method)

Phương pháp tham chiếu là phương pháp phân tích hay đo lường được các tổ

Để một phương pháp thay thế trở thành một phương pháp tiêu chuẩn, kết quả

phương pháp để được xem xét, đánh giá Nếu được chấp nhận, phương pháp thay thế

ện nay, nhiều tổ chức có chức năng ban hành phương pháp trên phạm vi quốc tế

như CEN, AFNOR, ISO, AOAC, NordVal Ở Việt Nam, Bộ Khoa học và Công nghệ

là cơ quan có chức năng thẩm định và phê duyệt phương pháp có giá trị trên toàn lãnh

validation)

Bước xác nhận hiệu lực sơ cấp do phòng thí nghiệm đề xuất phương pháp mới

có đầy đủ độ tin cậy và tính năng tương đương hay là có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tham chiếu Thiết lập các giới hạn và các đặc điểm của từng hoạt động

Bước này được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chủ trì

định tính vi sinh vật

- Độ chuyên biệt tương đối (relative selectivity): là khả năng phát hiện các

- Độ chính xác tương đôi (relative accuracy): là thông số đánh giá khả năng

Để tìm được giá trị gần đúng nhất, các kiểm tra phân tích được tiến hành bởi

- Độ lệch dương (positive deviation, PD): phương pháp thay thế có độ lệch

dương khi phương pháp này cho kết quả dương tính mà phương pháp tham chiếu cho

- Độ lệch dương được gọi là thực sự dương (true positive, TP) khi mẫu phân

tích được chứng minh là thực sự dương tính Tỉ lệ dương tính giả bằng tỉ số của kết

là âm tính

- Độ lệch âm (negative deviation, ND): phương pháp thay thế có độ lệch âm

dương tính Độ lệch âm được xem là âm tính giả (false negative, FN) khi mẫu phân tích được chứng minh là thực sự dương tính Độ lệch âm được gọi là thực sự âm (true

gi ả bằng tỉ số của số kết quả âm tính giả thu được từ phương pháp thay thế và số kết

- Gi ới hạn phát hiện tương đối (relative limitation): là mật độ tế bào vi sinh vật

pháp tham chiếu và phương pháp thay thế Xác nhận hiệu lực phương pháp phải

- Độ nhạy tương đối (relative sensitivity): là thông số thể hiện khả năng phát

được tính bằng tỉ số của số kết quả dương tính thu được từ phương pháp thay thế và

- Độ đặc hiệu tương đối (relative specificity): là thông số thể hiện khả năng

- Độ lặp lại (repeatability): độ lặp lại của một phương pháp là mức độ thống

- Độ ổn định (robustness): là mức độ ổn định của kết quả phân tích khi các điều

- Độ khác biệt χP

2

P

(significant difference): là thông số cho biết tính tương đương

2 P

1.7.4 Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực

khách quan về hiệu quả, tính khả thi, độ tin cậy của phương pháp thay thế Bên cạnh

đó, việc xác nhận hiệu lực cũng là bước hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp

C HƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 V ẬT LIỆU

Biotech-FTI-500)

+ Mồi (primer): cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này là PL3, PL7 có kích

thước 24 base và khuếch đại được độ dài đoạn DNA 283 cặp base Trình tự các mồi

PL3, PL7 (từ 5’ - 3’) như sau:

PL3 AAG TTA CCT TTG CTG CAT AAT CCC

PL7 ATA GAT ACT CCA TAT CAT CCT GCT

ở -20°C

Tris; 20mM EDTA

acetic acid trong1000 ml nước

+ Agarose

+ Môi trường ISA (Iron Sulphite Agar): dùng để định lượng mật độ vi khuẩn

hydrolase 10,0g, sodium sulfite 0,5g, iron citrate 0,5g, agar 15,0g, nước cất vừa đủ

121°C trong 15 phút

450g, pepton 20g, glucose 2g, NaCl 5g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH sau khi pha chế

là 7,0±0,2

+ Choped Liver Broth dùng để giữ giống vi khuẩn, có thành phần như sau:

Cách chuẩn bị hai môi trường trên như sau: xay gan (tim) bò hòa vào nước, đun sôi nhẹ trong 1 giờ Lọc qua vải mùng, ép thu lấy phần dịch tim (gan) Các thành

ở 121°c trong 15 phút

+ Fluid Thioglycolate dùng để tăng sinh Clostridium perfringens, có thành

sodium chloride 2,5g, N-cystine 0,5g, sodium thioglycolate 0,5g, resazurin sodium

NaCl 8,5g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH 7,0±0,2 Hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

+ Môi trường Iron-milk Medium dùng để thử nghiệm khả năng lên men sữa

+ Môi trường M40 để thử nghiệm gelatinase gồm: tryptose 15g, cao nấm men

2.1.3 Nguyên vật liệu