PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

KỸ THUẬT DI TRUYỀN PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Thị MCác thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng 3. Một số biến thể của PCR: ➢ Reverse transcriptase PCR (RTPCR) ➢ Hotstart PCR ➢ Assembly PCR ➢ Nestedseminested PCR ➢ Allelespecific PCR ➢ Methylation – specificỹ Nương Email ntmnuonghcmus edu vn 1 Nội dung 1 Mục tiêu, nguyên lý 2 Các thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng 3 Một số biến thể.

PCR (POLYMERASE CHAIN

REACTION)

ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn

Tài liệu tham khảo

[1] Buckingham, L (2007) Molecular

diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical

Vì sao cần PCR?

 Khả năng phát hiện và định lượng đặc hiệu một trình tự DNA xác

định trong tập hợp nhiều trình tự DNA

 Phân lập trình tự DNA mục tiêu

Khả năng nhân bản đặc hiệu:

 Gene hiện diện với hàm lượng rất thấp trong mẫu,

không thể phát hiện bằng bất cứ phương pháp nào

 Để “nhìn thấy” gene trong gel agarose, cần  10-20 ng

Các thành phần của PCR?

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR

1 Primer (mồi)

Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2)

Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành

primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại.

2 DNA bản mẫu (template)

Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất

ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ),

heparin, )

3 Nồng độ MgCl 2

Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo

nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản

của enzyme

4 dNTP

Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi

5 Enzyme

Được chọn tùy mục đích sử dụng :

 Taq DNA polymerase ( Thermus aquaticus ) : thông dụng nhất, hoạt tính

polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease

Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’

exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng  multiplex PCR

Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR

 Vent/DeepVent DNA polymerase ( Thermococcus litoralis ) : tính chịu nhiệt

rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’

exonuclease  tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu

bằng”

 Pfu DNA polymerase ( Pyrococcus furiosus ) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và

3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong

cycle sequencing

 Tth DNA polymerase ( Thermus thermophilus ) : vừa có chức năng

polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT)  dùng trong phản ưng

RT-PCR

 UlTma DNA polymerase ( Thermotoga maritima ) : tính chịu nhiệt rất cao,

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)

5 Chương trình PCR :

 Nhiệt độ : biến tính – 94-95C ; lai < Tm của các primer ~ 5C ; kéo

dài - 72 C

 Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm

 Số lượng chu kỳ thường  40

Ví dụ : 1 chu kỳ - 95C – 5‘

35 chu kỳ – 94C – 30”

55C – 30”

72C – 45”

1 chu kỳ – 72C – 10’

6 Thiết bị : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate

96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam

kính để tiến hành in situ PCR.

7 Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)

NHỮNG HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR – CÁCH KHẮÊC PHỤC

1 Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh

2 Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

➔ Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính trung thực cao như Pfu , DeepVent, UlTma polymerase

3 Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác

➔ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha sẳn (kit) đã được chuẩn hóa

4 Thiết bị đắt tiền

CÁC BIỆN PHÁP THẬN TRỌNG KHI SỬ DỤNG PCR

1 Tách biệt các khu vực thí nghiệm : pha chế, đặt phản ứng,

phân tích kết quả Di chuyển theo 1 chiều

2 Sử dụng thiết bị, dụng cụ, vật liệu tiêu hao riêng cho từng

khu vực Sử dụng tip có phin lọc

3 Thay găng tay, áo blouse, ….

Một giọt phản ứng PCR chứa 10 6 bản sao trình tự mục tiêu !!!

4 Làm sạch khu vực thí nghiệm bằng dung dịch sodium hypochlorite 10 % và làm sạch lại

CÁC PHƯƠNG PHÁP PCR

Cho phép định lượng số lượng trình

tự DNA mục tiêu trong mẫu

Real-time PCR được sử dụng phổ biến

trong:

• Phân tích biểu hiện gene

• Nghiên cứu ung thư

• Nghiên cứu thuốc,…

• Chẩn đoán và theo dõi bệnh

Ví dụ: phân tích sự biểu hiện của gene BRCA1 trong ung thư vú

Ví dụ: Phát hiện và định lượng % GMO

Tác nhân đánh dấu

Quy trình – thiết bị

• Thành phần phản ứng: tương tự PCR

+ tác nhân phát huỳnh quang

• Quy trình thực hiện: tương tự PCR

• Eppendorf thành mỏng và trong

• Máy Real-time PCR có thêm hệ thống

đọc tín hiệu huỳnh quang liên kết với

máy tính => không cần điện di

Baseline : tín hiệu huỳnh quang nền

Threshold : nằm phía trên baseline, ở đầu vùng nhân bản theo hàm mũ

CT (Cycle Threshold) : chu kỳ ngưỡng

Kết quả

KẾT QUẢ PCR REAL-TIMEC

A

B

10 1 bản sao

10 1 bản sao

Dựng đường chuẩn (standard

curve) với một chất chuẩn có

nồng độ đã biết

Hàm lượng của thành phần cần

phát hiện được tính dựa trên

đường chuẩn này

Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) : chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền

Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền

ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI VÀ TUYỆT ĐỐI

ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI

So sánh hàm lượng giữa hai

trình tự mục tiêu, thông qua tỷ

lệ hàm lượng của chúng

Phương pháp : 2 - C

T

ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI

Dựng đường chuẩn (standard curve) với những nồng độ pha loãng đã biết của 1 amplicon.

PCR efficiency : được tính dựa trên giá trị

“slope”: -3.32 tương ứng 100 % efficiency

Slope (-) hơn :  100 % efficiency, (+) hơn :

phản ứng bị ức chế, sai lầm do hút nhả,

C T = C T mục tiêu – C T tham khảo

CT = C T mẫu thí nghiệm - C T mẫu chứng

PHÂN TÍCH ĐƯỜNG CONG NÓNG CHẢY

(MELTING CURVE ANALYSIS)

Đánh giá đặc điểm biến tính của 1 trình tự DNA mạch đôi khi gia nhiệt

Nhiệt độ ở đó 50 % trình tự DNA biến tính : điểm “nóng chảy”.

Có thể được dùng phối hợp với chất “nhuộm” DNA mạch đôi để phát hiện đặc hiệu 1 sản

phẩm nhân bản xác định.

Gồm 2 bước :

1 RT (Phiên mã ngược) : tạo cDNA

2 PCR : nhân bản cDNA

Dùng để nhân bản RNA

Polymerase bị vô hiệu

hóa do liên kết với

Nested / Semi-nested PCR : sử

dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1

mồi/1 cặp mồi “trong” để tăng

tính đặc hiệu và độ nhạy của

phản ứng PCR

Nested / Semi-nested PCR

Multiplex PCR

Multiplex PCR : sử dụng

nhiều hơn 1 cặp mồi

trong 1 phản ứng PCR

để phát hiện đồng thời

nhiều trình tự DNA của 1

tác nhân (A) hay nhiều

tác nhân (B

Nhân bản với nhiệt độ bắt

cặp primer “khắc nghiệt”,

primer có đầu 3’ không bổ

sung (mismatch) sẽ không

bắt cặp không nhân bản

Nhằm phát hiện SNV

(Single-Nucleotide Variations)

AS (Allele-specific) PCR

Methylation-specific PCR (MSP)

DNA được xử lý với sodium bisulfite, biến C không methyl hóa thành U

PCR được tiến hành với 2 bộ mồi phát hiện “C” hay “U”.

Nhằm phát hiện sự methyl hóa các “đảo” CpG

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

Là một multiplex PCR với các probe được

thiết kế đặc biệt: gồm 2 mảnh, 1 trong 2 mảnh

được đánh dấu huỳnh quang Có thể thiết kế

PCR kỹ thuật số (Digital PCR)

1st

PCR kỹ thuật số (Digital PCR)

PCR kỹ thuật số (Digital PCR)

Các phương pháp nhân bản DNA khác

Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Tổng hợp DNA thay thế chuỗi tự xoay

vòng

DNA polymerase có khả năng thay thế

mạch: Bacillus stearothermophylus (Bst) DNA

polymerase

4 mồi, đẳng nhiệt: 60 - 65 o C

Helicase dependent amplification (HAD)

Rolling Circle

Amplification (RCA)

Rolling Circle Amplification (RCA)

Recombinase polymerase amplification (RPA)

Sử dụng recombinase, SSB protein và

DNA polymerase có hoạt tính “dời

mạch”

Nhược điểm :

- Hướng dẫn thiết kế primer/probe

chưa có nhiều ; primer 30-38 base

- Hóa chất do 01 hãng cung cấp

(TwistAmp kit)

3 Những cách hạn chế các nhược điểm của phương pháp PCR

4 Nêu một số ứng dụng của nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR

5 Nêu cách thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

6 Đường chuẩn là gì ? Xây dựng như thế nào ? Dùng làm gì ?

7 Ct là gì ? Vì sao cần xác định Ct ?