MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC CHẤT

Các mồi có trình tự Nu thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của mạch khuôn và hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau và • Nồng độ các loại dNTP dATP, dGTP, dCTP, dTTP: Sự mất c

KỸ THUẬT PCR

 PCR - polymerase chain reaction: là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng

Kary B Mullis

 Nguyên tắc

Là phương pháp khuếch đại DNA dựa trên mạch khuôn là một trình

tự DNA đích, nhân số lượng của khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

• Nhiệt độ được hạ thấp 54 – 65 0 C (<Tm primer) cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

• Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’3’

• Mồi ngược bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’5’

Bước 3: (kéo dài, elongation)

Nhiệt độ tăng 72 0 C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc

bổ sung với mạch khuôn Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2 n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.n: Là số chu kỳ

Thiết bị thực hiện PCR

Đọc kết quả PCR

• Điện di trên gel agarose để phân loại DNA theo kích thước

• Điện di là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường

Các yếu tố ảnh hưởng quá trình PCR

DNA khuôn

Taq polymerase Mồi

Nồng độ Nucleotide

Dung dịch đệm

• DNA khuôn : hiệu quả PCR tỷ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn

• Enzyme DNA polymerase càng mạnh phản ứng PCR càng triệt để Taq polymerase là enzym được sử dụng phổ biến.

• Primer : là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả PCR Độ dài của mồi 17-30 Nu Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau nhiều Các mồi có trình tự Nu thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của mạch khuôn và hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau và

• Nồng độ các loại dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP): Sự mất cân bằng trong thành phần các loại Nu sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.

• Dung dịch đệm : cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA

polymerase.

Các yếu tố ảnh hưởng quá trình PCR

Ứng dụng PCR

Xác định quan

hệ huyết thống Pháp y, hình sự

Chẩn đoán

bệnh trong

chăn nuôi

Sinh học – y khoa

KỸ THUẬT DNA TÁI TỔ HỢP

Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp

Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp

• Chuyển gen chỉ sử dụng cho thực vật và động vật

• Nấm men, vi khuẩn, TB nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai gọi

là TB tái tổ hợp (recombinant cell), TB biến nạp (transformed cell)

VECTOR CHUYỂN GEN

• Là một đoạn DNA nhỏ có khả năng mang 1 đoạn DNA ngoại lai khi xâm nhập vào TB chủ thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của TB chủ

• Tồn tại và ít gây xáo trộn cho TB vật chủ.

• Kích thước nhỏ

• Có điểm khởi đầu sao chép (Ori)

• Có gen chỉ thị

• Đảm bảo DNA tái tổ hợp di truyền bền vững

• Có đoạn trình tự cho enzym giới hạn nhận biết

Đặc điểm của vector chuyển gen

Đặc điểm của vector chuyển gen

• Tồn tại trong TB chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn cho TB vật chủ.

• Kích thước càng nhỏ càng tốt để dễ xâm nhập vào TB vi khuẩn và sao chép nhanh.

• Có điểm khởi đầu sao chép (Ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong

• Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp

• Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào

ENZYM GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME – RE)

RE: bản chất là protein có khả năng nhận diện chính xác một đoạn trình tự DNA ngắn và cắt chính xác phân tử DNA ở vị trí đặc hiệu

RE có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le.

RE: có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của CNSH => ngành

công nghệ DNA tái tổ hợp

KỸ THUẬT TẠO DNA TÁI TỔ HỢP

Phân lập gen (DNA, RNA)

Giải phóng DNA

Sử dụng Phenol/Chloroform

=> Kết tủa protein

Ly tâm để phân tách protein và DNA

Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA

Ly tâm để thu cặn DNA

Tạo DNA tái tổ hợp

Chuẩn bị vector  Chuẩn bị đoạn chèn  Gắn kết

Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB nhận (biến

nạp)

Biến nạp là một quá trình xảy ra tự nhiên trong đó các tế bào vi khuẩn tiếp nhận DNA ngoại lai  đưa các plasmid vào bên trong vi khuẩn

Tách dòng chứa DNA tái tổ hợp

• Vi khuẩn không có vector thiếu gen kháng kháng sinh  không phát triển

• Vi khuẩn biến nạp với vector có gen kháng kháng sinh biểu hiện  tồn tại

• Kháng kháng sinh cho phép sàng lọc vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp nguyên vẹn.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

DƯỢC CHẤT

1 SẢN XUẤT VACCIN

Vaccin được chế tạo từ các vsv (virut, vi khuẩn, nấm men) hoặc các kháng nguyên đặc hiệu, được đưa vào cơ thể người gây miễn dịch chủ động nhằm phòng nhiễm khuẩn do các vsv tương ứng gây ra

Vaccin nhược độc BCG phòng bệnh lao

dạng đông khô

Vaccin tái tổ hợp phòng viêm gan

B

Vaccin tách chiết từ polysaccharide của vỏ vi

khuẩn thương hàn Salmonella typhi

Vaccin bất hoạt phòng bệnh tả

1 đoạn DNA (HBS) tách

từ virus gây viêm gan B

1 đoạn DNA (HBS) tách

từ virus gây viêm gan B

Vector chuyển genplasmid PBS

Vector chuyển genplasmid PBS

Nấm men

Kháng nguyên HBsAg

Biểu hiện miễn dịch với

virus viêm gan B

Độ an toàn cao

Độ an toàn cao

2 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

Kháng thể là những phân tử protein được sản xuất bởi những những

tế bào lympho B khi có sự kích ứng đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên cơ thể vật chủ

Kỹ thuật TB lai hybridoma: lai giữa TB myeloma với TB lympho B

=> TB lai có thể phân bào liên tục trong điều kiện nuôi cấy, đồng thời

lại có khả năng sản sinh ra kháng thể

3 LIỆU PHÁP GEN

Liệu pháp gen (gene therapy) là

tập hợp các biện pháp để sử dụng các

gen cần thiết (gen trị liệu) nhằm mục

đích chữa bệnh cho con người

Ứng dụng

• Điều trị ung thư

ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

PP mang nhiều triển vọng

PP mang nhiều triển vọng

4 PROTEIN TRỊ LIỆU

Các chất có hoạt tính sinh học dùng làm dược phẩm được tạo thành trong quá trình nuôi cấy tế bào động, thực vật trong hệ lên men

 Sản xuất insulin

Insulin là một hormon do tế bào

beta của tuyến tụy tiết ra có vai

trò làm giảm đường huyết

Phương pháp sản xuất insulin

Cô lập từ tuyến

tụy của động vật

Hoa rum được cấy gen sản sinh insulin

Sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật

biến đổi gen vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) nấm men

(Saccharomyces cerevisiae…)

Sản xuất interferon

Protein và glycoprotein tự nhiên do

TB của hệ miễn dịch sản sinh ra

nhằm chống lại các tác nhân ngoại

lai như virus, vi khuẩn, ký sinh

trùng và TB ung thư khi xâm nhập

vào cơ thể người

Hormone sinh trưởng người

Protein chứa khoảng 191 amino acid, thiếu nó

cơ thể người sẽ bị lùn

Sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

5 CHẨN ĐOÁN BỆNH

Test kit: là công cụ kiểm tra một vấn đề cụ thể nào

đó bằng cách lấy một lượng nhỏ mẫu và chờ xem kết

quả trong một khoảng thời gian ngắn

Test kit: là công cụ kiểm tra một vấn đề cụ thể nào

đó bằng cách lấy một lượng nhỏ mẫu và chờ xem kết

quả trong một khoảng thời gian ngắn

Test kit: que thử thai Test kit: nhóm máu

Bộ test kit phát hiện bệnh

Test kit: tiểu đường Test kit: HIV

Test kit: viêm gan C

Cơ chế tác dụng của kháng sinh

• Hiện đã biết >10.000 kháng sinh nhưng chỉ 200 loại được sản xuất

và sử dụng thương mại

• Kháng sinh được sản xuất từ các chủng nấm mốc Penicillin

Penicillin crysogenum và Penicillin

notatum sản xuất penicillin

Việc tìm kiếm kháng sinh mới luôn tiếp diễn, do hiện tượng vi sinh

vật kháng lại tác dụng của kháng sinh ngày càng nhiều hơn