sâm việt nam và một số cây thuốc họ nhân sâm - phần 2

Nhiều công trình nghiên cứu cơ bản về nuôi cấy sinh khối SVN đã được thực hiện như: tạo sinh khối từ mẫu cấy rễ củ, môi trường nuôi cấy, tổ hợp kích thích tố sinh trưởng, tổ hợp vitamin,

đào tạo Mỗi xã tổ chức 1 - 3 điểm trồng sâm, tổ chức theo hướng hộ tự nguyện trồng sâm, liên kết quản lý bảo vệ theo mô hình trang trại

Giai đoạn 3: 2016 — 2020, khuyến cáo nhân dân trong vùng quy hoạch trồng tập trung theo các nhóm tự nguyện, quản lý theo mô hình trang trại

Trồng phân tán theo hướng xã hội hoá toàn dân Hướng dẫn sản xuất cây giống cho các cụm sản xuất tập trung để cộng đồng tự sản xuất cây giống cho mục tiêu trồng phân tán

5 NUÔI CẤY SINH KHOI [ 2, 26, 75, 77, 80, 84, 97, 100, 101, 103]

Từ năm 1983 Trung tâm Sâm nghiên cứu sản xuất sinh khối SVN nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu mới có hoạt chất và tác dụng sinh học tương tự như sâm tự nhiên nhưng với thời gian rất ngắn (khoảng 6 tuần) bổ sung cho nguồn nguyên liệu SVN tự nhiên và trồng Một số nước như Liên xô (trước đây), Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công sinh khối sâm Triều Tiên trên quy

mô công nghiệp và các sản phẩm chế từ sinh khối sâm Triều Tiên (Alfermann

A.W et al1978; Aviv D et aL, 1978; Bohn H., 1978; Butenko R.G.,1964; Furua T et al.,1970)

Nhiều công trình nghiên cứu cơ bản về nuôi cấy sinh khối SVN đã được thực hiện như: tạo sinh khối từ mẫu cấy rễ củ, môi trường nuôi cấy, tổ hợp kích thích tố sinh trưởng, tổ hợp vitamin, các điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn cấy truyền, nghiên cứu nâng cao hoạt chất trong callus SVN Trung tam Sâm đã tạo được dòng callus -PVC-87 có hàm lượng hoạt chất khá ổn định Dòng callus này đã được phân tích thành phần hoá học, tác dụng được lý và được sản xuất thử nghiệm trên qui mô nhỏ để bào chế một số dạng mỹ phẩm

5.1 Nghiên cứu tạo callus sâm Việt Nam

Nguyên liệu và phương pháp

- Lá, thân, hạt và rễ của cây SVN hoang đại thu từ vùng sâm thiên nhiên

có từ 1 — 5 năm tuổi.

100 SAM VIET NAM

- Các loại vitamim, kích thích tố sinh trưởng thực vật acid 2,4-

dicloraphenoxyacetatic (2,4D), acid indol-3-acetatic (IBA), kinetin (K)

- Vinacocos: nước đừa vô trùng do Trung tâm Sâm điều chế

~ Phương pháp nghiên cứu: cấy nh trong bình tam giác trên môi trường thạch

- Cách tiệt trùng: dùng HạCl; ở nồng độ 0,2-0,5% trong 3 — 7 phút

> Nghiên cứu môi trường cấy

- Môi trường cấy cơ bản: hydrat carbon (sucrose 3%), nguyên tố đa và vị

lượng (NH†, NO””N toàn phần, K*, Ca?!, Mg?”, Fe?*, S, P)

- Chọn tổ hợp vitamin: trên cơ sở 3 tổ hợp vitamin của 3 môi trường MS,

NN và Morel có tác dụng trên sự tăng trưởng callus SVN nhưng còn chậm Qua

thực nghiệm, đã chọn được tổ hợp tối ưu cho sự phát triển callus SVN, gọi tắt là

V-PVC-84 bao gồm: vitamin BI, vitamin B6, vitamin PP, calci pantotenat,

inositol, biotin theo ty 1¢ fin luot (1:1:10:5:100:0,05 mg/l)

Bảng 22 Tác động của V-PVC-84 lên sự hình thành và phát triển calus

Tổ hợp vitamin Tỷ lệ % callus Mức độ callus

Tỷ lệ mẫu cấy có Số tổ hợp kích thích tố sinh trưởng

hình thành callus (%) 2,4D + Kinetin IAA + Kinetin

Từ các kết quả trên đã áp dụng toán quy hoạch thực nghiệm và chọn được

tổ hợp kích thích tố sinh trưởng tối ưu cho sự hình thành và phát triển callus SVN từ mẫu cấy Thực nghiệm đã tiến hành trên 3 tổ hợp kích thích tố sinh trưởng 2,4D, IAA, kinetin và vinacocos (4 nhân tố) Rễ củ SVN 2 năm tuổi được dùng làm mẫu ban đầu Nuôi cấy tĩnh trong bình tam giác trên môi trường thạch trong 8 tuần Kết quả cho thấy tổ hợp tối ưu là 2,4D; IAA; kinetin;

102 SAM VIET NAM vinacocos theo tỷ lệ (2ppm: 2ppm: 2, 125ppm: 15%) Với tổ hợp này kết quả thu được tốt nhất với 872mg callus SVN tươi trong 1 bình tam giác

- Tác động của vinacocos lên sự hình thành và phát triển callus SVN từ

mẫu cấy

Bang 25 Tác động của vinacocos (ở các nồng độ khác nhau)

lên sự hình thănh và tăng trưởng callus SVN từ mô cấy

Số % của Thời gian hình % callus Mức độ

mẫu cây | vinacocos thành callus (ngày) hình thành tăng trưổn, givens

Dùng vinacocos trong tổ hợp kích thích tố sinh trưởng làm cho sự hình

thành và tăng trưởng callus SVN tăng lên rõ rệt, thời gian hình thành callus

ngắn hơn 12 ngày và callus phát triển mạnh ở nồng độ 15% vinacocos,

Kết quả cho thấy vinacocos ở nồng độ 15% cho kết quả tốt nhất

- Nghiên cứu chọn mẫu cây

Callus có thể phát triển từ tất cả các bộ phận của cây khi được cấy trong môi trường V-PVC-84 Mẫu cấy lấy từ rễ cây 2 — 4 năm tuổi phát triển nhanh hơn và tốt hơn,

- Nghiên cứu điều kiện môi trường

Nhiệt độ và độ ẩm của phòng cấy: khảo sát hình thành callus ở các điều

kiện khác nhau ghi nhận trong ! năm cho kết quả là nhiệt độ 24 — 26C callus

phát triển thích hợp nhất Độ ẩm trong phòng cấy được giữ thường xuyên ở

70 - 80%.

Năm tuổi 1 năm | 2năm | 3năm | 4năm | 5 năm | 6năm

> Cay truyén giai đoạn 1: PVC-84 được cấy truyền trên cùng 1 môi trường

là M-PVC-84 trong khoảng 6 tuần cho đến 1 năm

> Cấy truyền giai đoạn 2: dựa vào kinh nghiệm thu được qua nuôi cấy callus trước đây các tác giả đã nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy bằng cách cho thêm 50mg KCI, lg urê vào một lít môi trường và cải tiến

104 SÂM VIỆT NAM

> Callus PVC-85 được cấy truyền tiếp tục trong môi trường M-PVC-85 với cùng phương pháp và điều kiện của giai đoạn cấy truyền lần 1 cho dong callus SVN khá ổn định trong năm 1986 gợi tắt là PVC-§6 Callus PVC-

86 được dùng để xác định động thái tăng trưởng, sơ bộ phân tích thành phần hoá học và tác dụng được lý so sánh với rễ cây SVN hoang đại

5.8 Nghiên cứu biến động sinh trưởng của PVC-86

> Nguyên liệu và phương pháp: PVC-86 được cấy trong môi trường M- PVC-85 chứa trong các ống nghiệm có trọng lượng xác định Biến động

sinh trưởng trọng lượng tươi của callus trong 10 và 12 ống được khảo sát trong 8 tuần Phương pháp tính toán dựa trên chỉ số sinh trưởng và tốc độ sinh trưởng

- Chỉ số sinh wrung: Pt — Po/ Po và pt— po/ po

- Tốc độ tăng trưởng: Pt —Po/t và pt— po/t

trong đó: Po: trọng lượng tươi của mẫu cấy (mg);

po: trọng lượng khô của mẫu cấy (mg);

Pt: trọng lượng tươi của callus ở thời điểm t;

pt: trọng lượng khô của calus ở thời điểm t;

t: tuần hoặc ngày

Kết quả biến động sinh trưởng cho thấy trọng lượng tươi của callus tăng đần trong 8 tuần, tổng trọng lượng thu được tăng khoảng 9 lần(từ 111mg lên 956mg) và tổng trọng lựong khô khoảng 7 lần (từ 6,7mg lên 47,5mg) Tốc độ tăng trưởng cao nhất quan sát được ở tuần thứ tư Trọng lượng callus ting dan trong 6 tuần đầu và sau đó hầu như không đổi trong tuần thứ 7 — 8

0 111+7,7 93,96 | 6,7

Thứ 1 | 218+15,9 | 0,96 107 | 15,28 | 9435 | 12,3 | 0,85 5,6 | 0,80 Thứ 2 | 3474+13,6 | 2,13 118 | 16,85 | 94,72 | 18,3 | 1,73 5,8 | 0,82

Thi 3 | 518+15,6 | 3,66 136 | 19,38 | 94,76 | 27,1 | 3,04 6,8 0,97 Thit4 | 6594+25,8 | 4,93 137 | 19,57 | 95,02 | 32,8 | 3,89 6,5 0,93 Thứ 5 | 730+14,5 | 5,58 124 | 17,68 | 95,04 | 36,2 | 4,40 3,9 0,84 Thi6 | 833+12,8 | 6,50 120 | 17,19 | 94,33 | 47,2 | 6,04 67 | 0,96 Thứ 7 | 912+12,1 | 7,21 114 | 16,34 | 94,93 | 46,2 | 5,89 5,6 0,80

5.4 Nghiên cứu callus sâm Việt Nam PVC-87

Kết quả nghiên cứu cho thấy callus PVC-86 phát triển nhanh, mạnh và khá ổn định Callus chứa thành phần hoá học tương tự như trong rễ củ SVN hoang đại (phần 6), nhưng hàm lượng lipid trong callus PVC-86 cao hon trong

rễ SVN hoang dại nhiều lần Callus PVC-86 thể hiện 5 tác dụng được lý chính như của rễ SVN hoang đại Điều đó chứng tổ có thé đùng callus như là một nguyên liệu để điều chế mỹ phẩm và thực phẩm chức năng Tuy nhiên, mục đích nghiên cứu PVC-§7 nhằm nâng cao hoạt chất trong callus mà chủ yếu là saponin

> Phương pháp và môi trường cấy: đã thử nghiệm trên 30 công thức của môi trường cấy Trong đó những chất trung gian được dùng như những tiền chất

và tổ hợp kích tố sinh trưởng đã cải tiến như sau:

- Môi trường cấy: BM-PVC-85 được sử dụng, V-PVC-85 cũng được dùng

nhưng không côn biotin Tổ hợp kích thích tố sinh trưởng được cải tiến bằng cách giảm đần nồng độ 2,4D và kinetin từ 2ppm xuống còn ippm (một trong

sáu tổ hợp tao thanh callus 100% và có trọng lượng tươi của callus cao); bằng

cách giảm hàm lượng IAA từ 2ppm xuống còn 0,5ppm, nhưng thêm IBA Sau 6 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu sau đây được xác định cho mỗi công thức môi trường: trọng lượng tươi và khô của callus, hàm lượng lipid toàn phần, lượng

106 SAM VIET NAM

cin MeOH va cắn z-BuOH bão hoà nước được xem như là saponin thé va dude phân tích bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thành phần hợp chất saponin so sánh với rễ sâm hoang dại

>_ Kết quả: một trong 30 công thức môi trường tốt nhất đã được chọn lọc, được

mã hoá là môi trường PVC-87/010687, gồm có: 2,4D; kinetin; IBA; IAA;

inacocos với tỷ lệ lần lượt 1ppm:lppm:1ppm:0,5ppm:15%/1 lít môi trường

(viết tắt H-PVC-87) Hai chất thêm vào d và s, đường sucrose 7% và agar- agar 0,7% Callus sản xuất theo môi trường này được gọi là PVC-87 Callus

được đưa vào phân tích thành phần hoá học và thử tác dụng dược lý So sánh với PVC-86, thì 2 thành phần chính là lipid và saponin tăng rõ rệt: 1,92% lipid toàn phần và 5,68% saponin thô ( so lần lượt với 1,65% và 3,99% trong

PVC-86),

> Callus PVC-87 tươi được đông khô cho 1 bột màu vàng, mịn, khô có vị đắng nhẹ, mùi đặc biệt Callus PVC-87 được sản xuất ở quy mô thử nghiệm từ năm 1989 để dùng sản xuất mỹ phẩm và các chế phẩm thực phẩm chức

năng

Callus SVN và cây SVN nuôi cấy sinh khối

Phòng nuôi cấy sinh khối SVN

tái sinh cây sâm và xác định 4 yếu tố bổ sung cho môi trường cơ bản N.N

Dung là glutamin, 2iP, Ga3 và saccharose với tỷ lệ lần lượt: 19,8mg/l; 2,12ppm; 1,02 và 35,6g/1 Từ đó đã chọn được các dòng callus từ rễ củ có khả năng tái sinh cao, ổn định bằng con đường tạo phôi vô tính (somatic embryogenesis) và phát triển qua các giai đoạn như phôi hữu tính: phôi hình cau (globular shape), hình tim (heart sharp), hình thủy lôi (torped shape)

Nhóm tác giả đã đưa ra quy trình tái sinh cây SVN như sau:

- _ Các mẫu lá non, hay đầu mẫu thân, rễ của cây SVN Sau khi xử lý vô trùng được đặt vào môi trường (N.N Dung-1984) với tổ hợp kích thích tố sinh trưởng thích hợp để thu được callus sơ cấp

- Callus nay khi phát triển đến một kích thước nhất định được chuyển sang môi trường có 2iP và NAA Kết quả cho thấy môi trường nuôi cấy với tổ hợp 1,5ppm NAA và 2ppm 2iP là tốt nhất cho sự phân hoá callus, tạo tiền phôi cho cây SVN

Sơ đồ tóm tắt quá trình hình thành phôi soma từ callus SVN

1-5: mô sẹo phân hoá, 6-8: phôi bắt đầu hình thành, 9~10: phôi hình tim,

11-12: phôi hình thủy lôi, 13—14: phôi trưởng thành

108 SÂM VIỆT NAM

-_ Để phôi tiếp tục phát triển cần cấy chuyền sang môi trường có mặt gibberellin (0,2 — 1 ppm) và BA thích hợp cho SVN

- _ Đã phát triển các chồi trên môi trường có mặt BA (1 - 3 ppm) Chồi có

1 - 2 lá kép, mỗi lá có từ 3 đến 5 lá chét, mép lá có răng cưa, lá có nhiều lông tơ

- _ Cuối cùng cây con SVN hoàn chỉnh phát triển rễ trong môi trường có mặt IBA và kinetin ở nồng độ thấp

- Tuy nhiên, ở giai đoạn ra bầu thì tỷ lệ sống vẫn chưa cao, chỉ đạt từ

3 — 10%

> Gần đây, Dương Tấn Nhựt va cs, 2006 ( Phân viện Sinh học Đà Lạt) cũng

có những nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào SVN bằng kỹ thuật bioreactor, bước đầu cũng đạt được kết quả nhất định khi so sánh với kỹ thuật nuôi cấy

trong môi trường thạch

a, Cây SVN; b sự hình thành callus từ mẫu lá SVN

c sự hình thành mô phôi từ callus; d sự hình thành rễ bất định từ callus

Cây sâm Việt Nam và sự phát triển hinh dang cia n6 in vitro

a Sự hình thành rễ bất định trên môi trường thạch;

b Sự nhân bản của rễ bất định trong bình bioreactor

Sự nhân bản của rễ bất định trong môi trường thạch

và dung địch bioreactor sau 8 tuần

6 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM VÀ CÁC CHẾ PHẨM [1, 8, 9, 10, 24, 25, 26, 31, 38, 40, 53, 61,62, 66, 71, 72, 81, 85, 105, 108,

109, 110, 111, 112, 113, 114, 118, 146, 151, 152, 158, 154, 155, 156, 157,

159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 174, 175]

6.1 Thành phần hoá học của sâm Việt Nam hoang dại

1976 Nguyễn Thới Nhâm đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong SVN hoang dai, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện và sâu hơn về các thành phần hoá học có trong SVN Thành phần hoá học cơ bản và và có tính chung nhất trong phần trên và dưới mặt đất của SVN được trình bày trong bảng 30

Bảng 30 Thành phần hoá học chung trong SVN

Bộ phận dùng

Thành phần khảo sát Phần dưới mặt đất | Phần trên mặt đất

(Thân rễ và rễ củ) | (Lá và cong than)

110 SAM VIET NAM

Bảng 30 (tiếp theo)

6.1.1 Các hợp chất saponin trong SVN phần dưới mặt đất

Ngoài những phân tích sàng lọc bước đầu về thành phần hóa học của cây

SVN, Trung tâm Sâm đã hợp tác với Viện Cây thuốc Poznan, Ba Lan và

"Trường đại học Hiroshima, Nhật Bản phân lập và xác định cấu trúc các hợp

chất saponin trong SVN Ngoài ra còn có Trường đại học Khoa học tự nhiên Tp

Hồ Chí Minh hợp tác với Trường đại học Toyama, Nhật Bản, Các kỹ thuật áp dụng của các nhóm đều tương tự nhau trong chiết xuất saponin bằng cách đun

hồi lưu với MeOH Cắn MeOH thu được tiếp tục lắc chiết phân đoạn với ether

và øBuOH bão hoà nước hoặc rửa qua cột Diaion HP-20 để thu được phân

đoạn saponin (saponin toàn phần) Bằng kỹ thuật sắc ký cột với pha rắn là

silicagel pha thuận và pha đảo; các kỹ thuật sắc ký lồng hiệu năng cao với các cột silicagel pha thuận và pha đảo cũng được áp dụng để tách các saponin thứ

yếu có hàm lượng thấp Sơ đồ dưới đây cho thấy một quy trình chiết xuất và

phân lập các hợp chất saponin tiêu biểu trong SVN

Cấu trúc của saponin phân lập được xác định dựa trên các đặc điểm lý

hoá như điểm nóng chảy, độ truyền quang và các phân tích về kỹ thuật phổ UV, 1R, MS, 1H-NMR, 13C-NMR một chiều và 2 chiều, kết hợp đối chiếu so sánh

(200g)

Gửi Dian MeOH ly

Phân đoạn H;O (95.08) Phân đoạn MeOH (81.38) Thân đoạn CHCI, (2/88)

Dang 84 A: ICT MeOH 0 0020 3020-5 0000107) 3080 Doug mi D: CHCA McOAEE 8:18:10 lớp ie)

Dash ni a DOH EOACIO CEI)

721 Wp aa) Dane 8 FHC -DeOHL MOH 20-1520, dah)

Sơ đồ chiết xuất và phân lập saponin

ở phần trên mặt đất của SVN Các saponin dẫn chat cia 20(S) -protopanaxadiol

Bang 31 20(.S)-protopanaxadiol

STT Tén Týp Ri Ra oO

3 | G-Rb3* (A) -GIc?- Glc -Gle®-Xyl 0,11

4 | GR, (A) -GIc?- Gle -Gle®-Ara(f) 0,013

G= ginsenosid; P= pseudo-ginsenosid; GY= gypenosid; Q= quinquenosid

N= notoginsenosid; M= majonosid; VG= vina-ginsenosid *: cdc saponin chính.

SAM VIET NAM

Các saponin dẫn chất của 20(S) - protopanaxatriol

0H OH (K) RO

6.1.2 Các hợp chét saponin trong SVN phần trên mặt đất

19 saponin dammaran đã được phân lập từ phần trên mặt đất của SVN bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-

ginsenosid-L1-L8!%, Khác với thành phần saponin từ phần dưới mặt đất của

SVN, các saponin dẫn chất của 20(.5)-protopanaxadiol chiếm tỷ lệ rất cao trong thành phần saponin từ phần dưới mặt đất của SVN với đại diện chính là

notoginsenosid-Fe, G-Rb3, N-Fe va VG-L2 Các saponin có cấu trúc ocotillol chiếm tỷ lệ thấp với đại diện chính là VG-R1.

116 SAM VIET NAM

{80:20:1 đến 80:20:5)

9 phần đoạn 1~lX Sắc kỷ cột RP-18 ODS- HPLC polyamin HPLC

Chiết xuất và phân lập các saponin

6 phan trên mặt đất sâm Việt Nam

7 | VG-L2* |(A) -Gic?-Gie?-Xyl_| -Glc®-Ara(f) | 0,110

8 | N-Fe* (B) -GIc?-Glc?-Xyl | -Gic5-Xyl 0,341

118 SAM VIET NAM

Các saponin d&n chất của 20(.S)-protopanaxadiol

ở phần trên mặt đất của sâm Việt Nam Bang 36 20(5)-protopanaxatriol

16 ]24(§)-P-Eu (E) -Gle?-Rha 0,006

được đặt tên là vina-ginsenosid-RI-R25 và 20- O-Me-G.Rhị Các saponin

dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh hoc c6 gid iri

của sâm Triều Tiên Nó cũng chiếm một tỷ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của SVN (50/52 saponin được phân lập) Trong đó các saponin dẫn chất của 20(.9-protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenosid-Rbạ, -Rba, -Rd Các saponin dẫn chất của 20(5)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là: ginsenosid-

Re, -Rgi, notoginsenosid —R¡ Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 hợp

chất với các đại điện chính là: majonosid —R¡ và —R¿ Đặc biệt M-R; chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất của SVN và trở thành 1 hợp chất chủ yếu của SVN so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Panax japonicus C.A Mey var, ma/or (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng.

120 SAM VIET NAM

Bảng 38 So sánh thành phần saponin (%) ở phần dưới mặt đất của sam VN

và các loài sâm mọc hoang khác

PPHð Butan Các mẫu anax ở

PPE: Panax pseudoginseng subsp himalaycus, Tz: Tzatogang(3.100m);

P: Pari-la(2600-3550m); K: Khosa(1.800m); C: mẫu C ving Chame(2.700m); G: mẫu

G vùng Ghorapani(2.743m); D: mẫu D vùng trung tâm Nepal; Pk Panax JaPOniCUS, PIM: Panax japonicus var major, PV Panax vietnamensis

Bảng 39 So sánh thành phần saponin(%) ở phần dưới mặt đất

của sâm VN và các loài sâm trồng khác

20(5)-ppt 20(S-ppd 24 | 03 | 115 36 | 02 | 0,05 L2 - 141 | 0,025 - 0,88

Hiéu sua(%) | 6.0 | 06 | 1,2 16 14 11

Hai saponin dan chất của acid oleanolic chỉ chiếm một tỷ lệ rất thấp là

gÌnsenosid Ro và hemslosid —Ma3 Trong đó hemslosid - M; được phát hiện

đầu tiên trong một loài #zz2x thuộc họ Nhân sâm Hợp chất này trước đây đã được phân lập tit Hems/eya macrosperma C.Y.Wu ho Bau bi (Cucurbitaceae)

122 SAM VIET NAM này được tìm thấy trước đây chỉ mang các chuỗi đường ở C-6 và C-20, hoặc

C-6 và C-l2 VG-R5 và -Rố là 2 thí dụ của saponin có chứa dây nối œ-glycosid hiếm gặp trong tự nhiên Các VG-R10, -R12, -R13, -R14, -R15, -R16, -R17, -R19, -R20, -R21 là các saponin có cấu trúc agÌycon mới.VG-R3 là một glycosid đầu tiên phát hiện trong một loài Panax có agliycon là

đdammarenediol II Chất này có dưới dạng tự do trong nhựa của một số loài

thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) và có thể là một chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp của 20(9)-protopanaxadiol và 20(5-protopanaxatriol,

Trong quá trình sinh nguyên các saponin dẫn chất của protopanaxatriol có

khả năng là tiền chất của các saponin có cấu trúc ocotillol thông qua việc đóng

vòng mạch nhánh

ginsenosid-Rg, -Glc ginsenosid-Rh, -Gic pseudo-ginsenosid-RT, — GÍc

20-gluco-gisenosid-Rf -GIC°-Glc ginsenosid-Rf -GIc-GlIc majonosid-Rf -Gle?-Gte

ginsenosid-Re -Gic?-Rha ginsenosid-Rg) -Gle?-Rha 24(9-pseudo-

7 hợp chất polyacetylen được phân lập ở phân đoạn ít phân cực từ

phần dưới mặt đất của SVN 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với

panaxynol và heptadeca-1,8(E)-đien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen và

2 hợp chất mới là 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và

heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-điyn-3,10-diol.

Pv7

OH

R, — Ry: OH hodc OAc; Ry: OAc hodc OH

Các hợp chất polyacetylen phân lập từ phần đưới mặt đất của SVN

Pvl= panaxynol, Pv2= 10-acetoxy-heptadeca-8(£)-en-4,6-diyn-3-ol, Pv3= stereoisomer cha Pv5, Pv4= Din xudt cia Pv5, Pv5= heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol,

str | Ký | Tên thông Tên khoa học Công thức lượng

6.1.8, Thanh phan acid béo

Bảng 42 Thành phần acid béo của phần đưới mặt đất SVN

định có tính chống lão hoá tế bào

Bảng 43 So sánh thành phần acid amin ở phần dưới mặt đất

SVN với rễ củ sâm Triều Tiên

126 SÂM VIỆT NAM 6.1.7 Thành phần các nguyên tố đa 0ò 0í lượng

20 nguyên tố đa và vi lượng của phần dưới mặt đất SVN đã được xác định

bằng phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quang tia X Trong đó bao gồm

một số nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se

Bảng 44 Thành phần các nguyên tố đa và ví lượng ở phần đưới mặt đất SVN

6.2, Thanh phần hoá học của callus sâm Việt Nam

> Callus dạng bột có màu vàng, vị béo hơi đắng, có mùi thơm đặc biệt

oleanolic tự do, B- sitosterol, 1 sterol có nhóm chức carbony! va một chất dự đoán là daucosterol

với phần đưới mặt đất SVN

128 SAM VIET NAM Thanh phần acid béo gần như tương đồng với phần đưới mặt đất SVN,

trong đó acid béo còn gọi là vitamin E (acid linoleic va acid linolenic) chiém t¥

lệ rất cao 42,92%

> Acid amin: phân tích bằng sắc ký

Bảng 46 Thành phần acid amin của callus SVN

130 SAM VIET NAM

Bảng 48 Một số chỉ tiêu hoá hoc so sánh giữa callus và

cây SVN tái sinh ia vitro

Phân tích các nguyên tố đa vi lượng bằng phương pháp quang phổ phát

xạ plasma (IPC) cho thấy hàm lượng và thành phần các nguyên tố của SVN tái sinh in vitro va ré cd sâm Triều Tiên gần như tương tự nhau,

Bảng 50 So sánh thành phần nguyên tố đa vi lượng

trong SVN téi sinh và rễ củ sâm Triều Tiên (STT)

132 SÂM VIỆT NAM 6.3 Định tính và định lượng hợp chất saponin

6.8.1 Định tính hợp chất saponin

Năm 1976, Nguyễn Thới Nhâm đã công bố trên tạp chí Herba Polonica

tách được 13 hợp chất saponin từ phần dưới mặt đất SVN, trong đó có 8 hợp chất tương ứng với giá trị Rf và màu sắc với 8 ginsenosid chuẩn của sâm Triều Tiên (STT) trên sắc ký lớp mỏng (SKLM) Đây là nghiên cứu mở đầu cho những phân tích sâu hơn về thành phần hợp chất này

SKLM có hiệu quả trong phân tích định tính saponin SVN dựa trên việc

so sánh với saponin trong sâm Triều Tiên và các ginsenosid chuẩn: ginsenosid

Rb}, Rb2, Re, Rd, Re, Rf, Rgl, Rg2 va Ro do Gs J Shoji và Kaku cung cấp; Panaxadiol, panaxatriol và acid oleanolic do Viện Cây thuốc Poznan cung cấp Các hệ dung môi thích hợp được dùng:

+ Cho phân tích saponin

- CHC]; - MeOH - H;O (65:35:10) ( lớp dưới)

- nBuOH ~ AcOEt — HO (4:1:5) (lớp trên)

+ Cho phân tích sapogenin và -sitosterol

Bảng 51 So sánh thành phần saponin trong SVN và STT

đựa theo các chuẩn ginsenosid

15 pic tương ứng với 15 hợp chất saponin được phát hiện Nguyễn Minh Đức và

cs, 1998, đã áp đụng kỹ thuật SKULM và HPLC trong khảo sát so sánh SVN từ nguồn tự nhiên và trồng trọt tại Trại Dược liệu Trà Linh thuộc Công ty Dược

phẩm tỉnh Quảng Nam Kết quả cho thấy từ phần đưới mặt đất của SVN tự nhiên

và trồng đều chứa các saponin tương tự nhau về số vết chất, giá trị Rf và màu sắc trên SKLM và cho những vết tương ứng với các saponin chủ yếu trong SVN là

ginsenosid —Rg), -Rb3, -Rd, -Re, -Rg;, majonosid- R1 va -R2 Tuy nhién, trong 2

điều kiện khảo sát bằng HPLC, các pic chính có thời gian lưu giống nhau nhưng cường độ một số pic không tương đương nhau do tỷ lệ tương đối giữa các saponin

ở sâm tự nhiên và sâm trồng không hoàn toàn giống nhau

Kỹ thuật SKLM cũng được dùng cho việc so sánh định tính các thay đổi thành phần saponin của SVN qua các năm trồng (Trần Công Luận và cs, 2006) cũng như so sánh chúng với sâm tự nhiên, các sản phẩm từ nuôi cấy sinh khối

và các chế phẩm từ sâm (Nguyễn Thới Nhâm và cs,1990; Dương Tấn Nhựt và

cs, 2006).

134 SÂM VIỆT NAM

khó bị đẩy ra khỏi cột)

STP Sâm thương phẩm do Sở Y tế Quảng Nam cung cấp năm 2000

Sắc ký đồ saponin toàn phần của các sâm trồng so với sâm tự nhiên và sâm

© Saponin toàn phần của sinh khối rễ SVN trong môi trường, thạch

X Saponin toàn phần của sinh khối rễ SVN trong hệ thống nuôi cấy bioreactor

y Majonosid-R2 Sắc ký đồ so sánh saponin toàn

z Saponin toàn phần của phần của các sinh khối SVN, sinh khối rễ SVN trong môi SVN và STT

trường thạch

136 SAM VIET NAM

Nguyễn Ngọc Dung và cs, 1995 cũng đã áp dụng kỹ thuật do phổ hồng ngoại và sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích các hoạt chất tan trong methanol trong đó chủ yếu là hợp chat saponin cia SVN tdi sinh in vitro so với

rễ củ sâm Triều Tiên Do không có chuẩn ginsenosid để đối chiếu nên kết quả chỉ mang tính chất tham khảo

Phổ HPLC của SVN tái sinh

#n vifro và rễ củ sâm Triều Tiên

6.3.2 Định lượng saponin trong SVN

Hàm lượng saponin trong các nguyên liệu và chế phẩm từ SVN quyết định cho việc đánh giá chất lượng của nguyên liệu và các sản phẩm từ sâm Do vậy, theo thời gian và điều kiện trang thiết bị, Trung tâm Sâm đã áp dụng nhiều phương pháp định lượng giản đơn đến các phương pháp hiện đại và chính xác hơn Các phương pháp đã áp dụng bao gồm: phương pháp cân theo Namba, phương pháp đo quang theo Hiai có cải tiến, phương pháp TLC-densitometre,

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp cân

Phương pháp cân được áp dụng trong những năm đầu điều tra phát hiện

SVN (1978-1980).

Lắc với ~BuOH bão hòa nước

Cô cách

thủy

Saponin thô

Phuong pháp đo quang

Dựa theo phương pháp đo quang của S Hiai, 1975, mẫu khảo sát sau khi

xử lý được tạo màu với dung dịch vanilin 8% trong H;ạSO 72% ở 60°C trong 10

phút Phản ứng này bền trong 2 giờ nếu ngâm ống nghiệm trong nước đá lạnh Dung dịch sau phan ứng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng = 554nm

138 SAM VIET NAM

Trong giai đoạn xử lý mẫu nhằm loại bổ ảnh hưởng của phần đường, 3 giải pháp tỉnh khiết hoá mẫu đã được khảo sát là: chiết với ø-BuOH bão hoà nước, SKLM và sắc ký giấy (SKG) Kết quả cho thấy phương pháp xử lý mẫu bằng SKLM và SKG loại bỏ phần đường trong mẫu triệt để hơn, nhất là các dạng chế phẩm có thêm đường trong điều chế Trung tâm Sâm đã lựa chọn phương pháp SKG để xử lý mẫu do tính ổn định của loại giấy Whatman số 3 (Nguyễn Thới Nhâm và cs, 1990) Để cải tiến và rút ngắn thời gian xử lý mẫu, Diaion H-20 cũng được áp dụng có biệu quả trong việc loại bổ phần đường

trong mẫu (Trần Công Luận và cs, 2002) Phương pháp đo quang được Trung tâm Sâm áp dụng thường xuyên trong các nghiên cứu xác định hàm lượng

saponin toàn phần trong nguyên liệu và các dạng chế phẩm đã được sản xuất tại trung tâm Một số kết quả phân tích định lượng được giới thiệu sau đây:

- Kết quả khảo sát hàm lượng saponin trong các bộ phận dùng của SVN hoang đại (quy chiếu theo đường chuẩn majonosid-M2)

Bảng 52 Hàm lượng saponin toàn phần trong các bộ phận dùng của SVN