BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN

- Thực hiện được thao tác chuẩn bị môi trường, cấy giống vi sinh vật và nuôi cấy.. - Phân tích được sự thay đổi của các thông số trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn lactid.. Các phân tử

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG



BÁO CÁO THỰC HÀNHMÔN: CÔNG NGHỆ LÊN MEN

MODULE 1 SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC 1 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ACID LACTIC

1 Cơ sở lý thuyết

1.1 Mục tiêu

- Xác định được điều kiện, môi trường cần thiết để lên men thu acid lactid.

- Thực hiện được thao tác chuẩn bị môi trường, cấy giống vi sinh vật và nuôi cấy.

- Phân tích được sự thay đổi của các thông số trong canh trường nuôi cấy vi

khuẩn lactid

- Thực hiện được thao tác thu nhận sản phẩm acid lactid.

1.2 Lên men lactic

- Acid lactic là một loại acid hữu cơ tự nhiên được sử dụng nhiều trong côngnghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm và dược phẩm Được sản xuất thương mại nhờ lênmen cacbohydrate

- bằng vi khuẩn lactic Lên men lactic là một trong những loại hình lên men pháttriển nhất trong tự nhiên

- Lên men lactic là quá trình trao đỏi năng lượng Các phân tử ATP được hìnhthành trong quá trình chuyển hóa cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ kaij trong tếbào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, cácsản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men.Kết quả là hàm lượng acid tích lũy trong môi trường lên men ngày càng làm giảm pHmôi trường và kéo theo các biến đổi hóa lý khác

- Lên men lactic đồng hình: quá trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành

chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvate được huyến hóa thành acidacetic,ethanol, CO2,acetoin

- Các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lactobacillus casei, Lactobacillus cremoris, L bulgaricus, L delbrueckii

- Lên men lactic dị hình: chỉ có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic,

ngoài ra còn có các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm.Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rươu ethylic 10%, acid lactic 10%, các loại khí20%

1.3 Vi khuẩn lactic

- Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩnGram (+) không di động, thuộc nhóm yếm khí, không chứa cytochrome và enzymecatalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxidase rất mạnh.

- Vi khuẩn lactic có đa dạng, tế bào hình cầu hoặc hình que

1.4 Cơ chế quá trình lên men acid lactic

Acid lactic được tạo thành qua quá trình lên men đồng hình như sau:

2.

1.5 Nguyên liệu

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều nguồn đường như lactose, glucose,

galactose, maltose, dextrin, thậm chí L delbrueckii có khả năng đồng hóa cả tinh bột.

Acid pyruvic

Acid lactic

Trong sản xuất công nghiệp người ta sử dụng mật rỉ đường để lên men vì rẻ tiền,

dễ kiếm Trước tiên mật rỉ cần được xử lí để tẩy màu và tách các chất keo trong mật rỉ

Xử lí màu người ta dùng than hoạt tính Mật rỉ pha loãng tỉ lệ 1:3, sau đó cho chảyqua cột than hoạt tính Than hoạt tính sẽ hấp thụ các chất màu Sau đó làm loãng mật rỉđến khi nồng độ chất khô 15% và dùng H2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hóamôi trường H2SO4 có saccharose thành đường nghich đảo giúp quá trình lên men saunày tốt hơn Trong giai đoạn này người ta đun dung dịch ở 90-95 C trong 6 giờ.⁰

27 Đũa thủy tinh Dài 2 cái Tổ

2.3 Thiết bị

STT Tên thiết bị Quy cách Số lượng/ĐVT Ghi chú

Thu nhận acid lactic

Acid lactic thô

Xác định hàm lượng acid lacticGiống vi khuẩn lactic

4.1 Lập đường chuẩn acid lactic

Bước 1 Pha 1 ml acid lactic chuẩn và 9 ml nước cất để được stock nồng độ 120g/L (khối lượng riêng acid lactic là 1,2g/ml)

Bước 2 Pha loãng stock để được dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10(g/L)

Bước 3 Hút 50µl dung dịch acid lactic nồng độ khác nhau cho vào mỗi ốngnghiệm

Bước 4 Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào mỗi ống nghiệm trên

Bước 5 Lắc đều và đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% được dùng là trắng mẫu),điển kết quả vào bảng

Bảng 1 Xây dựng đường chuẩn acid lactic

OD390

Bước 6 Vẽ đường tương quan giữa giá trị OD390 và nồng độ acid lactic tương ứng

4.2 Lên men thu nhận acid lactic

Bước 1 Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic và dung

K2HPO4AgarNước

10g10g5g20g1g2g5g0,1g0,05g2g15g1000mL

Bảng 3 Môi trường lên men acid lactic

GlucoseCao nấm menNatri acetate

K2HPO4Nước cất

pH cuối 6,5

10g5g5g2g1000mL

Mỗi lớp pha:

− 1000 mL môi trường lên men đưa vào fermenter

− 250 mL NaOH 2M

− 250 mL H2SO4 2M

Bước 2 Bao gói giấy và bịt nắp dụng cụ và môi trường

Bao gói 2 pipet 10mL, dụng cụ chứa môi trường, đầu típ

Bước 3 Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ ở 1210C, 20 phút

Bước 4 Vệ sinh khu vực thao tác bằng cồn 700 và lấy môi trường để nguội

Bước 5 Kiểm tra giống Lactobacillus acidophillus (*)

Kiểm tra trạng thái tế bào, xác định mật độ bằng phương pháp đo độ đục

(*) giống Lactobacillus acidophillus cần được nhân giống trong môi trường lỏng MRS

trước đó 24 giờ

Bước 6 Cấy giống Lactobacillus acidophillus từ môi trường MRS ở fermenter với tỷ

lệ 5%

Bước 7 Cài nhiệt độ lên men 35oC, pH =6 Cài đặt tốc độ bơm acid và base 0,5 ml/s

Bước 8 Kiểm tra các thông số (2h một lần, điểm cuối là 46h) : nồng độ sinh khối,hàm

lượng acid lactic(g/L)

Xác định nồng độ acid lactic bằng phương pháp quang phổ

Nguyên tắc: Phản ứng giữa sắt (III) chloride với acid lactic trong môi trường dungdịch sẽ tạo thành sắt (III) lactate có màu xanh hơi vàng, hấp thụ cực đại ở bước sóng

− Dựa vào đường chuẩn tương quang giữa OD 390 nm và nồng độ acid lactic để xácđịnh nồng độ acid lactic trong canh trường.

5 Kết quả và thảo luận

 Nuôi cấy Lactobacillus casei

Hình 1 Vi khuẩn Lactobacillus casei

Nhận xét: Sau khi khi thực hiện cấy ria vi khuẩn lactic trên môi trường MRS,khuẩn lạc có dạng hình cầu, màu trắng đục, phân lập riêng biệt trên bề mặt môi trườngnuôi cấy

 Tiêu bản nhuộm Gram nấm men

Hình 2 Tiêu bản nhuộm Gram vi khuẩn Lactobacillus casei

 Xây dựng đường chuẩn acid lactic

Lập đường chuẩn sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Bảng 4 Kết quả đo OD sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

OD390 0,042 0,085 0,124 0,282 0,434 0,819

Hình 3 Đường chuẩn acid lactic

 Lên men thu nhận acid lactic

- Kết quả đo OD

Bảng 5 Kết quả đo OD lên men thu nhận acid lactic

OD 390 nm 0 0,159 0,620 0,968 0,603 0,521 0,511 0,544 0,549

Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn acid lactic: y = 0,0766x + 0,0603 suy

ra hàm lượng acid lactic:

Thời điểm lấy

Đồ thị khảo sát sinh khối và hàm lượng acid lactic theo thời gian

Hàm lượng acid lactic Sinh khốiHình 4 Đồ thị khảo sát sinh khối và hàm lượng acid lactic theo thời gian

MODULE 2 SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC 2

NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP GIBBERELLINS TỪ NẤM MỐC GIBBERELLA

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hình 1 Tiểu bào tử (microconidii) và đại bào tử (macroconidii) của Gibberella

fujikuroi

Gibberella fujikuroi là một mầm bệnh nấm Nó gây ra bệnh bakanae trên cây lúa.

Gạo bị nhiễm bệnh Bakane Một tên khác là bệnh cây giống dại Nó có được tên đóbởi vì hạt giống có thể bị nhiễm bệnh, dẫn đến kết quả khác nhau cho cây Không cónhiều bệnh khởi phát các triệu chứng tương tự như bakanae

Gibberella fujikuroi được biết đến rộng rãi nhất vì khả năng sản sinh bệnh trên lúa,

nhưng lúa mạch, kê, mía và ngô cũng dễ bị ảnh hưởng Trong tất cả các cây bị nhiễmbệnh, các triệu chứng tương tự đã được tìm thấy, mặc dù gạo đã được nghiên cứu chủyếu Triệu chứng rõ ràng nhất của Bakane là dáng vẻ cao lớn của cây Đây là kết quảcủa gibberellin, hoặc hormone tăng trưởng, bệnh tiết ra Sau đó, những cây bị nhiễm

bệnh rất dễ bị loại bỏ, vì chúng thường vươn cao hơn những cây khỏe mạnh cóhormone tăng trưởng thường xuyên được tiết ra Tuy nhiên, cũng có thể xảy ra còi cọc,cùng với bệnh Nhiễm trùng lá của cây, tổn thương rễ hoặc hạt rỗng của cây phát triểnđến khi trưởng thành.

Các gibberelins có một loạt các tác động tới sự phát triển của thực vật Chúng có thể:

- Kích thích phát triển của thân cây nhanh chóng,

- Kích thích quá trình phân bào trong lá của một số thực vật,

- Tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt

Tính ứng dụng của gibberellins rất đa dạng, các gibberellins khác nhau kích thích

sự tăng trưởng các bộ phận khác nhau trên thực vật và có hiệu quả trong những giaidoạn khác nhau trong chu kỳ tăng trưởng của cây trông Ví dụ: gibberellin A3 (GA3)chủ yếu là kích sự tăng trưởng của thân cây và lá, trong khi GA4 và GA7 chủ yếu làkích thích ra hoa phát triển quả Hỗn hợp GA4 và GA7 đã dược sử dụng thành côngtrên táo, lệ và nho để tăng kích thước quả, tạo quả không hạt và thúc quả mau chín.Gibberellins đôi khi được sử dụng trong phòng thí nghiệm và các nhà kính để kíchthích sự nảy mấm của hạt Nó cũng được dùng rộng rãi trong ngành trồng nho như làhormon để thúc sự sản sinh các chùm quả và các quả nho to, đặc biệt là nho không hạtThompson, và tại khu vực thung lũng Okanagan (Canada), nó được dùng trong ngànhtrồng anh đào như là chất điều hòa tăng trưởng

1.2.2 Đặc điểm gibberellin

Hình 2 Cấu tạo hóa học của GA3Gibberellin là một hoóc môn thực vật có tác dụng điều chỉnh sự phát triển ở thựcvật và có ảnh hưởng tới một loạt các quá trình phát triển như làm cho thân dài ra, nảymầm, ngủ, ra hoa, biểu hiện gen, kích thích enzym và tình trạng già yếu của lá cũngnhư quả,…

Gibberellin lần đầu tiên được nhà khoa học người Nhật Bản là Eiichi Kurosawaghi nhận vào năm 1926, khi ông nghiên cứu bệnh bakanae (lúa von) ở lúa.[1][2] Chấtnày kích thích cây lúa phát triển rất cao, các lóng dài ra, thân cây nhỏ lại, màu xanhcủa cây ngả dần sang xanh vàng hoặc trắng Người Việt Nam gọi đây là bệnh "lúavon".

Những giberelin được Teijiro Yabuta kết tinh đầu tiên là vào năm 1935 từ chủng

nấm Gibberellin fujikuroi do Kurosawa cung cấp, khi đó ông đã kết tinh được hai dạng

gibberellin và gọi chúng là gibberellin A và B

Gibberellin là chất trao đổi thứ cấp, có chức năng của một hoóc môn thực vật, kíchthích sinh trưởng thực vật Thực vật chứa các gibberellin như những nội hoóc môn.Người ta còn thấy trong thực vật bậc cao, nó có đặc tính điều chỉnh sinh trưởng củathực vật Một lượng rất nhỏ gibberellin cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng vàphát triển thực vật, nhưng chúng không có tác dụng đối với động vật và vi sinh vật

 Cơ chế sinh tổng hợp gibberellin

Quá trình sinh tổng hợp gibberellin của nấm G fujikuroi và thực vật bậc cao có thể

chia thành 3 giai đoạn chính :

- Chuyển hóa mevalonic acid thành ent - kaurene

- Chuyển hóa ent - kaurene thành gibberellin prototype , GA32 – aldehyde.

- Chuyển hóa GA12 - aldehyde thành C20 – rồi thành C19 - GA với con đường

không 13 - hydroxyl hóa và con đường 13 - hydroxyl hóa sớm ở các vị trí khácnhau và sau cùng thành các dạng GA khác nhau

1.2.3 Nguyên liệu

Nguồn cacbohydrate: rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột,…

Bảng 1 Môi rường giữ giống PDAKhoai tây

DextroseCao nấm menAgarNước

200g20g0,1g20g1000mlBảng 2 Môi trường lên men: Sanchez – peptone

2g2,6g0,5g0,2g

1.2.4 Phương pháp lên men

Phương pháp lên men theo chu kì (batch culture)

3 Quy trình công nghệ

Quy trình nuôi cấy:

4 Các bước thực hiện và phương pháp phân tích

4.1 Các bước thực hiện

Bước 1 Pha chế môi trường nuôi cấy

Bảng 3 Thành phần môi trường sinh tổng hợp gibberellin

DextronePeptone

NH4NO3

KH2PO4

100g2g2,60,5gGibbrelin thô

(d

Theo dõi các

thông số lên men

theo thời gian

Thử nghiệm hoạt tính GA3 (Nảy mầm hạt đậu)

pH cuối

0,2g1000ml5,2Cho 250ml môi trường vào 2 bình tam giác 500ml và 50ml môi trường vào 2 bìnhtam giác 100ml

Bước 2 Bao gói giấy và bịt nắp dụng cụ và môi trường Bao giấy báo 2 ống hút 10ml, bịt nắp 2 bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy và nhét nút bông

Bước 3 Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ ở 1210C, 20 phút

Bước 4 Chuẩn bị giống:

Tổ hóa chất pha 500ml môi trường PDA rồi hấp khử trùng ở 1210C, 20 phút Đổ

đĩa petri Cấy chấm điểm Gibberella fujikuroi vào Ủ nuôi ở 280C trong 3 - 5 ngày, theo dỗi sợi nấm lan trong môi trường

Bước 5 Nhân giống cấp 1

- Dùng dao mổ vô trùng cắt thạch có sợi nấm trên đĩa petri cấy chấm điểm thành

Bước 6 Kiểm tra lượng mốc giống Gibberella fujikuroi;

Kiểm tra trạng thái sinh khối khuẩn ty

Bước 7 Cấy giống theo tỷ lệ 10% (v/v) vào môi trường nuôi cấy trong tam giác 500ml mỗi nhóm 1 bình

Bước 8 Nuôi cấy trên máy lắc ở 300C, lắc 60 rpm hoặc trong SSF bioreactor.Bước 9 Kiểm tra các thông số sau 24h nuôi cấy, vẽ đồ thị

Mỗi tổ theo dõi 1 mốc thời gian.

Thực hiện nuôi cấy, kết thúc thu nhận GA3

THU NHẬN GIBBERELLINS

Bước 10: Thu hồi dịch lên men

Bước 11: Xây dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng GA3

 Pha chế thuốc thử phosphor molybdic

 Chuẩn bị dung dịch Stock GA3:

Cân 0,2g GA3 dạng bột cho vào becher chứa 40 ml nước cất 2 lần, khuấy đều chotan Sau đó chuyển toàn bộ lượng dung dịch này vào bình định mức 50 ml Bổ sungnước cất 2 lần vào cho đủ 50 ml Lắc đảo để có sự hòa trộn dung dịch và nước cất.Cho toàn bộ dung dịch mới pha vào lọ thủy tinh sẫm màu và bảo quản trong tủ lạnh.Dung dịch này là dung dịch Stock GA3 với nồng độ 4000 µg/ml.

 Dựng đường chuẩn GA3 chuẩn nồng độ 0,01 - 0,1 (g/l).

Chuẩn bị 11 ống nghiệm đánh số tương ứng từ 0 - 10

Hút 2 ml dung dịch Stock GA3 hòa với 18ml nước cất, lắc đều, thu được 20 mldung dịch GA3 chuẩn nồng độ 400 µg/ml (dung dịch 1)

Cho vào mỗi ống nghiệm các thành phần và thể tích như sau:

STT ống

nghiệm

Nồng độ GA3 (g/l)

Dung dịch 1 (µl)

Nước cất (µl) Thể tích dung

dịch phosphor molybdic (ml)

Tất cả ống nghiệm được lắc đều, bọc giấy nhôm và đun cách thủy trong thời gian

10 phút Thời gian được tính sau khi bỏ ống nghiệm vào cốc nước đang sôi 2 phút.Sau khi đun, chuyển toàn bộ ống nghiệm vào cốc nước lạnh nhằm hạ nhiệt độnhanh Đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 660 nm

 Xác định GA3 trong mẫu

− Canh trường từ các bình lên men được lọc qua giấy lọc để loại bỏ bớt sợi nấm.

Dung dịch sau lọc tiếp tục được chuyển vào các ống ly tâm và ở chế độ 6000

vòng/ phút trong 15 phút để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm và bào tử trong dịch lênmen.

− Chỉnh pH canh trường, pH = 1-2 bằng HCl đậm đặc.

− Hút 10 ml canh trường sau khi chỉnh pH vào phễu chiết, tiếp tục cho vào phễu

chiết 10 ml ethyl acetate (EtOAc), lắc mạnh 60s để có sự tiếp xúc giữa 2 pha

Để yên trong 10 phút để tách pha hoàn toàn, thu dịch nổi phía trên chuyển sangphễu chiết mới

− Lặp lại như vậy thêm 2 lần nữa Toàn bộ ethyl acetate thu được tiếp tục trích ly

với đệm phosphate pH = 7,4

− Hút 10 ml đệm phosphate cho vào 30 ml ethyl acetate, lắc nhẹ trong 1 phút, để

yên trong 10 phút Toàn bộ GA3 được hấp thụ vào đệm phosphate bên dưới, do

đó hút bỏ lớp ethyl acetate phía trên Để ở nhiệt độ phòng khoảng 2h để lượtethyl acetate bốc hơi khỏi hỗn hợp dung dịch

− Chuẩn bị 2 ống nghiệm: hút 2 ml đệm phosphate sau trích ly cho vào 2 ống

nghiệm, thêm 2 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm, lắc đều

− Tiếp tục thêm vào mỗi ống 6 ml thuốc thử phosphor molybdic, lắc đều

− Đun cách thủy ở nhiệt độ 95-100oC trong 10 phút Thời gian được tính từ lúcnhiệt độ của nước bên trong và ngoài ống nghiệm bằng nhau (khoảng 2 phút)

− Sau khi đun, làm lạnh nhanh Đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 660nm.

5 Kết quả và thảo luận

5.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp GA3

 Nuôi cấy nấm mốc Gibberella fujikuroi

Hình 3 Nấm mốc Gibberella fujikuroi

Nhận xét: Nấm mốc sau khi thực hiện cấy điểm trên môi trường PDA có hình thái

là dạng sợi, màu trắng, phân bố đều trên bề mặt môi trường cấy

 Tiêu bản nấm mốc Gibberella fujikuroi

Hình 4.Tiêu bản tế bào nấm mốc Gibberella fujikuroi

5.2 Thu nhận GA3

Khối dịch lên men thu được: 56,019 g

Khối lượng sinh khối sau lên men: 0,196 g

 Xây dựng đường chuẩn GA3

Hình 5 Dung dịch sau khi cho thuốc thử phosphor molybdic