THỰC HÀNH MÔN HỌC CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG ĐIỀU KIỆN LÊN MEN BATCH VÀ FED BATCH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG ĐIỀU KIỆN LÊN MEN BATCH VÀ FED-BATCH Nguyễ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN HỌC CÔNG NGHỆ LÊN MEN

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

BATCH VÀ FED-BATCH

GVHD: PGS.TS Trịnh Khánh Sơn SVTH:

1 Nguyễn Thị Mỹ Uyên 18116226

2 Đặng Lê Phương Thảo 18116205

3 Trần Thị Phương Nhi 18116192

4 Trần Thị Phượng 18116200

5 Nguyễn Thị Xuân Quyền 18116202

TP Hồ Chí Minh – 04/2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG ĐIỀU KIỆN LÊN MEN BATCH VÀ FED-BATCH

Nguyễn Thị Mỹ Uyên (18116226), Đặng Lê Phương Thảo (18116205), Trần Thị Phương Nhi (18116192), Trần Thị Phượng (18116200), Nguyễn Thị Xuân Quyền

(18116202) Tóm tắt

Nghiên cứu khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của chúng nấm men Saccharomyces Cerevisiae trong các điều kiện lên men batch và fed batch cho thấy việc bổ sung thêm cơ chất tại nhiều thời điểm hơn trong điều kiện nuôi cấy fed batch cho kết quả nấm men sinh trưởng tốt hơn và chiều dài pha sinh trưởng sẽ dài hơn so với các điều kiện lên men khác

đã được khảo sát

Keywords: Saccharomyces Cerevisiae, batch fermentation, fed – batch fermentation

1 Giới thiệu

Saccharomyces Cerevisiae, thường biết đến như loại nấm men chính được sử dụng trong công nghệ sinh học trên toàn thế giới, phần lớn là do đặc tính sinh lý học độc đáo của

nó và các vai trò quan trọng liên quan đến quá trình lên men thực phẩm, các quy trình công nghiệp khác (Phaff et al, 2011)

Saccharomyces Cerevisiae là sinh vật nhân chuẩn đơn bào trải qua nhiều quá trình sinh học giống như con người, S Cerevisiae sinh sản cả hữu tính và vô tính, nấm men sinh sản

vô tính thông qua quá trình được gọi là nảy chồi (Drosophila and C Elegans, 2014) Nấm men vô cùng linh hoạt, có hàng ngàn loại và chủng khác nhau, mỗi loại có cấu tạo gen riêng nhưng điểm hấp dẫn nhất chính là việc có thể tùy chỉnh bộ gen của chúng và thứ hai chúng an toàn, hầu hết các men đều vô hại trừ một số trường hợp có thể gây kích ứng nhẹ cho da (Christopher Beam, 2009) Thời gian nhân đôi của nấm men ở 30℃ là 1,25 – 2 giờ

và quan trọng là có thể được nuôi cấy dễ dàng Do đó chúng có thể sản xuất nhanh chóng

và duy trì được nhiều chủng chỉ với chi phí thấp (G.G Stewart, 2014)

S Cerevisiae có thể tồn tại ở hai dạng đơn bội và lưỡng bội (Landry và cộng sự, 2006),

ở pha lũy thừa, tế bào đơn bội sinh sản nhiều hơn tế vào lưỡng bội Giống như tất cả các loại nấm khác, hình dạng tế bào dựa trên thành tế bào của nó (Cabib và cộng sự, 1991)

2 Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu

Giống vi sinh vật: Nghiên cứu này sử dụng chủng nấm men Saccharomyces Cerevisiae (nấm men bánh mì) dạng instant dry yeast

Môi trường nuôi cấy: bao gồm các chất dinh dưỡng cung cấp cho quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm men và các chất có nhiệm vụ điều chỉnh áp suất thẩm thấu, pH của môi trường tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các tế bào của nấm men Môi trường được sử dụng

để nuôi cấy nấm men phải chứa đầy đủ các nguồn C, N cần thiết cho nấm men như protein, đường, các vitamin, muối khoáng, …và phải được tiệt trùng trước khi sử dụng

Môi trường nhân giống: Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường M1d bao gồm các thành phần với hàm lượng sau:

- Dịch chiết giá đỗ (1000ml)

- Saccharose (100g/L): là một disaccharide được tạo thành từ các đơn vị hexose (một phân tử glucose và một phân tử fructose) Các liên kết hóa học của saccharose có thể bị phá vỡ tương đối dễ dàng (ví dụ do nấm men Saccharomyces cerevisiae) tạo ra glucose tự

do và sẵn sàng để lên men trong quá trình tạo ra ethanol (M Arshadi & H Grundberg, 2011)

- Peptone (1g/L): Là một môi trường phát triển vi sinh vật bao gồm chất tiêu hóa peptit của mô động vật và Sodium Chloride Chỉ số pH của môi trường là 7.2 ± 0.2 ở 25℃ và rất giàu tryptophan Pepton cũng là một môi trường giàu giất dinh dưỡng không chọn lọc và

có thể được sử dụng như một môi trường làm giàu chính cho sự phát triển của vi khuẩn (Baird và cộng sự, 1987) Peptone được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1914 và trở thành peptone tiêu chuẩn để điều chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn Peptone được sử dụng làm nguồn nitơ hữu cơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh để nuôi cấy nhiều loại vi khuẩn và nấm.Ví dụ, Peptone được sử dụng trong môi trường nuôi cấy hai vi khuẩn Archaea kị khí, cực kì ưa nhiệt là Thermococcus celer and Pyrococcus woesei (Blamey và cộng sự, 1999) Môi trường M1d sau khi chuẩn bị xong được điều chỉnh pH bằng dung dịch H2SO4 0.1N sao cho pH đạt 4.0 Sau đó, tiến hành tiệt trùng môi trường nuôi cấy bằng nồi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút

2.2 Phương pháp

Nhân giống: 0.1g nấm men được nhân giống trong bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường M1d (đã được tiệt trùng) trên thiết bị có khuấy từ ở nhiệt độ phòng với tốc độ khuấy từ khoảng 120rpm, thời gian nhân giống là 24h

Lên men batch (mẻ)

Lên men theo mẻ là một quá trình trong đó tất cả cơ chất và chất dinh dưỡng được bổ sung vào tại thời điểm 0 hoặc ngay sau khi quá trình cấy diễn ra và bình được để trong một môi trường được kiểm soát cho đến khi đạt được nồng độ sản phẩm cuối cùng tối đa

(W.M.M Ingledew & Y.-H Lin, 2011) Lên men theo mẻ là phương pháp lên men sử dụng "hệ thống khép kín", tại đó cơ chất và vi sinh vật sinh ra được thêm vào hệ thống tại thời điểm 0 và không bị loại bỏ cho đến khi quá trình lên men hoàn tất Đây là phương pháp lên men đơn giản nhất và được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất vi khuẩn (D.G Burke và cộng sự, 2013)

Lên men theo mẻ được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì nó dễ vận hành và ít nguy

cơ ô nhiễm (Lee et al., 2008) Tuy nhiên, nó có một số hạn chế như năng suất thấp và sản lượng thấp do ức chế sản phẩm (Maiti và cộng sự, 2016) Lượng dung môi tạo ra từ quá trình lên men theo mẻ thường nhỏ hơn 20 g/L Quá trình nuôi cấy mẻ trong bình tam giác 250ml Hút 2ml dịch nấm men đã được nhân giống sau 24h và cho bào bình tam giác chứa 198ml môi trường M1d đã được tiệt trùng Tiến hành quá trình lên men mẻ trên thiết bị có khuấy từ ở nhiệt độ phòng

Lên men Fed-batch (bổ sung cơ chất)

Lên men mẻ bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong bình nuôi cấy Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên men Các cơ chất khi được

bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn Đối với cơ chất giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban đầu hoặc (3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc (TS Hoàng Văn Quốc Chương, 2016)

Hệ thống mẻ bổ sung theo cách (1), (2) gọi là mẻ bổ sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ bổ sung cố định thể tích

Bổ sung môi trường nuôi cấy Md1 vào môi trường nuối cấy chứa nấm men theo từng thời điểm khác nhau với từng lượng môi trường khác nhau thông qua các thí nghiệm fed batch 1, fed batch 2 và fed batch 3

 Fed batch 1: Tại giờ thứ 0 với môi trường M1d (đã chuẩn bị như trên) Tại giờ thứ

5 bổ sung thêm 100ml môi trường M1d đã tiệt trùng

 Fed batch 2: Tại giờ thứ 0 giờ với môi trường M1d (đã chuẩn bị như trên) Tại giờ thứ 5 bổ sung thêm 50ml môi trường M1d đã tiết trùng Sau đó, tại giờ thứ 7 bổ sung thêm 50ml môi trường M1d

 Fed batch 3: Tại giờ thứ 0 giờ với môi trường M1d (đã chuẩn bị như trên) Tại giờ thứ 5 bổ sung thêm 50ml môi trường M1d đã tiệt trùng Tại giờ thứ 7 bổ sung thêm 50ml môi trường M1d Tại giờ thứ 9 bổ sung thêm 80ml môi trường M1d

Kỹ thuật nuôi cấy

Xác định mật độ tế bào: Kiểm soát chất lượng nấm men thông qua số lượng tế bào trên một ml dung dịch bao gồm số lượng tế bào sống, tế bào chết và tế bào nảy chồi bằng buồng đếm hồng cầu Các tế bào sống được xác định bằng cách nhuộm màu xanh

methylene (ASBC, 1992), đếm số lượng men chết và tổng số ở buồng đếm Các tế bào nấm men sống chứa một enzyme làm mất màu của methylene blue, trong khi các tế bào chết thì không Để phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết bằng cách kiểm tra chúng một cách hiển nhiên: các tế bào chết được nhuộm xanh và các tế bào sống không có màu (K.Painting

& B.Kirsop, 1990)

Cách tiến hành:

1 Tiến hành pha loãng huyền phù nấm men (sao cho mỗi ô vuông lớn có từ 10 – 50 tế bào)

2 Trộn đều 1ml huyền phù (đã pha loãng) với 1 giọt (~50 µl) dung dịch 0.2%

methylene blue rồi tiến hành lắc đều trên máy lắc trong 30 giây

3 Đậy buồng đếm bằng 1 tấm lamelle

4 Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt một giọt huyền phù nấm men vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với lamelle) Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa buồng đếm và lamelle được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còn các rãnh xung quanh thì không bị dính ướt

5 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, dùng vật kính x10 để quan sát, điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa trập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ Sau đó, tiến hành đếm ô chứa nấm men theo hai đường chéo

6 Kết quả đếm mật độ tế bào chỉ có giá trị trong vòng 3 – 5 phút sau khi cho mẫu vào buồng đếm; phải đếm các tế bào nằm trên hai đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô

7 Từ số lượng tế bào sống, chết, nảy chồi đếm được sẽ tính toán và xác định được mật

độ tế bào/ml, tỉ lệ tế bào sống, tỉ lệ tế bào nảy chồi

Số tế bào nấm men (N) trên 1.0 ml mẫu được tính theo công thức:

𝑁 = (𝑎/𝑏 × 400/0.1)× 103× 10𝑛 Trong đó:

N: là số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm

A: là số tế bào trên 5 ô vuông lớn

B: là số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16 × 5 = 80)

400: là tổng số ô vuông nỏ trong 25 ô vuông lớn

0.1: là thể tích (𝑚𝑚2) mẫu chứa trên ô trung tâm

103 : là số chuyển 𝑚𝑚2 thành ml (103 mm2= 1 ml)

10𝑛 : là độ pha loãng mẫu (độ pha loãng đã bao gồm lượng methylene blue cho vào mẫu)

Phương trình hồi quy của pha log dựa vào công thức:

𝑙𝑛𝑁𝑡= 𝜇𝑡 + 𝑙𝑛𝑁0 (phương trình có dạng: y = ax + b) Trong đó:

𝑁𝑡: là số tế bào ở thời điểm thứ t

𝑁0: là số tế bào ở thời điểm bắt đầu

μ là hằng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng

Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men

Tốc độ phân chia tế bào (μ, h-1) đặc trưng thể hiện sự thay đổi của mật độ tế bào trong một đơn vị thời gian

μ = 0.693/t𝑡𝑑 (tính giữa hai thời điểm)

Hiệu suất tạo thành tế bào trên một đơn vị cơ chất YN/S (cell 𝑮−𝟏 sucrose):

𝑌𝑁/𝑆 =𝑁𝑡− 𝑁0

𝑆0− 𝑆𝑡

Tốc độ đặc trưng tạo thành tế bào QN (cell 𝒈−𝟏 sucrose.𝒉−𝟏)

𝑄𝑁 = 𝜇 × 𝑌𝑁/𝑆

Thời gian thế hệ:

𝑛 = 𝑡

𝑡𝑑

𝑁𝑡= 𝑁0 × 2

𝑡

𝑡 𝑑

Trong đó:

𝑡𝑑: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian thế hệ),

𝑁𝑡: số tế bào ở thời điểm t

𝑁0: số tế bào ở thời điểm bắt đầu (giờ thứ 0)

μ: hằng số tốc độ sinh trưởng (ở đây được xem là tốc độ gia tăng số lượng tế bào trên một đơn vị

số lượng tế bào)

𝑌𝑁/𝑆: hiệu suất tạo thành tế bào (tính theo cơ chất là đường)

𝑆𝑡: nồng độ cơ chất (đường) ở thời điểm t

𝑆0: nồng độ cơ chất (đường) ở thời điểm 0 giờ

Phương pháp xác định lượng đường bằng khúc xạ kế

Nguyên tắc: Khi đi từ môi trường không khí vào môi trường chất lỏng, tia sáng sẽ bị

khúc xạ Nếu chất lỏng là dung dịch chất hoà tan, dựa trên độ lệch của tia sáng, có thể xác định nồng độ chất khô hoà tan trong dung dịch

Tiến hành: Sử dụng khúc xạ kế ATAGO để xác định % Sucrose có trong huyển phù vi

sinh vật Kỹ thuật viên sẽ dùng pipet lấy 5ml cho vào ống ly tâm và đun cách thủy trong 10 phút để ức chế hoạt động của nấm men Sau đó, ống được tiến hành ly tâm ở 3000 rpm trong 15 phút để các tế bào chết lắng xuống đáy Cuối cùng sẽ sử dụng micropipet để lấy dung dịch và đo °𝐵x

3 Kết quả và bàn luận

3.1 Kết quả

Hình 1 Đồ thị so sánh mật độ tế bào của bốn kiểu lên men

Hình 2 Đồ thị so sánh tỉ lệ phần trăm tế bào sống của bốn kiểu lên men

Hình 3 Đồ thị so sánh tỉ lệ phần trăm tế bào nảy chồi của bốn kiểu hình lên men

Hình 4 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường mà nấm men tiêu thụ trong quá trình lên

men của 4 kiểu hình lên men

Hình 5 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng của S.Cerevisiae của 4 kiểu hình lên men

3.2.Bàn luận

3.2.1 Ảnh hưởng của quá trình lên men Batch đến sự sinh trưởng và phát triển

của nấm men Saccharomyces Cerevisiae

Theo số liệu được trình bày ở Hình 1, có thể thấy được sự sinh trưởng của nấm men trong quá trình lên men batch được thể hiện thông qua các giai đoạn sau: pha lag (0-2 giờ), pha log (2-10 giờ) và pha ổn định (từ giờ thứ 10)

Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình lên men (pha lag), các tế bào nấm men hoạt động

về mặt trao đổi chất và chỉ tăng kích thước tế bào mà không tăng về số lượng nên tốc độ phân chia tế bào diễn ra chậm Các tế bào nấm men này đang tổng hợp các enzym và các yếu tố cần thiết cho quá trình phân chia tế bào và tăng trưởng số lượng tế bào trong điều kiện môi trường mới Do đó phải mất đến 2 giờ các tế bào nấm men mới bắt đầu chuyển sang pha log, giai đoạn này mật độ tế bào tăng gấp đôi so với 0 giờ

Khi quá trình lên men bắt đầu bước sang giai đoạn tăng trưởng, mật độ tế bào tăng với tốc độ rất nhanh, trong đó số lượng tế bào tăng theo kiểu logarit Khi số lượng tế bào phát triển,vi khuẩn tiêu thụ các chất dinh dưỡng có sẵn và tạo ra các chất thải Khi nguồn cung cấp dinh dưỡng bị cạn kiệt, do đó pha log kéo dài đến giờ thứ 10 thì tốc độ phát triển bước vào giai đoạn pha ổn định, trong đó số lượng tế bào vi khuẩn sống sót vẫn giữ nguyên Lượng đường được sử dụng bời nấm men trong suốt quá trình lên men được thể hiện ở Hình 4 Hàm lượng đường từ 0-2 giờ giảm rất chậm do các tế bào nấm men đang thích nghi với điều kiện môi trường, sau đó nó giảm xuống do nấm men đã thích nghi và sử dụng cơ chất, lúc đó mật độ tế bào tăng cũng như tỉ lệ tế bào nảy chồi cũng tăng theo

Dựa trên Hình 3, ta có thể nhận thấy trong giai đoạn đầu, ở tất cả các nồng độ đường đều

có sự gia tăng của tỉ lệ tế bào nảy chồi Lượng tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt cực đại trong giai đoạn gần cuối pha log và có chiều hướng suy giảm ở pha ổn định (Kara Rogers, 2006)

3.2.2 Ảnh hưởng của quá trình lên men Fed batch đến sự sinh trưởng và phát

triển của nấm men Saccharomyces Cerevisiae

Quá trình lên men batch được thực hiện trước quá trình lên men fed batch để so sánh mật

độ tại thời điểm bắt đầu của quá trình lên men Theo kết quả đường cong sinh trưởng ở Hình

1, ở thời điểm đầu của quá trình lên men fed batch 1, 2 và 3 so với lên men batch từ 0 đến 5 giờ, có thể thấy mật độ tế bào cũng như tỉ lệ nảy chồi và tỉ lệ tế bào sống đều tương tự nhau Tuy nhiên sau giờ thứ 5 khi bổ sung thêm môi trường vào, mật độ tế bào giảm do bị pha loãng khi bổ sung thêm môi trường vào sau đó mật độ tế bào và tỉ lệ nảy chồi của lên men

fed batch 1, 2 và 3 tăng nhanh Sau mỗi lần bổ sung môi trường thì mật độ tế bào tăng nhanh chống so với lên men batch

Đường cong sinh trưởng và lượng đường được tiêu thụ có mối quan hệ tương quan đến

số lượng tế bào nấm men Cũng giống như lên men batch, số lượng tế bào tăng chậm và lượng đường tiêu thụ giảm rất ít từ 0-2 giờ Sau giờ thứ 2 hàm lượng đường giảm mạnh, hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy giảm theo thời gian dẫn tới đường cong sinh trưởng của quá trình lên men tiến vào giai đoạn ổn định

Tại thời điểm bước vào pha ổn định của ba kiểu fed batch cách nhau 1-2 giờ và pha log của kiểu lên men fed batch 3 kéo dài đến giờ thứ 15 trong khi đó fed batch 2 là giờ thứ 14 còn fed batch 1 là giờ thứ 13 Có thể nhận thấy rõ ràng rằng mật độ tế bào của fed batch 3 cao hơn so với 2 kiểu fed batch còn lại tại thời điểm bước vào pha ổn định của fed batch 1 Nồng độ đường sẵn có trong môi trường lên men là rất cần thiết, ví dụ như nồng độ đường cao trong sản xuất công nghiệp sẽ tăng hàm lượng ethanol cần thu vào khi lên men kết thúc Tuy nhiên, nếu như nồng độ đường cao quá sẽ làm các tế bào nấm men chịu phải áp suất thẩm thấu, có thể làm ảnh hưởng tới hiệu suất lên men (S Ishmayana et al, 2011) và tỉ lệ sống của tế bào sẽ giảm

Đường cong tỉ lệ nảy chồi sinh ra tỷ lệ với đường cong tốc độ sinh trưởng Đặc biệt ở giai đoạn pha log, lượng chồi sinh ra nhiều, tế bào nhanh chóng phân chia tạo ra nhiều tế bào sống mới do đó tỉ lệ tế bào sống cũng tăng theo

Khi tiếp tục bổ sung thêm môi trường vào bình lên men theo chu kỳ thời gian, quá trình lên men sẽ tiếp tục diễn ra mà không có sự xuất hiện của pha suy vong mà đường cong sinh trưởng sẽ tiếp tục kéo dài ở pha ổn định

3.2.3 Thông số động học

Bảng 1 Các thông số động học của quá trình lên men theo bốn kiểu hình lên men

Kiểu lên

men

Thông số

batch 1

Fed batch 2

Fed batch 3

N o (Cell/mL) 2.17x10 6 2.31x10 6 2.03x10 6 2.08x10 6

N t (Cell/mL) 4.14x10 7 10.30x10 7 22.20x10 7 37x10 7