Luận văn cao học chuyên ngành vi sinh vật học

Hơn nữa, đặc điểm các tài nguyên hóa thạch là trong thành phần hóa học đều có chứa các nguyên tố cacbon, hydro, oxy, nitơ, lưu huỳnh, đặc biệt trong than còn có kèm theo chất phóng xạ u

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2014

MỤC LỤC

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03

1.1 Thực trạng nguồn năng lượng thế giới và nhu cầu tìm nguồn

1.2 Hydro là một nguồn năng lượng ưu việt 06

1.3 Một số phương pháp sản xuất hydro sinh hoc

1.3.1 Sản xuất Hydro bằng điện

1.3.2 Sản xuất hydro bởi khí metan (SMR)

1.3.3 Sản xuất Hydro bởi hơi nước của oxy hóa hydrocacbon

08

08

08

08

1.3.4 Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng 08

1.4 Sản xuất H 2 sinh học theo con đường lên men tối 11

1.5 Một số loài vi khuẩn sản xuất hydro thông qua con đường lên

1.6.7 Những đặc điểm của phù hợp với việc sản xuất hydro 18

1.7 Các nguồn nguyên liệu tái sinh 18

2.3 Môi trường nuôi cấy

2.3.1 Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản

2.3.2 Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là bã đậu

2.3.3 Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là glycerol

2.3.4 Môi trường nuôi cấy với cơ chất là rơm, rạ

2.5 Sản xuất hydro trên quy mô lớn sử dụng nồi lên men 5L 28

2.6 Nghiên cứu qúa trình sản xuất hydro liên tục sử dụng nồi lên

men 5 L

29

2.7 Các phương pháp phân tích 30

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nghiên cứu sự tạo thành hydro của chủng Thermotoga

neapolitana DSM 4359 từ các nguồn đường đơn

3.1.1 Hoạt hóa, nuôi cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359

32

32

3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đơn giản đến sự sản sinh

hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359

3.1.3 Khảo sát một số nguồn nitơ phổ biến cho sự sản xuất hydro sinh

học từ chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt DSM 4359 và đánh giá khả

năng sinh hydro

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất hydro của

chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359

41

3.4 Nghiên cứu phương pháp sục khí nitơ làm giảm áp suất khí trong

bình nuôi cấy để tăng hàm lượng hydro

42

3.5 Hàm lượng acid hữu cơ được tạo trong quá trình sản xuất hydro

của T neapolitana

44

3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất vô cơ tới quá trình sản xuất

hydro của T neapolitana

3.6.3 Ảnh hưởng của Na 2 HPO 4 12H 2 O đến sự sinh trưởng và tạo

hydro của Thermotoga neapolitana

47

3.6.4 Ảnh hưởng của NaCl đến đến sự sinh trưởng và tạo hydro của

Thermotoga neapolitana

48

3.7 Bước đầu thăm dò, nghiên cứu sự tạo thành hydro từ nguồn rác

thải nông nghiệp và nguồn phụ phẩm của quá trình sản xuất

bio-diezel nhờ sự lên men kị khí của chủng vi khuẩn DSM 4359

49

3.7.1 Khảo sát và lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào - phụ phẩm của

quá trình sản xuất bio-diezel cho sự tạo thành hydro

49

3.7.2 Khảo sát và lựa chọn loại nguyên liệu đầu vào là chế phẩm phân

hủy lignocellulose từ rơm rạ cho sự tạo thành hydro

53

3.8 Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro bằng phương pháp lên men

theo mẻ có bổ sung (fed-batch culture) sử dụng nồi lên men 5 L

57

3.9 Đánh giá khả năng sử dụng nguyên liệu đầu vào đối với quá trình

sản sinh hydro của chủng vi khuẩn nghiên cứu

MỞ ĐẦU

Thế giới vào những năm đầu của thế kỷ thứ 21 đang đứng trước nhiều vấn đề cần phải đối mặt Trong đó vấn đề thiếu năng lượng là một vấn đề cấp bách mang tính toàn cầu và cần phải sớm có biện pháp giải quyết

Những nguồn năng lượng hóa thạch như than đá, dầu mỏ, khí thiên nhiên thì không phải là vô tận Với sự phát triển của ngành công nghiệp trên thế giới như hiện này thì những nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng cạn kiệt và sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của xã hội cũng như đời sống con người

Hơn nữa, đặc điểm các tài nguyên hóa thạch là trong thành phần hóa học đều

có chứa các nguyên tố cacbon, hydro, oxy, nitơ, lưu huỳnh, đặc biệt trong than còn

có kèm theo chất phóng xạ urani và thori, do đó sử dụng những nguồn nhiên liệu này sẽ gây ra ảnh hưởng lớn đối với môi trường [1]

Việc sử dụng những tài nguyên hóa thạch dưới dạng nhiên liệu đã để lại cho con người và hành tinh chúng ta đang sống những hậu quả vô cùng to lớn Do đó,

về tương lai, các nhà khoa học đang tìm đến những nguồn năng lượng mới có khả năng tái tạo và thay thế những nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt như: năng lượng mặt trời, gió, thủy triều, địa nhiệt, năng lượng nguyên tử và nhiên liệu sinh học…[4]

Trong đó việc khai thác nhiên liệu sinh học là một phương thức tạo ra năng lượng rất được quan tâm hiện nay vì hiệu suất cao, ít tốn kém và thân thiện với môi trường [4] Điển hình là việc khai thác nguồn năng lượng hydro sinh học - một nguồn năng lượng thay thế sạch vô cùng ưu thế trong tương lai từ chủng vi sinh vật

kị khí ưa nhiệt cao Thermotoga neapolitana DSM 4359[20]

Đây là một hướng đi mới mẻ và đầy triển vọng nhưng cũng không kém

phần khó khăn và nhiều thách thức Do đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu quá trình sản xuất hydro sinh học từ rác thải nông nghiệp nhờ chủng vi

khuẩn ƣa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng được quy trình sản xuất hydro sinh học từ một số cơ chất khác nhau

như (glycerol, xylose, glucose…)

2 Đưa ra kết quả thăm dò một số nguồn phế thải nông nghiệp làm nguyên liệu

đầu vào cho quá trình sản xuất hydro sinh học nhờ sự lên men của vi khuẩn kị

khí ưa nhiệt Thermotoga neapolitana DSM 4359

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực trạng nguồn năng lượng thế giới và nhu cầu tìm nguồn năng lượng thay thế

Năng lượng là vấn đề sống còn của toàn nhân loại Con người đang khai thác đến mức cao nhất các nguồn năng lượng hóa thạch (dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá…), nhưng lượng dự trữ của các nguồn nhiên liệu này ngày càng cạn kiệt với tốc

độ phi mã! Theo các số liệu đánh giá gần đây nhất, tổng dự trữ nguồn năng lượng hóa thạch bao gồm dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá trên toàn thế giới hiện nay nếu qui đổi ra than khoảng 1.279 GTCE (GTCE- Giga Tonnes Coal Equivalent, tương đương 1 tỉ tấn than), trong đó dầu mỏ khoảng 329 GTCE, khí thiên nhiên khoảng

198 GTCE, than đá khoảng 697 GTCE Như vậy, nếu với mức khai thác và sử dụng hằng năm như hiện nay: dầu mỏ 5,5 GTCE/năm, khí thiên nhiên 3,0 GTCE/năm, than đá 4,1 GTCE/năm thì lượng tài nguyên hóa thạch còn lại chỉ đủ dùng cho 42 năm đối với dầu mỏ, 65 năm đối với khí thiên nhiên và 170 năm đối với than đá; đó

là chưa kể nhu cầu năng lượng bao giờ năm sau cũng tăng hơn năm trước nên thời gian còn lại sẽ còn ngắn hơn dự báo [1]

Việc sử dụng quá nhiều năng lượng hóa thạch đã khiến cho môi trường trái đất của chúng ta bị ảnh hưởng nghiêm trọng như ô nhiễm không khí, nước, tiếng ồn, mưa acid, mực nước biển dâng do băng tan…, điển hình là hiện tượng ấm lên toàn cầu do tác động của hiệu ứng nhà kính và sự khủng hoảng về năng lượng Theo dự báo của Cơ quan thông tin về năng lượng (EIA) vào năm 2004, trong vòng 24 năm

kể từ năm 2001 đến năm 2025, mức tiêu thụ năng lượng trên toàn thế giới có thể tăng thêm 54% (ước tính khoảng 404 nghìn triệu triệu Btu (British Thermal Unit) năm 2001 tới 623 Btu vào năm 2025) mà nhu cầu chủ yếu sẽ rơi vào các quốc gia

có nền kinh tế đang phát triển mạnh mẽ, ví dụ như Trung Quốc hay Ấn Độ ở châu Á [1]

Một cách cụ thể về vấn đề nhu cầu năng lượng của Thế giới thì có 3 điểm chúng ta cần lưu ý Một là, nhu cầu về năng lượng của thế giới tiếp tục tăng lên đều đặn trong hơn hai thập kỷ qua Hai là, nguồn năng lượng hóa thạch vẫn chiếm 90% tổng nhu cầu về năng lượng, cho đến năm 2010 Thứ ba là, nhu cầu đòi hỏi về năng lượng của từng khu vực trên Thế giới cũng không giống nhau [30, 31]

Các nguồn năng lượng hóa thạch trên thế giới đang dần cạn kiệt, thêm nữa là những vấn đề môi trường nảy sinh trong quá trình khai thác đã dẫn đến việc khuyến khích sử dụng năng lượng hoàn nguyên để giảm bớt sự ô nhiễm môi trường và tránh gây cạn kiệt nguồn năng lượng hóa thạch Nhưng do chưa có những điều luật cụ thể

về vấn đề này, nên dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên vẫn được coi là nguồn nhiên liệu chủ yếu để nhằm thỏa mãn những đòi hỏi về năng lượng và chính điều đó sẽ dẫn đến sự cạn kiệt nguồn năng lượng hóa thạch trong một thời gian không xa [1]

1.1.1 Dầu mỏ

Nguồn tài nguyên thiên nhiên từ biển đã trở thành tiêu điểm cạnh tranh quốc

tế Dầu mỏ vẫn được coi là nguồn năng lượng chính cho toàn thế giới tới năm 2025 Thống kê của IEO2004 cho thấy, với nhu cầu đòi hỏi về dầu mỏ tăng lên 1,9% mỗi năm thì trong vòng 24 năm tới, mức tiêu thụ 77 triệu thùng/ngày năm 2001 sẽ tăng lên tới 121 triệu thùng/ngày vào năm 2025, mà nhu cầu lớn nhất sẽ là từ Mỹ và các nước đang phát triển ở châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc… Các quốc gia này có thể

sẽ chiếm tới 60% nhu cầu của thế giới [1]

Do đó thị trường năng lượng và cuộc chiến năng lượng trên thế giới sẽ ngày càng nóng bỏng và gay gắt và giá dầu cũng sẽ khó có khả năng hạ nhiệt, cho dù OPEC có tăng sản lượng dầu lên cao bao nhiêu đi chăng nữa, thì nguồn tài nguyên thiên nhiên quý hiếm mà chúng ta gọi là “vàng đen” này cũng sẽ đứng trên bờ vực của sự cạn kiệt và đẩy thế giới vào một sự khủng hoảng trầm trọng về năng lượng Vấn đề nóng bỏng này sẽ chỉ có thể được làm “hạ nhiệt” đi nếu như chúng ta tìm ra được một nguồn năng lượng mới thay thế nó hoặc tận dụng và tìm cách khai thác triệt để các nguồn năng lượng tuần hoàn sẵn có trong tự nhiên như: năng lượng gió, năng lượng mặt trời hay các nguồn năng lượng có thể tái tạo lại

1.1.2 Khí tự nhiên

Cùng với dầu mỏ, gần đây, khí thiên nhiên đã và đang được coi là một trong những nguồn nhiên liệu có nhu cầu tiêu thụ rất lớn trên thế giới với nhu cầu hàng năm tăng nhanh nhất, trung bình 2,2% kể từ năm 2001 đến 2025, so với nhu cầu tiêu thụ tăng 1,9% hàng năm đối với dầu mỏ và 1,6% hàng năm đối với than Nhu cầu tiêu thụ khí thiên nhiên vào năm 2025 ước tính sẽ là 151 nghìn tỷ feet khối, tăng lên gần 70% so với nhu cầu tiêu thụ của năm 2001 (khi đó là 90 nghìn tỷ feet khối) Như vậy, mức tiêu thụ khí thiên nhiên trong tổng các loại năng lượng tiêu thụ sẽ tăng từ 23% năm 2001 lên 25% vào năm 2025 [1]

Cho dù mức độ tiêu thụ khí thiên nhiên tăng cao, đặc biệt là trong thập niên vừa qua, thì trữ lượng khí để sản xuất sản phẩm khí thiên nhiên ở hầu hết các khu vực vẫn còn khá lớn và ước tính sẽ dùng được trong khoảng 60,7 năm nữa Trung

và Nam Mỹ có trữ lượng khí tự nhiên đủ cho khoảng 68,8 năm; Các nước Cộng hòa thuộc Liên bang Xô Viết cũ khoảng 75,5 năm, châu Phi 88,9 năm còn riêng Trung Đông thì trữ lượng khí quy đổi khí thành phẩm đủ cung cấp cho hơn 100 năm nữa

1.1.3 Than

Là nguồn nhiên liệu hóa thạch được sử dụng từ lâu nhất trên thế giới Tổng trữ lượng than trên toàn thế giới được ước tính khoảng 1.083 tỷ tấn, đủ cung cấp cho khoảng 170 năm nữa với mức tiêu thụ như hiện nay Mặc dù phân bố rộng rãi nhưng 60% trữ lượng than của thế giới tập trung ở 3 quốc gia: Mỹ (25%); Liên Xô

cũ (23%) và Trung Quốc (12%) Bốn quốc gia khác là Úc, Ấn Độ, Đức và Nam Phi chiếm khoảng 29% Trong năm 2001, 7 quốc gia này đã cung cấp tới 80% sản lượng than cho toàn thế giới

Các đặc trưng về chất lượng và địa chất của trầm tích than cũng là các tham

số rất quan trọng đối với trữ lượng than Than là loại năng lượng hóa thạch hỗn tạp hơn rất nhiều so với dầu mỏ và khí tự nhiên và chất lượng của nó biến đổi theo từng khu vực hay thậm chí ngay bên trong cùng một vỉa than Ví dụ như Úc, Mỹ hay Canada có chứa than với hàm lượng bitum rất cao dùng để sản xuất than cốc và 3 quốc gia này bán ra 81% than cốc cho thế giới năm 2002

Một loại than có chứa hàm lượng Bitum thấp hơn gọi là “than nâu” hay than non, không có tính thương mại trên thị trường thế giới vì lượng nhiệt rất thấp Năm

2001, than non chiếm khoảng 18% tổng sản lượng khai thác trên toàn thế giới Ba nước đứng đầu về sản xuất than non đó là Đức (193 triệu tấn), Nga (110 triệu tấn),

Mỹ (84 triệu tấn) với lượng than non sản xuất chiếm 41% tổng sản lượng của toàn thế giới năm 2001 [1]

Như vậy là chúng ta đã vừa điểm qua về khả năng cung cấp cũng như trữ lượng của các nguồn nhiên liệu chủ yếu được sử dụng trên thế giới Đứng trước tình hình nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, các nước trên thế giới đang cố gắng khai thác thêm các nguồn năng lượng khác như năng lượng hạt nhân, thủy triều, gió, mặt trời, địa nhiệt, hay năng lượng sinh học Trong đó, năng lượng sinh học sẽ góp phần đa dạng hóa nguồn năng lượng, thúc đẩy tăng trưởng kinh tế, giảm

thiểu ô nhiễm môi trường Vì vậy nhiều quốc gia trên thế giới đã có kế hoạch đầu tư lớn vào lĩnh vực này

1.2 Hydro là một nguồn năng lượng ưu việt

Hydro là một nguyên tố hóa học trong hệ thống tuần hoàn các nguyên tố với nguyên tử khối bằng 1 Ở trạng thái tự do và trong các điều kiện bình thường, hydro không màu, không mùi và không vị, tỉ trọng bằng 1/14 tỉ trọng của không khí Nhiệt

độ cháy của hydro có thể lên đến 3.000oC nếu cháy trong ôxy, cao nhất so với tất cả các loại khí khác như khí methane (CH4) đạt 2.148oC, propane (C3H8) đạt 2.385oC [32, 34]

Với các đặc tính này, hydro sẽ là một nguồn nhiên liệu quan trọng trong tương lai, phục vụ cho nhu cầu năng lượng của con người Bởi hydro là một loại nhiên liệu tái sinh, thân thiện với môi trường, không gây ô nhiễm, không phát thải

ra khí gây hiệu ứng nhà kính, hydro khi cháy rất “sạch” vì phản ứng cháy của hydro chỉ tạo ra nước [14]

Người ta có thể sản xuất hydro từ nhiều nguồn khác nhau như: hóa nhiệt nhiên liệu hydrocarbon với các phương pháp hóa nhiệt khí thiên nhiên với hơi nước, khí hóa hydrocarbon nặng hoặc khí hóa sinh khối và nhiệt phân, điện phân nước, phương pháp này dùng dòng điện để tách nước thành khí hydro và oxy và phương pháp sinh học [25, 27]

Ứng dụng của hydro trong tương lai

Hydro sử dụng làm nhiên liệu động cơ: Khi dùng làm nhiên liệu, hydro có thể được đốt trực tiếp trong các động cơ đốt trong, tương tự như trong các loại phương tiện giao thông chạy bằng nhiên liệu hóa thạch phổ biến hiện nay Hydro cũng có thể thay thế khí thiên nhiên để cung cấp năng lượng cho các nhu cầu dân dụng hàng ngày như đun nấu, sưởi ấm, chiếu sáng…[31,34]

Hydro còn được sử dụng làm nguồn năng lượng cung cấp cho hệ thống pin nhiên liệu, nhờ quá trình điện hóa để tạo ra điện năng Bên cạnh những ưu điểm của hydro như đã nêu (sạch, tái sinh…), pin nhiên liệu còn chạy rất êm, không gây ra tiếng động, chấn động như động cơ đốt trong Do dựa trên cơ chế của quá trình điện hóa tạo ra điện năng chứ không phải quá trình đốt như ở động cơ đốt trong, pin nhiên liệu còn đạt hiệu suất sử dụng cao hơn nhiều so với động cơ đốt trong, vì thế

mà tiết kiệm năng lượng hơn [34, 36] Với những ưu thế vượt trội đó, pin nhiên liệu

từ hydro đang ngày càng được quan tâm và dự đoán sẽ trở nên nguồn nhiên liệu đầy triển vọng, một thành phần chủ chốt của nền kinh tế hydro trong viễn cảnh tương lai

Sản xuất điện bằng pin nhiên liệu hydro sẽ không cần máy phát điện, không cần những tuốc bin đồ sộ, không có cả những cơ cấu chuyển động, không dầu nhớt bôi trơn, không có tiếng ồn, không khói xả Điện từ các pin nhiên liệu hyđro có thể

sản xuất mọi nơi, mọi công suất từ vài watt cho đến hàng trăm kilowatt hoặc hàng trăm megawatt cho mọi nhu cầu Vì vậy, rất thích hợp để xây dựng các trạm phát điện cho các vùng sâu, vùng xa, hoặc trạm điện độc lập tự cung cấp cho các thành phố, các cao ốc mà không cần đến nguồn điện lưới từ trung tâm cung cấp phân phối điện quốc gia [32]

Những vấn đề về môi trường ô nhiễm do sử dụng năng lượng hyđro gây ra sẽ không còn là đề tài nghiên cứu tiêu hao tiền tốn của và sức lao động của các nhà khoa học, không còn là đầu đề của các hội nghị quốc tế triền miên về biến đổi khí hậu toàn cầu như khi sử dụng năng lượng hóa thạch

Đây thực sự là một cuộc cách mạng sâu sắc trong tiến trình phát triển của xã hội loài người và được đánh giá có ý nghĩa như cuộc cách mạng công nghiệp trước

đây, khi phát minh ra đầu máy hơi nước với việc sử dụng nhiên liệu than đá

1.3 Một số phương pháp sản xuất hydro sinh hoc

1.3.6 Sản xuất hydro bằng điện

được sản xuất bởi điện có chất lượng tương đối cao, không có carbon, lưu huỳnh, hoặc hợp chất được tạo ra trong quá trình

1.3.7 Sản xuất hydro bởi khí metan (SMR)

Hydro có thể sản xuất bằng cách oxy hóa hơi nước hoặc dung dịch của nhiều hydrocacbon khác nhau như methanol, ethanol, glycerol, glucose hoặc sử dụng nhiệt độ và chất xúc tác Oxy hóa hydrocacbon có thể được thực hiện trong môi

S Renewable fuels: harnessing hydrogen, Nature 2002; 418; 964-7) Các chuyển

được tạo ra

1.3.4 Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng

Như chúng ta đã biết, ánh sáng và nước là những nguồn tài nguyên phong phú, do đó, trong vấn đề sản xuất hydro thì sự quang phân sinh học nước thành H2

và O2 là một giải pháp đầy hứa hẹn Tuy nhiên có một vài vấn đề với giải pháp đó [9]:

• Sản xuất hydro bằng quang phân sinh học đòi hỏi bioreactor với tỉ lệ

bề mặt trên thể tích lớn để ngăn ngừa sự hạn chế ánh sáng Đây không phải là một vấn đề trong sản xuất quy mô nhỏ, nhưng vượt quá quy mô phòng thí nghiệm sự hạn chế ánh sáng sẽ trở nên rõ rệt hơn và gây nhiều cản trở

• Hydro sản xuất bởi hydroase bị ức chế bởi oxi đồng sản xuất, thậm chí ở nồng độ thấp 1mM Người ta đã tìm nhiều biện pháp để giảm thiểu sự ức chế bởi O2 nhưng không phương pháp nào được chứng minh là hiệu quả cho đến nay

• Tỉ lệ điện tử được chuyển giữa hệ thống quang hóa II và I là chậm hơn 10 lần so với tỉ lệ mà ánh sáng bị bắt giữ khi vi sinh vật hấp thụ ánh sáng mặt trời Do đó, 90% năng lượng được gia tăng ở dạng các photon bị mất như nhiệt hoặc huỳnh quang Bởi vì những trở ngại này của việc sản xuất hydro phụ thuộc vào ánh sáng được ước tính là giới thiệu thương mại ít nhất 30 năm nữa

1.3.5 Lên men tối sinh hydro

Trái ngược với sự lên men sáng sinh hydro, lên men không phụ thuộc ánh sáng hay lên men tối sinh hydro là một quá trình sản xuất sinh học có thể được thực hiện một khoảng thời gian ngắn hơn để tạo thành khí hydro, khí CO2, acid acetic và acid lactic cùng một vài chất khác [5, 15]

Lên men tối tạo hydro là một hiện tượng phổ biến trong điều kiện thiếu ôxy hoặc kỵ khí (hay không có oxy hiện diện như là một nhận điện tử) Nhiều loại vi

khuẩn sử dụng sự khử proton thành hydro để loại đi đương lượng khử (reducing

equivalent) là kết quả của quá trình chuyển hóa sơ cấp Nói một cách khác, khi vi

khuẩn phát triển trên cơ chất hữu cơ thì những cơ chất này bị suy giảm bởi quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa này tạo ra những electron mà cần được loại bỏ để duy trì sự trung hòa điện tử Trong môi trường hiếu khí, oxy bị khử và H2O là sản phẩm Tuy nhiên trong môi trường kị khí hoặc thiếu oxy, các hợp chất khác cần phải được hoạt động như một chất nhận điện tử, ví dụ như proton cái mà bị khử để thành H2

phân tử Một ví dụ khác của các chất nhận điện tử thay thế trong môi trường kị khí

là nitrat với khí N2 như một sản phẩm hoặc sulfat với H2S là sản phẩm khử Thậm chí các hợp chất hữu cơ có thể hoạt động như chất nhận điện tử như ví dụ như sự sản xuất butanol từ vi sinh vật được thực hiện thông qua sự khử acid butiric Khả năng để khử một chất nhận điện tử không phải là ôxy yêu cầu sự có mặt của hệ enzym đặc biệt trong vi sinh vật, ví dụ: vi khuẩn sản sinh H2 có chứa enzym hydrogenase, vi khuẩn khử nitrat có chứa một hệ enzym phức tạp có khả năng khử từng bậc nitrat về N2… Mặc dù, rất nhiều hợp chất hữu cơ có thể sử dụng để sản xuất H2 trong quá trình lên men tối, nhưng ước tính năng suất tiềm năng hầu hết dựa trên sự chuyển đổi hexose Năng suất lí thuyết trên mol glucose được mô tả trong phản ứng sau:

C6H12O6 +4 H2O = 2CH3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2∆G’o = -206 kj/mol

Tối đa là 4 mol H2 trên một mol glucose có thể được sản xuất đồng thời với việc sản xuất năng lượng (206 kJ trên một mol glucose) là đủ để hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Phần còn lại của hydro trong hexose được bảo tồn trong sản phẩm phụ là acetate, và trong những điều kiện không lí tưởng, thì có sự hình thành nhiều sản phẩm khử như ethanol, lactate hoặc alanine Các quá trình oxy hóa hoàn toàn đường để thành H2 và CO2 tạo ra 12 mol H2 trên mỗi mol glucose theo lí thuyết, nhưng trong trường hợp này không có năng lượng chuyển hóa thu được Sản lượng của hydro trong quá trình lên men tối bị ảnh hưởng bởi áp suất riêng phần

(partial pressure) của sản phẩm Khi áp suất riêng phần H2 cao sẽ thay đổi quá trình chuyển hóa để sản xuất nhiều sản phẩm khử hơn, như lactate hoặc alanine, do đó làm giảm năng suất của H2 Người ta đã biết được việc sản xuất hydro từ vi sinh vật

là một hiện tượng phổ biến, nhưng hẳn là đáng ngạc nhiên khi không thấy có bóng khí hydro thoát ra khỏi những đống chất thải hữu cơ hoặc các ống cống Lý do cơ bản là vì trong tự nhiên có rất nhiều vi khuẩn khác dễ dàng tiêu thụ hydro như một nguồn năng lượng khử Khi mục đích là để sản xuất hydro từ chất hữu cơ thì một

môi trường cụ thể cần phải được tạo ra trong đó các vi sinh vật sản sinh H2 phát triển mạnh còn những sinh vật khác, đặc biệt là những vi sinh vật có khả năng tiêu thụ hydro thì không có mặt [9]

Như vậy, so với lên men phụ thuộc ánh sáng thì lên men tối có ưu thế cao hơn rất nhiều Đó là có thời gian thực hiện ngắn hơn, phù hợp với các loài vi khuẩn

ưa nhiệt cực cao như Thermotoga neapolitana Đồng thời trong quá trình này có

khả năng chuyển đổi nhiều cơ chất hữu cơ và các phụ phẩm từ đường và tạo ra nhiều đồng sản phẩm có giá trị Điều quan trọng là so với việc lên men phụ thuộc ánh sáng thì công nghệ lên men tối dễ ứng dụng và đã được thương mại hóa [7, 9, 14]

1.5 Sản xuất H 2 sinh học theo con đường lên men tối

H2 có thể được sản xuất sinh học bởi vi sinh vật, và do những yêu cầu đã được đề cập ở trên cho nguồn năng lượng mới, một số vi sinh vật sản xuất H2 đã được phân lập và nghiên cứu trong một vài năm gần đây [10, 33] Tất cả các phương pháp được biết đến của việc sản xuất H2 sinh học dựa trên các enzym xúc tác cho các phản ứng hóa học 2H+ + 2 e- ↔ H2

Hình 1.1 Cơ chế hình thành hydro từ glucose ở Thermotoga neapolitana

[Schu và Adam, 2009]

Cho đến nay, 3 loại enzym thực hiện phản ứng này đã được mô tả: Nitrogenase, Fe-hydrogenase và NiFe-hydrogenase [11] Nitrogenase có thể khử các cơ chất khác nhau, nhưng trong trường hợp không có các chất nền khác thì điện

tử được chuyển cho proton

Fe-hydrogenase được tìm thấy trong vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, nơi mà chúng loại bỏ các điện tử dư thừa trong sự lên men và chuyển chúng cho proton

NiFe-hydrogenases thường chuyển điện tử từ H2 để khử NADP

Trong quá trình lên men, NADH và Ferredoxin khử được tạo ra với tỉ lệ 1:2 Các electron được truyền bởi NAD/NADH tới Ferredoxin Sau đó hydrogenase truyền các electron từ ferredoxin khử đến proton để tạo thành hydro

Pyruvat được tạo ra từ đường phân bị ôxy hóa thành acetyl-CoA dưới điều kiện kị khí acetyl-CoA có thể được chuyển thành acetyl-phosphate và dẫn đến sự tạo thành ATP và acetate Sự ôxy hóa acetate thành acetyl-CoA đòi hỏi sự khử Ferredoxin Ferredoxin khử bị ôxy hóa bởi hydrogenase cái mà tạo ra Ferredoxin và giải phóng ra các điện tử là các phân tử hydro [26]

Ta có phương trình chung như sau:

NADH + 2Fdred + 3H+ → 2H2 + NAD+ + 2FdoxTrên thực tế, sản lượng H2 cao được đi cùng với sự sản xuất acetate Sự hình thành lactate hoặc ethanol là một con đường hoàn chỉnh nhưng tạo ra sản lượng H2

thấp [18]

Những hạn chế hiện tại của con đường lên men H2 là sản lượng thực tế còn thấp, các nguồn cơ chất như tinh bột tan và đường đơn thì quá đắt Do đó, cần có những biện pháp nghiên cứu để có thể vượt qua những thách thức này

Một trong số đó là chúng ta phải tìm ra những nguồn cơ chất mới, rẻ và dồi dào trong tự nhiên, như các phế, phụ phẩm nông - công nghiệp để tận dụng làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật sản sinh hydro Điều đầu tiên

mà ta cần quan tâm đến là phạm vi của các hợp chất hữu cơ mà có thể được sử dụng Điều thứ hai là liên quan đến chất lượng của các nguyên liệu có thể được sử dụng cho sự lên men tối hydro Phạm vi của các cơ chất tiềm năng có thể được sử dụng bởi nhiều loại vi khuẩn sản xuất hydro khá là rộng và có thể mở ra nhiều nghiên cứu xa hơn Từ quan điểm nhiệt động lực học, sự chuyển hóa của carbohydrate thành hydro và acid hữu cơ được ưu tiên vì nó mang lại lượng hydro

cao nhất/1mol cơ chất Những carbohydrate này có thể là monosacharide nhưng cũng có thể là polyme như cellulose, tinh bột hoặc xylan Thực tế, không có nhiều nghiên cứu về sự sản xuất hydro qua quá trình lên men tối Điều này, cùng với số lượng lớn các loài vi sinh vật sản xuất hydro, cho phép đưa ra các ý kiến cho rằng hầu hết các carbohydrate là một nguyên liệu phù hợp với sự lên men H2 tối Protein, peptide và các amino acid ít phù hợp hơn đối với sự lên men tối sinh hydro, trong khi polime sinh học như lipid sẽ là không phù hợp [9]

Việc sử dụng được nhiều dạng carbohydrate cũng là một tiềm năng lớn của quá trình lên men tối, tức là phạm vi rộng của các cơ chất hữu cơ tiềm năng có thể được sử dụng bởi vi sinh vật Các nhà nghiên cứu cho rằng một vài dạng của các chất thải hữu cơ trải dài từ các chất thải rắn như trấu, rơm rạ đến các chất thải lỏng

từ các nhà máy đường và nhà máy sản xuất rượu gạo, đã được sử dụng thành công cho sản xuất hydro từ quá trình lên men tối Như đã nêu ở trên, các vi sinh vật sản sinh hydro có thể chuyển đổi các polymer sinh học như cellulose, tinh bột và xylan thành hydro và các acid hữu cơ Điều này là rất thuận tiện, bởi vì chúng ta chỉ cần thực hiện bước tiền xử lí cơ chất để có được một nguồn cơ chất dễ phân giải cho vi sinh vật Tuy nhiên, ngoài các nguyên liệu dễ dàng phân hủy như tinh bột và cellulose, thành phần chính của các nguyên liệu thay thế trong tương lai có lẽ hầu hết là một lượng lớn bắt nguồn từ nguyên liệu lignocellulose thô- một chất có rất nhiều trong cỏ, gỗ, các thành phần của gỗ, lõi ngô, rơm rạ… Lignocellulose là một polimer sinh học có chứa lignin được gắn kết chặt chẽ, cellulose và hemicellulose Phức hợp này khó bị phá hủy thành các thành phần polimer và các monomer đơn lẻ

Do đó, sự phân giải cơ chất chứa lignocellulose thành các đường pentose và hexose

sẽ trở nên khó khăn, tiêu tốn nhiều năng lượng và chi phí Hơn nữa, lignin cản trở một cách mạnh mẽ việc sử dụng cellulose và hemixenlulose bởi vì các liên kết trong lignocellulose chống lại sự biến đổivà quá trình phân giải hóa học lignin thường ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật [9, 29] Do đó, hiển nhiên rằng sản xuất nguyên liệu giá rẻ sẽ đòi hỏi sự phát triển của các phương pháp tiền xử lí hiệu quả với giá thành và một yêu cầu năng lượng thấp

1.5 Một số loài vi khuẩn sản xuất hydro thông qua con đường lên men tối

1.5.1 Vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt

Nhiều vi khuẩn yếm khí có thể sản xuất H2 từ hexoses trong qua quá trình lên

men tối Clostridium butyricum, C welchii, C pasteurianum, C.beijerincki và hỗn

hợp của clostridia đã được sử dụng trong các nghiên cứu sản xuất của H2 sử dụng một số hydrocarbon như tinh bột, cellulose, hemicellulose và xylan (Taguchi và cộng sự, 1996b)

Nhiều loại vi khuẩn yếm khí có thể lên men sinh H2 từ nguồn carbohydrate

như là loài Anaerocellum, Caldicellulosiruptor, Dictyoglomus, Fervidobacterium Spirocheta, Thermotoga và Thermoanaerobacter Tại 80ºC, Thermotoga maritime

cho sản lượng H2 là 4 mol/1 mol glucose tương đương với giá trị lý thuyết Gần đây, sản xuất H2 của C saccharolyticus nuôi cấy trên sucrose ở 70ºC và Thermotoga elfii nuôi cấy trên đường tại 65ºC thu được là 3,3 mol H2 đạt 83% theo

lý thuyết (Eriksen và các cộng sự, 2008)

1.5.2 Vi khuẩn kị khí không bắt buộc

Vi khuẩn kị khí tuỳ tiện là ít nhạy cảm với oxy Enterobacter là có nhiều đặc

điểm phù hợp cho sản xuất H2 như tăng trưởng cao khi sử dụng một loạt nguồn carbon, không có sự ức chế bởi áp lực H2 cao nhưng năng suất H2 trên đường là ít

hơn so với so với các vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt như chủng của Enterobacter có

thể sản xuất 1 mol hydro/ mol glucose (Tanisho và Ishiwata, 1995; Tanisho và cộng

sự, 1998) E coli đã được chứng minh là có khả năng sản xuất H2 và CO2 khi không

có mặt của O2 (Nandi và Sengupta, 1998)

1.5.3 Vi khuẩn hiếu khí

Một số vi khuẩn hiếu khí như Alcaligenes eutrophus và Bacillus licheniformis có khả năng sản xuất H2 khi tiếp xúc với điều kiện yếm khí với sản lượng 0,5 mol/ mol glucose [46]

Những kết quả này cho thấy sản lượng hydro cao hơn trên hexose có thể đạt được bởi vi khuẩn ưa nhiệt cao và cực cao so với vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt và vi khuẩn kị khí không bắt buộc ưa nhiệt trung bình Sản lượng khoảng 83-100% của giá trị lý thuyết tối đa là 4,0 mol H2/mol đường

1.6 Giới thiệu về Thermotoga neapolitana

Hình 1.2 Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của T neapolitana [14]

(hình a: Giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, hình b: Giai đoạn ổn định)

1.6.1 Lịch sử

Thermotoga neapolitana được phân lập lần đầu vào năm 1986, tại trầm tích

núi lửa biển nông gần Lucrino, vịnh Naples, Italia [35]

1.6.2.Phân loại

Thermotoga neapolitana thuộc:

Siêu giới: Vi khuẩn;

1.6.3.Đặc điểm hình thái và sinh thái

• Tế bào hình que, Gram âm, tồn tại riêng biệt hoặc theo cặp; dài: 1,1 - 1,5 μm, rộng: 0,6 μm

• Thành tế bào dày đặc biệt so với các tế bào gram âm khác

• Các tế bào cố định, không tiên mao, không tạo bào tử

• Thermotoga neapolitana sống trong môi trường có khoảng nhiệt độ từ

50- 90oC, nhiệt độ tối ưu là 75oC, pH trong khoảng từ 5- 9, tối ưu ở pH=7,5 Phát triển cả trên môi trường lỏng và rắn [35]

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng của T.neapolitana ở các nhiệt độ và pH

khác nhau trong môi trường nước biển (Theo Belkin và cộng sự (1986)) [14]

1.6.4 Đặc điểm hệ gen

• NST dạng tròn

• Hệ gen có 1800 kb

• Tỉ lệ G + C là 41,3 % [35]

1.6.5 Đặc điểm tế bào và chuyển hóa

• Điểm nóng chảy của lipid trong màng cao Giúp ổn định và duy trì cấu trúc màng

• Giảm thiểu lượng nước tự do trong tế bào, sử dụng reverse DNA gyrase DNA cuộn xoắn được nhiều hơn

• RNA không chứa các trình tự extra (đoạn phình ra, bất đối xứng, các bất thường khác…) được cắt đi để giảm thiểu kích thước [31, 35]

Từ những đặc điểm về cấu trúc tế bào và chuyển hóa trên của chúng ta có thể thấy rằng những đặc điểm đó đều giúp cho chủng vi khuẩn này thích nghi với điều kiện sống khắc nghiệt trong môi trường có nhiệt độ cao

1.6.6 Hydrogenase của Thermotoga

Enzyme chịu trách nhiệm sản xuất hydro (H2) kết hợp hydro và proton tương đương (2H + + 2e-) là những hydrogenase (EC 1.12.99.6 và EC1.12.7.2) cũng tác

động ngược lại vào quá trình oxy hoá của phân tử hydro Trong kỵ khí ưa nhiệt, hai loại chính của hydrogenases tìm thấy dựa trên hàm lượng kim loại của chúng là: [Fe -Fe] và [Ni- Fe] hydrogenase

Hơn nữa, hydrogenases có thể sử dụng các loại điện tử khác nhau như NAD, NADP, FAD và ferredoxin (Fd), bị giảm trong con đường thuỷ phân glucose và đặc biệt trong chuyển đổi của glyceraldehyde-3-P thành glycerate 3-P và pyruvate thành acetyl-CoA

cần phải được oxy hóa để giữ cho các hoạt động đường glycolytic và cơ chế xử lý này có thể khác nhau giữa các quá trình sản xuất hydro ở nhiệt đô ̣ khác nhau

gồm ba tiểu đơn vị- HydA (73 kDa, HydB (68 kDa) và HydC (18 kDa) tỷ lệ 01:01:01

Thông qua việc sử dụng một phương pháp nghiên cứu đã tìm thấy được cấu

trúc operon của T neapolitana trong cả trình tự sắp xếp và khoảng cách của các

ORF (Tosatto et al 2008) Cụ thể, chúng có thể giữ lại ít nhất là 75% đến tối đa 91% cho tất cả các sản phẩm gen với sự tham gia tiểu đơn vị hydrogenase [Fe -Fe] Trong một cấp độ ADN, hai chuỗi có sự đồng nhất đến 82%, với tổng số 375 đột biến nucleotide, bao gồm ba mã đột biến tương ứng với đột biến R363E (GAA → AGG), E475S (GAG → TCC) vàT539L (ACA → GTG)

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc của protein HydA Thermotoga neapolitana

a Hình mẫu được hiển thị bên dưới một bề mặt trong suốt Cụm sắt-lưu

huỳnh được hiển thị dạng hình cầu

b Mặt cắt nửa trên của mô hình Phần còn lại của protein HydA

T neapolitana được hiển thị như đường màu xanh Phần còn lại đột biến tạo thành một phần của kênh kỵ đường A (E475S) và B (T539L), là màu

đỏ

c Cùng mô hình như ảnh b, xoay 90 ° quanh trục x để hiển thị phân tử, nơi

lối vào kênh kỵ nước (Tosatto et al 2008)

1.6.7 Những đặc điểm của phù hợp với việc sản xuất hydro

• Trong chi Thermotoga, Thermotoga neapolitana được coi là “mạnh” nhất vì

thích nghi với các điều kiện khác nhau, các nguồn cacbon khác nhau và sản sinh ra

lượng hydro cao nhất  Mục tiêu hấp dẫn trong thương mại và công nghiệp

• Có thể phát triển trên các loại đường: mono và polysaccharide: Galactose,

glucose, lactose, mantose, tinh bột, sucrose, xylose…

• Các amino acid không hỗ trợ sự tăng trưởng của Tn Có thể phát triển trên môi

trường thiếu protein

• Sản lượng H2 cao (khoảng 83- 100% theo định lượng lí thuyết)

• Ít lây nhiễm bởi nhiệt độ phát triển cao (65- 90oC)

• Chịu đựng tốt hơn đối với áp suất riêng phần hydro cao so với các chủng khác

• Chuyển hóa được cả đường C5 và C6 (nên có thể tận dụng được các phụ phẩm

rẻ tiền) [10, 14, 20]

Bảng 1.1 Tỷ lệ và hiệu suất sản xuất hydro từ rác thải công nghiệp, nông nghiê ̣p

thuỷ phân bởi T neapolitana trong phòng thí nghiê ̣m

t o C Cơ chất Nguồn

cacbon phần xƣ̉ lý Thành Tỷ lê ̣ sản xuất H 2

(mmol/L/h)

Hiê ̣u suất H 2

Nguồn tham khảo

Miscanthus

Xylose, glucose

NaOH, enzym

13,1 3,2 De Vrije và cs

2009

75 Rơm ra ̣ Xylose,

glucose Xử lý phối

hơ ̣p 4,7 2,5 Nguyen và cs

2010b

75 Sinh khối

tảo

Dextrin, tinh bô ̣t,

Enzyme thuỷ phân

227,3 2,7 Nguyen và cs

2010c

80 Bô ̣t cà rốt Glucose,

fructose, sucrose

Enzyme thuỷ phân 12,5 2,7 De Vrije và cs

và cs 2012

Bảng 1.1 là tổng hợp các kết quả nghiên cứu khi sử dụng T neapolitana lên

men hydro trong phòng thí nghiệm của các nghiên cứu gần đây trên thế giới Kết quả nghiên cứu của Nguyen và cs cho thấy sử dụng sinh khối tảo với nguồn cacbon

là dextrin và tinh bột sẽ cho tỷ lệ sản xuất hydro (mmol/L/h) đạt hiệu quả cao nhất,

còn hiệu suất tạo hydro đạt 3,2 khi sử dụng nguồn cơ chất là cỏ Miscanthus có chứa

xylose và glucose

1.7 Các nguồn nguyên liệu tái sinh

1.7.1 Chất thải sản xuất đường

Sản xuất đường là ngành công nghiệp quan trọng phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới Trong quá trình sản xuất đường nhiều loại chất thải khác nhau như mật đường, bã mía, và nước thải được tạo ra Các loại rác thải là môi trường thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật

Trong môi trường chất thải từ nhà máy sản xuất đường bổ sung Acid L-

al 2000) Môi trường chất thải bổ sung hỗn hợp malate và glutamate sản lượng sản

1.7.2 Chất thải sản phẩm sữa

Chất thải sản phẩm sữa, trong đó có sữa hoặc dư lượng pho mát và sữa, được biết là có một lượng lớn các chất hữu cơ có giá trị COD dao động từ 5 và 50g/L(Seifert et al 2010a)

Nước thải nhà máy sữa có thêm malate 30% (v/v) hydro được sản xuất với

xuất Hydro cao nhất 16,9L H2/L chất thải tương ứng là từ nước thải sản xuất sữa vô trùng (Seifert et al 2010a)

1.7.3 Bã đậu

Ở quy mô phòng thí nghiệm thì việc nuôi cấy chủng T neapolitana với

nguồn Carbon đơn giản như glucose, xylose hay glycerol không bộc lộ nhiều hạn chế về mặt kinh tế Nhưng nếu như chúng ta muốn ứng dụng phương pháp sản xuất

hydro sinh học bởi chủng T neapolitana trên quy mô công nghiệp thì điều này sẽ

bộc lộ nhược điểm về mặt kinh tế bởi vì giá thành đắt của nguồn cơ chất [28] Vì vậy, một nguồn cơ chất là phụ phẩm rẻ tiền rất cần được tìm ra để thay thế nếu chúng ta muốn tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp

Đậu tương là một cây lương thực được trồng nhiều ở các nước châu Á trong

đó có Việt Nam vì đây là một cây lương thực có thể trồng được ở những vùng đất không cần màu mỡ, cho năng suất cao và hàm lượng chất dinh dưỡng đáng kể Phần lớn đậu tương được sử dụng để chế biến ra các loại thực phẩm dùng trong đời sống hàng ngày của con người như: sữa đậu nành, bột đậu nành và đậu phụ…Trong đó, phần lớn đậu phụ được sử dụng như một món ăn thường xuyên của người dân Mà trong quá trình sản xuất đậu phụ thì ước tính có đến 30% đậu tương bị mất đi, vào khoảng 8.105 tấn / năm ở Hàn Quốc và Nhật Bản [13] Tuy nhiên, bởi nguồn bã đậu

có chứa hàm lượng các chất hữu cơ rất cao, lên đến 40 - 60% lượng carbohydrate [35] Do đó, bã đậu được xem là một nguồn nguyên liệu dồi dào và lí tưởng để thực hiện việc sản xuất H2 sinh học

Chính vì vậy, chúng ta có thể thu bã đậu với số lượng lớn ở các nhà máy sản xuất và chế biến các sản phẩm từ đậu tương để phục vụ cho việc nuôi cấy trên quy

mô lớn Ở Việt Nam hiện nay đã có nhà máy chế biến đậu nành với trị giá khoảng

100 triệu USD ở khu phức hợp cảng Phú Mỹ Nhà máy có khả năng nghiền đậu tương với công suất 3.000 tấn/ngày Ở miền Bắc, tập đoàn Quang Minh cũng đã xây dựng nhà máy nghiền đậu tương với công suất 1.000 tấn/ngày tại tỉnh Hưng Yên Đây là những tiền đề to lớn để phát triển sản xuất H2 từ cơ chất là bã đậu trong tương lai

Bởi vì bã đậu thô có khả năng hòa tan thấp, lượng carbohydrate hòa tan được chỉ nhỏ hơn 15% [13], do đó, bước tiền xử lí bã đậu là vô cùng quan trọng để tăng khả năng phân giải sinh học của nó và góp phần làm tăng sản lượng H2 Có nhiều phương pháp tiền xử lí cơ chất như xử lí bằng kiềm, acid hay ionic liquid [24],

nhưng trong nghiên cứu này, sự acid hóa đã được lựa chọn làm phương pháp tiền

xử lí bã đậu vì nó giúp biến thể trạng thái hydrophobic của bã đậu thành dạng hydrophilic để có thể dễ dàng bị enzym ngoại bào của vi khuẩn phân giải, đồng thời

dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm [8, 13, 29]

1.7.4 Glycerol

Trong những năm gần đây, chất thải chứa glycerol từ các nhà máy sản xuất dầu sinh học đã trở thành một nguồn nguyên liệu cho sản xuất hydro sinh học dồi dào và đầy hứa hẹn Nó được sản xuất ngày càng nhiều hơn như một sản phẩm phụ của quá trình sản xuất dầu sinh học với tỉ lệ 10% Người ta ước tính rằng, cứ 100kg biodiesel được sản xuất thì 10kg glycerol sẽ được tạo ra Nguồn chất thải hữu cơ dồi dào này đã được ứng dụng trong các ngành sản xuất thuốc, công nghiệp nhựa, xà phòng, kem đánh răng, sơn và một số sản phẩm khác cũng như là nguyên liệu đích

để chuyển đổi thành các sản phẩm có giá trị khác như lipid, 1,3- propanediol và các sắc tố bởi quá trình lên men vi sinh Do đó, glycerol được coi như là một nguồn carbon chính cho sản xuất hydro sinh học thông qua con đường lên men kị khí [2, 6, 7]

Một số tính chất của glycerol

Glycerol là một rượu đa chức, gồm 3 nhóm - OH gắn vào gốc hydrocacbon

C3H5 (công thức hóa học là C3H5(OH)3) Glycerol là một chất lỏng không màu, không mùi, nhớt, có vị ngọt (có 3 nhóm - OH), sôi ở 290oC, nóng chảy ở 17oC Phân tử khối 92,09382 g/ mol, độ nhớt 1,2 Pa °

1.7.5 Rơm, rạ

Có thể nhấn mạnh rằng hydro sinh học là một nguồn năng lượng xanh với rất nhiều ưu thế nhằm thay cho nhiên liệu dầu trong tương lai du nhu cầu ngày càng cao của thế giới Hơn nữa hyro là nguồn nhiên liệu dồi dào dễ có được từ các nguồn năng lượng tái tạo khác nhau và đặc biệt là các nguồn phụ phẩm sinh học Với lợi thế là một quốc gia cố nền nông ngiệp và lâm ngiệp phát triền, nguồn lignocellulose

từ rơm, rạ, gỗ, chất thải hữu cơ, bùn, phân động vật vv… Nếu biết tận dụng hợp lý thì đây sẽ là một nguồn cung cấp nguyên liệu đầu vào dồi dào cho việc tạo ra hydro, nguồn năng lượng xanh trong tương lai Cứ 1kg hạt lúa thu được tương ứng 1- 1,5

kg rơm (Maiorella, 1985) Ước tính khoảng 650- 975 triệu tấn rơm rạ được sản xuất mỗi năm trên toàn Thế giới và phần lớn chúng được dùng làm thức ăn gia súc và phần còn lại là lãng phí Trong rơm có một số đặc điểm mà làm cho nó có tiềm năng

để trở thành nguyên liệu cho sản xuất hydro Chúng chứa cellulose cao và hemicellulose, có thể được thủy phân để lên men đường Về thành phần hóa học, rơm chủ yếu chứa cellulose 32- 47%, hemicellulose 19- 27%, và lignin 5- 24%, (Garrote et al, 2002) Trong hemicellulose các pentose chiếm ưu thế, trong đó xylose là đường quan trọng nhất chiếm 14,8- 20,2% (Roberto và cộng sự, 2003)

Chính vì thế, việc nghiên cứu quá trình thuỷ phân các hợp chất chứa cellolose để tận dụng nguồn phế thải sau thu hoạch của quá trình sản xuất nông nghiệp là việc làm hết sức cần thiết Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ

dừng lại ở việc khảo sát ban đầu xem khả năng sử dụng của chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 các nguồn nguyên liệu tái tạo đó như thế nào trong quá

trình sản xuất hydro sinh học

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chủng giống

Chủng được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu là Thermotoga neapolitana

DSM 4359 và được mua tại Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Đức Từ mẫu mua về, các tế bào đông khô sẽ được thủy hóa

và khởi động giống như mô tả trong hình 2.1 Quá trình này được tiến hành một cách vô trùng dưới điều kiện có dòng khí N2 chảy liên tục

Hình 2.1 Quá trình thủy hóa và khởi động chủng giống DSM4359 [14]

Đầu tiên, vi khuẩn đông khô được thủy hóa trong 1ml môi trường nuôi cấy, giữ kị khí trong 1h ở nhiệt độ phòng và sau đó chuyển một cách kị khí sang một ống nghiệm có chứa 4ml môi trường đã khử trùng để ủ ở 75oC trong bể lắc ổn nhiệt trong 24h Sau 24h, chủng giống được pha loãng và được chuyển đến bình serum 120ml dưới điều kiện kị khí bằng dòng khí N2 và được nuôi cấy lắc 100 rpm ở 75oC

để phát triển trong 48h Sau 48h nuôi cấy đầu tiên, các tế bào được chuyển sang 4 bình serum khác để nuôi cấy lần 2 trong điều kiện tương tự Mỗi bình được cất giữ

ở 4oC để giữ giống, còn những bình khác thì chúng ta có thể sử dụng để thực hiện các thí nghiệm [14]

2.2 Các thiết bị và dụng cụ thực hiện thí nghiệm

2.2 1 Các thiết bị

Máy sắc kí khí (Gas Chromatography- GC; 7890A; serial #: us11501033- USA) để

đo lượng khí H2 sinh ra

Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Japan) để xác định các hợp chất hữu cơ

Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB- 30; Serial no: 0398272117PO10;

Gas-cho GC, dụng cụ kẹp nắp nhôm Handy crimper for aluminum seal

2.3 Môi trường nuôi cấy

2.3.1 Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản

Danh mục hóa chất, xuất xứ

Glycerol: Trung quốc

Na2SeO3.5H2O: Merck Cao nấm men: Merck Reazurin: Sigma CysteinHCl.H2O : Sigma

Và một số hóa chất thông dụng khác

Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên

men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [21]

- Các bước pha môi trường và thành phần của môi trường bao gồm:

• Dung dịch gốc 1: KH2PO4: 1.5 g/l

Na2HPO4.12H2O: 4.2 g/l

H3BO3: 0.01 g/l

Na2MoO4.2H2O : 0.01 g/l NiCl2.6H2O : 0.025 g/l

Na2SeO3.5H2O : 0.3 mg/l

- Cách pha TES (Trace element solution): Khi pha TES, ta phải hòa tan Nitrilotriacetic acid trước vào 500ml nước cất và điều chỉnh pH về 6.5 bằng KOH vì Nitrilotriacetic acid là một acid rất khó để hòa tan Sau đó thêm các chất khoáng còn lại và nước cất cho đến 1000ml và điều chỉnh pH cuối cùng của TES là 7.0 bằng KOH

- Khi môi trường đã được pha xong thì pH của môi trường được điều chỉnh

về 7.5 bằng NaOH

- Mỗi 15ml môi trường sẽ được cho vào bình serum 30ml sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhôm bên ngoài

- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết trong khoảng 5 phút

để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo môi trường kị khí

- Khi môi trường nuôi cấy trong bình serum trở nên trong suốt và lắc lên không thấy có hiện tượng chuyển sang màu hồng thì môi trường đó đã sẵn sàng để cấy giống

- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2

- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 75oC,

• Sau đó bã đậu được pha loãng với nước cất ở tỉ lệ 1:4 (w/w)

• Trộn đều bằng máy xay trong khoảng 1 phút

• Tiếp tục được xử lí với H2SO4 0.5% (v/v) trong vòng 5 phút để làm tăng hàm lượng Carbohydrate hòa tan

• Các chỉ tiêu COD, tổng Nitơ, tổng Photpho đươ ̣c phân tích tại Viê ̣n Hoá cơ bản - Trường Đa ̣i ho ̣c Bách khoa Hà Nô ̣i

2.3.3 Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là glycerol

Tiền xử lí chất thải glycerol thô

Trước khi được sử dụng làm cơ chất cho quá trình nuôi cấy kị khí chủng vi

khuẩn Thermotoga neapolitana DSM, chất thải glycerol thô cần phải được qua

bước tiền xử lí vì nó thường chứa methanol và ethanol Do đó, đầu tiên, cần phải loại bỏ các chất này thông qua quá trình khô quay ở 45oC Tiếp đến, các chất rắn sẽ được kết tủa bởi sự ly tâm tại 15000 rpm trong 15 phút

2.3.4 Môi trường nuôi cấy với cơ chất là rơm, rạ

2.3.4.1 Quy trình xử lý rơm, rạ

Bước 1: Xử lý cơ học: Rơm rạ được cắt nhỏ từ 5-10 cm, sau đó nghiền nát và lọc

qua lưới sàng kích thước 1mm

2.3.4.2 Phương pháp xác định thành phần rơm, rạ (Nguyen và cs, 2008)

Dùng acid sulfuric 72% 24N để hydro hóa và hòa tan các cacbohydrat trong gỗ; lignin không hòa tan trong axit được lọc và cân

- Cách pha hóa chất:

Axit sulfuric 72% 24N, trọng lượng riêng 1.6338 được chuẩn bị như sau: Rót 665ml acid sulfuric đậm đặc vào 300ml nước, làm lạnh pha thành 1000 ml, điều chỉnh nồng độ thành 24N bằng cách chuẩn độ với kiềm Hỗn hợp ethanol-benzen: 1 thể tích ethanol 95% và 2 thể tích benzene

- Cách tiến hành:

Lấy 2g bột rơm, cho 25 ml hỗn hợp ethanol - benzen vào, để yên trong 30 phút, gạn bỏ hỗn hợp trên, cho thêm 25ml ethanol dể trong 15 phút, gạn bỏ ethanol, rửa lại bằng nước nóng, lọc để loại nước Bột rơm được sấy khô trong tủ sấy 60ºC Cân lấy 1g bột rơm đã loại resin cho vào bình 250ml, cho từ từ 15ml H2SO4 72% vào, dùng đũa khuấy thật kĩ giữ mẫu ở 2ºC cho đến khi tan mẫu Sau khi mẫu tan, bao miệng bình lại và giữ ở nhiệt độ thường trong hai giờ Thường xuyên khuấy cho đến khi mẫu trong bình tan thành dịch Cho khoảng 300 - 400ml nước vào bình 1000ml và chuyển mẫu từ bình 250ml vào, rửa và pha loãng tới thể tích 575ml (độ

H2SO4 khoảng 3%) Lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu) và đun trong 4 giờ kể từ lúc sôi Để yên cho lắng tủa, hút bỏ phần dịch nổi, rửa axit lẫn trong lignin với nước nóng, làm khô lignin bằng cách sấy ở 105ºC đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân

Trong đó: A = trọng lượng của lignin (g)

W = trọng lượng khô của mẫu (g)

A

W

Đo hàm lượng cellulose sau khi phân hủy lignin: (Nguyen và cs, 2008)

- Cân 1-2 g mẫu đã sấy khô, cho vào bình cầu dung tích 500ml Thêm vào 200 ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu và đun nhẹ trong 30 phút (không để bọt trào lên) Kĩ thuật này dùng để hòa tan tinh bột, các pectin, lignin có tính chất acid và ít kết hợp với cellulose, không ảnh hưởng đến hàm lượng cellulose ngay cả những phân tử thấp nhất

- Lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH nóng, cho cặn cellulose tác dụng với 10ml dung dịch HCl 10% trong bình cầu ở nhiệt độ thường Thêm 10ml dung dịch nước javen từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều, để yên trong 5 phút rồi lọc Cho cặn tác dụng với dung dịch NaOH 0.5% ở nhiệt độ 40ºC để hòa tan lignin (đã bị clo hóa), để yên vài phút rồi lọc Lặp lại hai lần nữa để có cellulose thật trắng Rửa kĩ bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân

Kết quả tính ra hàm lượng cellulose (%) trong 1g mẫu

Công thức tính: Hàm lượng cellulose = x 100 (%)

Trong đó: A = trọng lượng của cellulose (g)

W = trọng lượng khô của mẫu (g)

Quy trình để xác định thành phần carbonhydrate: Đầu tiên, rơm được thủy phân bởi acid sulfuric 72% (w/w) ở 30 °C trong 60 phút, sau đó thủy phân tiếp bằng acid sulfuric 4% (w/w) ở 121°C trong 60 phút (được thực hiện trong lò hấp).Sau đó, thành phần đường được phân tích bằng hệ thống HPLC

2.4 Phương pháp sục khí nitơ và kiểm soát pH làm tăng hiệu suất tạo thành hydro

Dòng khí nitơ tinh khiết được sục với tốc độ 50ml/phút ngay sau khi sản lượng hydro trong môi trường nuôi cấy đạt mức tối đa Kĩ thuật sục khí nitơ được

mô tả trong Hình 2.2

A

W

Hình 2.2 Phương pháp sục khí nitơ

Nắp cao su không được mở trong suốt quá trình sục.Ống vào của dòng khí nitơ tinh khiết qua kim tiêm được nối bộ lọc 0.2 μm Kim còn lại là giành cho khí thoát ra Cả hai kim đều được giữ trên nắp cao su của bình serum Mỗi lần sục được thực hiện với tốc độ như nhau trong 5 phút Trong khi sục nitơ, chất lỏng trong bình serum được lấy mẫu bằng ống kim tiêm để xác định pH và pH trong môi trường được điều chỉnh bằng 1M NaOH

2.5 Sản xuất hydro trên quy mô lớn sử dụng nồi lên men 5L

- 100ml chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM được nuôi cấy trong

900ml môi trường tinh khiết dưới điều kiện nhiệt độ 75°C, pH7.5 sử dụng hệ thống điều khiển biotron pH được giữ ổn định bằng việc thêm NaOH 2N Nhiệt độ được giữ ổn định ở 75°C bằng cách sử dụng cuộn dây nhiệt bao quanh lò phản ứng Khí trong nồi lên men được sục liên tục với khí nitơ tinh khiết Khí thoát ra từ nồi lên men được nối với bình ngưng khí Tốc độ và áp suất riêng phần của khí thoát ra được điều khiển bởi đồng hồ đo khí

- Các bước kiểm soát pH tiếp theo được thực hiện bằng cách thêm NaOH 2.0N vào sau 24h nuôi cấy mỗi lần Hệ thống khuấy được điều chỉnh về mức 400 rpm Sau 24h, hệ thống bơm để bổ sung chất dinh dưỡng được nối với bình chứa 1L môi trường Môi trường bổ sung (100ml) thì được chuẩn bị theo dung dịch gốc bao gồm 5g/L glucose và xylose, 2g/L cao nấm men, cysteine-HCl, nồng độ muối và các dung dịch đã được trình bày trong phần 2.3.1 Môi trường bổ sung được thêm theo bốn đợt, tốc độ cho mỗi đợt là 12ml/phút

Khí nitơ đi vào

Khí thoát ra

2.6 Nghiên cứu qúa trình sản xuất hydro liên tục sử dụng nồi lên men 5 L

Hình 2.3 Quy trình sản xuất hydro

Quy trình trên được mô tả lại chi tiết hơn qua hình sau đây

Hình 2.4 Quy trình nuôi cấy chi tiết

Sơ đồ trên đã phác họa tóm tắt từng bước 1 để lên men chủng vi khuẩn và sản xuất hydro Trong đó môi trường 1 là các khoáng chất như nguồn cacbon, nấm men, NaCl, KH2PO4, Na2HPO4.7H2O, NH4Cl, MgCl2.6H2O, nguyên tố vết cystein

Môi trường

2

Hydro sinh học

Lên men Nhân giống

Môi trường

1

Nuôi cấy Chủng vi

khuẩn

và resaruin Môi trường 2 là các hóa chất bổ sung như là cơ chất tham gia (glucose, xylose, glycerol vv….) và NaOH 5N để duy trì pH nhờ trung hóa các acid sinh ra trong quá trình nuôi cấy liên tục Đặc biệt chú ý ở bước nuôi cấy đến nhân giống

Từ nuôi cấy ở các bình thể tích nhỏ, tiến hành pha môi trường theo tỷ lệ tỷ lệ thuận với nồi lên men thể tích 5L như theo tỷ lệ môi trường đã được thực hiện ở quy mô nhỏ là bình serum 120mL trước đó Quá trình lên men phải được theo dõi trong 3 ngày, cứ 2h nuôi cấy liên tục, ghi lại những giá trị các thông số của quá trình lên men

Với quy trình nuôi cấy được mô tả chi tiết ở trên, sự tăng sinh và sinh trưởng

vủa vi sinh vật Thermotoga neapolitana đạt được hiệu suất tối ưu và sản lượng

hydro cũng đạt được mức tối đa so với những nghiên cứu đã được thục hiện trên cùng 1 điều kiện nhiệt độ, pH, áp suất, vòng quay của motor và tốc độ sục khí nitơ

để duy trì điều kiện kị khí mà không làm ảnh hưởng đến chủng vi sinh vật

2.7 Các phương pháp phân tích

 Sự phát triển của tế bào được đánh giá bằng khối lượng tế bào khô (dry cell

weight - DCW) và mật độ tế bào (opical density - OD600) đo bằng máy đo

OD Khí H2 trong headspace được lấy bởi gas-tight syringe, thể tích mỗi lần hút là 100 µL (Australia) và được xác định bằng phương pháp sắc kí khí GC (7890A; Series: us11501033, USA) được trang bị với một máy dò dẫn nhiệt (TCD) và cột không gỉ cao 2m được bao bởi carboxen 1000, 50/80 mesh (Supelco) Nhiệt độ hoạt động của lỗ chích, lò phản ứng và thiết bị dò lần lượt là 120;60 và 120°C Argon được sử dụng như khí mang với tốc độ chảy

là 55 mL/phút

 Acid acetic và acid lactic được xác định bằng hệ thống sắc kí lỏng cao áp

được trang bị với một chỉ số phát hiện (Agilent 1100, USA): 50µL của 0.2µm môi trường bề mặt đã được lọc được tách ra trên một Rezex ROA- acid hữu cơ H+ (8%) cột 300 x 7.80 mm (Bio-Rad, USA) và được rửa bằng 0.5 mL/phút với 0.005 M °C ở nhiệt độ phòng Nồng độ cơ chất còn lại cũng được xác định bằng sắc kí lỏng cao áp (HPLC) :50µL của 0.2µm môi trường

bề mặt được lấy và phân tích trên một cột Rezex RCM-Monosaccharide (Bio-Rad) và được rửa với 0.5 mL/phút nước ở 60°C Phát hiện được thực hiện với một máy dò chỉ số khúc xạ (Agilent 1100, USA) Mỗi phép đo được lặp đi lặp lại ba lần

 Kết quả thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh ho ̣c

 Hiệu suất tạo hydro bằng số mol hydro được tạo ra trên cơ chất được tiêu

thụ, và được tính theo công thức sau:

o YH2 = nH2 /nS

(VớiYH2 là hiệu suất tạo hydro, nH2 là số mol H2 sinh ra, còn nS là số mol cơ chất tiêu thụ)

 Tốc độ chảy của số mol hydro được tính theo công thức sau :

(Trong đó: QH2 : tốc độ chảy của số mol hydro (mmol/h), FPH2: tốc độ chảy của thể tích khí từ lò phản ứng (mL/phút), R: Hằng số khí kí tưởng (0.08206 L.atm.mol-1.K-1), T ở 298 OK.)

 Lượng hydro sinh ra (mol) tại thời điểm t được tính theo công thức sau:

(Trong đó: NH2 : Lượng hydro sinh ra tại thời điểm t, QH2: Tốc độ chảy của số mol hydro (mmol/h)