Luận văn thạc sĩ vi sinh vật học

Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải là yếu tố thiết yếu cho độc lự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP

Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHAN LÊ THANH HƯƠNG

Hà Nội - 2013

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ S.suis 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Một số yếu tố độc lực chình của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán 5

1.1.3 Cơ chế gây bệnh của S.suis 7

1.2 SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis 15

1.3 BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 19

1.3.1 Đường lây truyền 19

1.3.2 Triệu chứng 19

1.3.3 Biện pháp phòng bệnh 20

1.3.4 Biện pháp chống dịch 21

1.3.5 Nguyên tắc điều trị 21

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM 22

1.4.1 Nuôi cấy phân lập 22

1.4.2 Nhuộm Gram 22

1.4.3 Phản ứng catalase 22

1.4.4 Xét nghiệm định danh, định typ: 23

1.4.5 Phát hiện vi khuẩn S suis bằng phản ứng Realtime PCR 23

1.5 PHƯƠNG PHÁP PCR 24

1.5.1 Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) 24

1.5.2 Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR 24

1.5.3 Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 34

2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 34

2.1.2 Dịch não tủy nền 34

2.1.3 Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tình do S suis (để đánh giá hiệu quả của quy trính PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 35

2.1.4 Sinh phẩm nghiên cứu 35

2.1.5 Trang thiết bị, dụng cụ 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 38

2.2.1 Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng 38

2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn 44

2.2.3 Nghiên cứu tối ưu chu trính nhiệt 45

2.2.4 Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng 47

2.2.5 Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trính PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên cứu Tình ổn định của PCR đa mồi 47

2.2.6 Đánh giá tình đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S suis 48

2.2.7 Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S suis 48 2.3 ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP 50

2.3.1 Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tình và âm tình 50

2.3.2 Các chỉ số tình toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 53

3.1.1 Tạo bệnh phẩm mô phỏng 53

3.1.2 Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: 54

3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 56

3.1.4 Tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn S suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 58

3.1.5 Độ nhạy và tình ổn định của quy trính PCR được xây dựng (khả năng lặp lại kết quả) 62

3.1.6 Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tình đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S suis 64

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC

HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU

QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) 65 3.3 ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 69 3.3.1 Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định được vi khuẩn từ bệnh phẩm: 69 3.3.2 Các chi số đánh giá độ chình xác và giá trị hữu ìch của các phương pháp 70

KẾT LUẬN 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC HÌNH

Hính 1.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kình hiển vi điện tử 3

Hính 1.2: Khuẩn lạc S suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa 4

Hính 1.3 Bệnh nhân bị nhiễm S suis 20

Hính 1.4 Sơ đồ phản ứng PCR 25

Hính 3.1 Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) 54

Hính 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16) 55

Hính 3.3 PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện trực tiếp S suis trong bệnh phẩm Error! Bookmark not defined Hính 3.4 Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl 59

Hính 3.5 Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 60

Hính 3.6 Thử nghiệm Quy trính PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 61

Hính 3.7 Mức độ phát hiện vi khuẩn S suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô phỏng) 62

Hính 3.8 Kiểm tra tình đặc hiệu của tổ hợp mồi & quy trính PCR đa mồi 64

Hính 3.9 Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và 900 C trong 60 phút 66

Hính 3.10 Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800 C với thời gian ủ khác nhau 67

Hính 3.11 Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60‟(đánh giá bởi PCR đơn mồi) Error! Bookmark not defined Hính 3.12 Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60‟ 67

Hính 3.13 Ứng dụng quy trính PCR đa mồi đã được xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis 4

Bảng 2.1 Một số trính tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên cứu [11,25,39,41] 37

Bảng 2.2 Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm 44

Bảng 2 3 Các chu trính PCR đa mồi được thử nghiệm 46

Bảng 2.3 Bảng số liệu cơ bản để tình toán các chỉ số 51

Bảng 2.4 Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc bệnh 51

Bảng 3.1 Kết quả khẳng định lại đặc tình của vi khuẩn dùng làm mẫu 53

Bảng 3.2 Các tổ hợp mồi thìch hợp được lựa chọn trong thì nghiệm 55

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các chu trính PCR đến khả năng phát hiện S.suis 56 Bảng 3.4 Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay đổi điều kiện quy trính PCR đa mồi 57

Bảng 3.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát 58

Bảng 3.6 Tình ổn định của Quy trính PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm63 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng kit 65

Bảng 3.8 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144 70

Bảng 3.9 So sánh kết quả ba phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi và NCPL71 Bảng 3.10 Các chỉ số đánh giá độ chình xác và sự hữu ìch của phương pháp PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153) 71

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của

vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho

người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch

Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tình ở người do S suis đã và đang được coi là

một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn như Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện

Trung ương Huế đã cho thấy S suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây

bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở người lớn tại Việt Nam

Ở các nước có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S suis bởi các kỹ thuật

nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chì các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến

Ở Việt Nam, ví sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng như sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thì ngiệm, những phương

pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S suis rất khó có thể áp dụng rộng

rãi Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chình xác, phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tình khả thi hơn cả về mặt kinh tế

và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng (Real time PCR) Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện được sự có mặt của

vi khuẩn S suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen

độc lực của vi khuẩn Phương pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao

Chình ví vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn

thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch

não tủy của người” với 2 mục tiêu chình sau đây:

- Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S suis ở bệnh phẩm

người;

- Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA

của S suis

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis

1.1.1 Giới thiệu chung

Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dương, kỵ khì tùy tiện, kìch thước

khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào Trong bệnh phẩm, chúng thường

xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hính 1.1) S.suis có yếu tố quyết định kháng

nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này

Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S suis thuộc nhóm R,

S và T tương ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36] Nhưng đến năm 1995,

dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu được S.suis có tổng cộng 35

type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhưng typ 32 và 34 vừa được

chứng minh là Streptococcus orisratti Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho người

đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [50] Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ìt trường hợp gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14

Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử

Vi khuẩn S suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5- 10% CO2, mọc trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như môi trường thạch máu, thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thìch hợp

370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH

thìch hợp 7–7,2 Sau 24 giờ, ở 370

C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy

S suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trường thạch máu cừu và tan huyết

dạng beta trên môi trường thạch máu ngựa (Hính 1.2)

Hình 1.2: Khuẩn lạc S suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa

Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chưa được biết nhưng nhiều gen

đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã được nghiên cứu Đó là những

gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế

sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống

arginine deminase và các protein gắn IgG Có 17 chủng S suis đã được giải

trính tự gen Tùy từng chủng, bộ ben có kìch thước từ 2,01 đến 2,18 Mb với

tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7% Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427

gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis

Chromosomes [13] Scaffolds or contigs [3] SRA or Traces [0] No data [1]

trạng Chr Plasmids

KT (Mb)

TT Vi sinh vật Tình

trạng Chr Plasmids

KT (Mb)

-Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome

1.1.2 Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán

*Vỏ polysacarit của vi khuẩn

S suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps) Việc

định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 được cho là có liên quan nhiều hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đường: Galactose, glucose, N-acetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid Ở typ 2, N-acetyl glucosamine được thay thế bằng rhamnose Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ khác chưa được nghiên cứu sâu

*Suilysin

Suilysin là một yếu tố gây tan huyết được mã hóa bởi gen sly của S suis

Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tương đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae)

Gen sly có mặt ở hầu hết các typ Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai Suilysin có khả năng gây tổn thương tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thì nghiệm được tiến hành in

vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch) Ngoài ra, suilysin còn có

thể "khởi động" cho quá trính sản xuất và tác động của các cytokine Thì nghiệm sử

dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hưởng khác nhau của suilysin

tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến

Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải

là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn

acid glycoprotein (SAGP)

ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trính biến đổi arginine thành ornithine Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp Hệ thống ADS có mặt

trong tất cả các chủng vi khuẩn S suis

*Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef)

Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động

vật bị bệnh nhưng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền bệnh Ở các chủng gây bệnh trên người, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số

chủng phân lập được mang gen mrp

Mrp và ef cũng được coi là các yếu tố chỉ thị cho S suis typ 2 Các chủng vi

khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là

ef*) Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã được xác định Biến

thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có mặt ở typ 9 Các chủng Canada không có mrp và ef Đã có nghiên cứu gây nhiễm

trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực chẳng khác gí vi khuẩn thể hoang dại Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần được làm sáng tỏ bằng các thì nghiệm gây nhiễm thực nghiệm

*Các yếu tố độc lực khác

Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hưởng ở những

giai đoạn khác nhau của quá trính bệnh lý Cũng như vậy, đối với vi khuẩn S suis,

gần 40 gen khác nhau đã được tím thấy (theo Smith và cs, 2001) Các gen này mã hóa cho các protein có chức năng như: yếu tố điều hòa, vận chuyển, đảm nhận chức năng đối với quá trính sinh lý của bản thân vi khuẩn và cả các nhóm chưa xác định

được chức năng Một nghiên cứu gây nhiễm bằng chủng S suis có độc lực yếu và

bổ sung thêm các gen từ các chủng gây bệnh đã tím thấy chuỗi nucleotide có kìch thước 3kb mang thông tin quan trọng liên quan đến độc lực của vi khuẩn

Năm 2004, Allen và cs đã xác định yếu tố làm tan có khả năng hỗ trợ cho sự xâm nhập của vi khuẩn qua tác động đến acid hyaluronic (tương tự như tác động của nhiều loại vi khuẩn khác)

1.1.3 Cơ chế gây bệnh của S.suis

Quá trình xâm nhập

Cơ chế xâm nhập của S suis vào vật chủ ìt được biết đến Các tác nhân gây

bệnh có thể tồn tại trong amidan lợn trong thời gian dài Mô lympho của amidan được bao phủ bởi các biểu mô niêm mạc Đặc biệt ở lợn, diện tìch bề mặt vòm miệng tăng đáng kể do biểu mô lõm sâu trong các mô bạch huyết hính thành rất nhiều phân nhánh [49] Có thể là sau khi bám dình và xâm nhập vào các tế bào biểu

mô amidan, vi khuẩn vẫn chưa bị phát hiện bởi hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, vẫn

chưa có nghiên cứu nào giải thìch việc làm thế nào S suis có thể vượt qua hàng rào

bảo vệ đầu tiên của vật chủ để gây bệnh Giả thuyết được chấp nhận nhất hiện nay

là các tác nhân gây bệnh làm thủng biểu mô niêm mạc trong đường hô hấp trên của

lợn [21] Tương tự như vậy, đối với con người, S suis có thể tương tác với các tế

bào biểu mô ở bề mặt biểu bí hoặc trong ruột [22, 31] Có rất ìt nghiên cứu về cơ

chế tương tác giữa S suis và các tế bào biểu mô, ngoại trừ tế bào biểu mô của đám rối màng mạch Nó đã được báo cáo rằng các chủng độc lực của S suis có thể bám

vào các tế bào biểu mô đường hô hấp của người [6, 32, 44] Các chất bám dình trên

bề mặt của S suis có thể bị cản trở bởi vỏ polysaccharide (CPS) của chúng Sự bám dình và sự xâm nhập của S.suis vào tế bào biểu mô HEP-2 ở người diễn ra mạnh mẽ

hơn ở những chủng không có vỏ đã được báo cáo bởi Benga et al [6] Ví vậy, điều

đó có thể được đưa ra giả thuyết rằng S suis giảm sự biểu hiện của CPS trong các

bước đầu của quá trính lây nhiễm Giả thuyết này cần được nghiên cứu sâu hơn

S suis tương tác với các thành phần của chất nền ngoại bào (ECM) như

fibronectin và plasminogen [16] Các protein Fbps liên kết với fibronectin của người và fibrinogen khi thực hiện trong phòng thì nghiệm [14] Tuy nhiên, khi làm đột biến gen fbps không làm giảm khả năng liên kết với fibronectin của người [16], điều này cho thấy tồn tại khả năng dự phòng của vi khuẩn này trong quá trính liên kết với các ECM Thử nghiệm lây nhiễm các chủng đột biến fbps cho thấy Fbps không cần thiết cho sự xâm nhập của vi khuẩn vào amidan của lợn (bước đầu tiên của nhiễm trùng) nhưng nó có thể đóng vai trò trong quá trính xâm nhập vào cơ quan khác [14] Enolaza ở bề mặt của vi khuẩn có vai trò trong sự liên kết giữa vi

khuẩn và plasminogen [42] Enolaza của S suis không chỉ liên kết với plasminogen

mà còn liên kết với cả fibronectin Enolaza của S suis biểu hiện cao trong cơ thể

lợn bị bệnh sẽ gây đáp ứng sản xuất kháng thể, mặc dù tiềm năng để enolaza được biết đến như là một kháng nguyên bảo vệ vẫn còn gây tranh cãi [15, 58] Gần đây,

một dipeptidylpeptidase (DppIV) của S suis cũng được chứng minh là tương tác

với fibronectin của người, tình độc hại của một chủng bị đột biến thiếu dppIV bị suy

yếu đáng kể [18] Sự liên kết của S suis với collagen cũng đã được báo cáo [16] Chủng S suis bị đột biến mất sortase SrtA cũng làm giảm khả năng bám dình với

protein ECM [55], điều này cho thấy các peptidoglycan cũng rất quan trọng đối với

sự tương tác của các tác nhân gây bệnh này với các protein ECM

Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng sự bám dình của vi khuẩn vào tế bào biểu

mô như là một mô hính để đánh giá các yếu tố độc lực Một loại enzyme với hoạt tình 6-phosphogluconate-dehydrogenase, amylopullulanase, tất cả đều góp phần vào

sự bám dình của S suis vào tế bào biểu mô [17] Đột biến mất các yếu tố điều hòa 2

thành phần CiaRH hoặc điều hòa phiên mã RevSC21 và CovR cũng làm cho sự

bám dình của S.suis vào tế bào biểu mô bị suy giảm đáng kể [46, 57] Tuy nhiên, cơ

chế của hiện tượng này vẫn chưa được biết đến

Ngoài các chất bám dình như trên thí suilysin rất độc hại cho tế bào [21] Suilysin là một hemolysin 54-kDa, là một chất độc có hoạt tình thiol tác dụng vào cholesterol trong màng của các tế bào có nhân điển hính [20] Tuy nhiên, các chủng không sản xuất suilysin cũng có thể để đi đên các mạch máu và khuếch tán trong cơ thể vật chủ

IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh ở niêm mạc Vi khuẩn có khả năng sản xuất IgA protease để hạn chế số lượng của IgA chức năng Chúng cũng có thể tận dụng lợi thế của các mảnh Fab sinh ra để tăng cường sự kị nước bề mặt (và do đó bám dình vào tế bào vật chủ) và ngăn sự xâm nhập của các kháng thể còn nguyên vẹn [42] Gần đây, một báo cáo đã cho

thấy S suis sản xuất IgA1protease có khả năng hiệu quả trong việc phá hủy IgA1

của người [59]

Sự tồn tại của vi khuẩn trong máu và sự lây nhiễm

Như đã đề cập ở trên, sự xâm nhập của vi khuẩn hoặc làm tổn thương tế bào

có thể được coi là bước đầu tiên của sự phát triển bệnh Giả thuyết cho rằng S suis

có thể xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn chủ yếu qua các amiđan vòm miệng, sau khi bám dình và xâm nhập vào các tế bào biểu mô và tương tác với các tế bào tủy

[42] Khi S suis xâm nhập vào các mô bên trong và máu, đó là nguyên nhân chình

để kìch hoạt sự hoạt động của các tế bào thực bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh

Tuy nhiên, khi kháng thể đặc hiệu không có mặt, S suis có thể chống lại thực bào

và tồn tại trong máu ở nồng độ cao và gây viêm Vi khuẩn tồn tại chủ yếu phụ thuộc

vào việc sản xuất các CPS CPS bảo vệ S suis khỏi bạch cầu trung tình và thực bào đơn nhân/đại thực bào [19] Nghiên cứu về cấu trúc CPS của S suis týp huyết thanh

2 gần đây cho thấy sự có mặt của galactose (Gal), Gal liên kết 6, Gal liên kết 3, 4,

N-acetyl-glucosamine (GlcNAc4) liên kết 4, và rhamnose liên kết 3, 4 CPS của S

suis tương tự như liên cầu khuẩn nhóm B (GBS), cũng có chứa N-acetyl-neuraminic

acid (sialic acid) liên kết với phìa cuối của chuỗi CPS Tuy nhiên, trong khi axit

sialic của GBS là liên kết 2-3 Gal, S suis là 2-6 Gal [42] Acid sialic đã được chứng

minh là quan trọng trong việc ngăn ngừa sự bám dình của protein C3 trên bề mặt của GBS và cho phép cho GBS kháng lại sự tiêu giệt trong tế bào phụ thuộc opsonin [42] Một vai trò như vậy vẫn chưa được chứng minh đối với axit sialic của

S suis Một thì nghiệm tạo ra chủng đột biến mất gen neuC đã được thực hiện

(neuC mã hóa epimerase UDP GlcNAc cần thiết cho quá trính sinh tổng hợp acid sialic), kết quả là ngăn cản toàn bộ quá trính lắp ráp, biểu hiện của CPS Điều đó đã chứng minh rằng axit sialic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trính gây bệnh của

S.suis [42].Các chủng type huyết thanh khác mà lớp vỏ capsit cũng chứa axìt sialic

như các type huyết thanh 1 và 16, đôi khi cũng gây bệnh ở người [42] Axìt sialic

cũng đã được chứng minh liên quan đến việc bám dình của S suis với bạch cầu đơn

nhân, ví thế giả thuyết được đặt ra là các tác nhân gây bệnh sẽ di chuyển trong máu

mà không liên kết với các tế bào thực bào này [21] Cuối cùng, một giả thuyết về

sự bắt chước cấu trúc phân tử đã được đề xuất [19], dựa trên thực tế là axit sialic liên kết 2-6 được tím thấy trong vỏ capsit của type huyết thanh 2 và 14 [42] tương

tự như đường epitope trên bề mặt của tất cả các tế bào động vật có vú [22] Điều này có thể dẫn đến việc nhận biết kháng nguyên của vật chủ bị ảnh hưởng Trong

thực tế, S suis kiểu huyết thanh 2 đã được báo cáo là khi nhiễm vào vật chủ gây đáp

ứng miễn dịch kém ở cả lợn và ngựa [42]

Mặc dù vai trò của CPS rất quan trọng góp phần vào sự hính thành nên tình

độc của S.suis Nhưng thực tế là một chủng có vỏ capsit không có nghĩa là chủng có độc tình Điều này đã chỉ ra rằng sự tồn tại trong máu của S.suis không chỉ dựa vào

lớp vỏ capsit mà còn dựa vào nhiều yếu tố khác Thực tế, những chủng có vỏ nhưng

không có độc lực có thể chỉ tồn tại trong máu trong vòng 48h, các chủng có độc lực

có thể tồn tại trong vài ngày Khả năng chống lại sự thực bà của vi khuẩn còn liên quan đến quá trính biến đổi thành tế bào peptidoglycan bằng N-deacetylation Một chủng đột biến có vỏ capsit nhưng không có PgdA deacetylase, chịu trách nhiệm làm biến đổi peptidoglycan bị giảm khả năng kháng lại bạch cầu trung tình khi thì nghiệm trên các mô hính lây nhiễm ở chuột và lợn Tương tự như vậy, D-alanylation của axìt lipoteichoic (LTA) đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại của tác nhân gây bệnh này [42] Một chủng đột biến không có D-alanine của LTA nhạy cảm hơn với peptide kháng khuẩn và bị giết chết bởi bạch cầu trung tình của lợn, chuột Ngoài ra các cấu trúc thành tế bào lớn, nhiều protein bề mặt làm tăng khả năng tạo các kháng thể và tăng khả năng bị thực bào [42, 58] Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động của các protein này, vai trò của chúng vẫn còn chưa biết Mặc dù chủng không có suilysin có thể là chủng độc lực và tồn tại trong máu, nhưng các chủng có suilysin có tình độc cao hơn với bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tình

[42] Hơn nữa, sự tồn tại của suilysin làm giảm thực bào và giết chết S suis [42]

S suis yêu cầu các chất dinh dưỡng bao gồm cả các nguyên tố kim loại, có

hàm lượng tương đối thấp trong vật chủ AdcR, một yếu tố phiên mã liên cầu khuẩn tương đồng với Zur điều hòa sự hấp thu kẽm và Fur điều hòa sự hấp thu sắt điều Cả

hai yếu tố này quan trọng cho sự sống còn S suis trong cơ thể [42] Ngoài ra, một

dòng đột biến không có yếu tố vận chuyển sắt (FeoB) đã bị suy giảm khả năng sống sót trong một mô hính thì nghiệm trên chuột lây nhiễm [42] Sử dụng trong công nghệ biểu hiện trong cơ thể sống đã khám phá các gen cpsA, mã hóa một yếu tố giả định điều hòa sinh tổng hợp của CPS và IRI-7, đồng đẳng với rpgG của liên cầu, một gen liên quan đến quá trính sinh tổng hợp vỏ capsit [ 52] Giả thuyết được đề

xuất là CPS của S suis trở nên dày hơn sau khi tăng trưởng trong cơ thể, sắt tự do

khan hiếm, làm tăng cường sự điều hòa biểu hiện của cps2A và rpgG có thể xảy ra [52] Mặc dù đây là một giả thuyết hấp dẫn, một sự liên quan rõ ràng giữa sự thiếu sắt và sản xuất CPS vẫn còn phải được xác minh Trong thực tế, có báo cáo cho

rằng S suis có thể thìch nghi với môi trường bị hạn chế sắt bằng cách thay đổi trong

chuyển hóa của nó, thay thế sắt bằng mangan, magiê [42] Ngoài ra, lipoprotein

TroA cần thiết cho sự tăng trưởng S suis trong các môi trường có mangan thấp,

lipoprotein này rất quan trọng cho sự sống còn của vi khuẩn trong cơ thể Gần đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành thì nghiệm làm bất hoạt làm mất lipoprotein tham gia trong sự hấp thu kẽm, kết quả độc tình bị giảm 50 lần so với chủng ban đầu Superoxide dismutase (Sod) là một yếu tố độc lực của vi khuẩn gây bệnh bằng cách làm giảm quá trính oxy hóa của tế bào thực bào Khung đọc mở SSU1356 của một chủng SS2 lâm sàng ZJ081101 mã hóa một loại protein trên 201 axit amin khác

81 – 88% so với các Streptococcus spp Thì nghiệm đột biến làm mất gen sod

(Δsod) từ chủng lâm sàng được thực hiện Kết quả cho thấy, các chủng bị đột biến mất gen sod dễ bị oxy hóa hơn các chủng hoang dại Một thì nghiệm khác cũng chứng minh độc lực của chủng SS2 bị suy giảm đáng kể ở chuột khi bị đột biến mất gen sod [42]

Hiện tượng viêm và sốc nhiễm trùng

Hoạt động của hệ thống miễn dịch trong khi vật chủ bị lây nhiễm vi sinh vật nói chung là bảo vệ, sốc nhiễm trùng như là một hệ quả của phản ứng miễn dịch quá mức hoặc quá yếu của vật chủ Một phản ứng không cân bằng có thể gây tổn hại cho vật chủ do quá trính tiết các hợp chất tạo viêm nội sinh không được kiểm soát Bằng chứng là hội chứng sốc độc cũng như các trường hợp sốc nhiễm trùng ở châu

Âu và châu Á gây ra do S suis (với thời gian ủ bệnh ngắn, tiến triển bệnh nhanh

chóng và tỷ lệ tử vong cao), một chất trung gian quan trọng trong giai đoạn tiền

viêm được sản xuất khi toàn bộ hệ thống bị nhiễm S suis [22] Như vậy, khả năng sản xuất cytokine của S suis có thể đóng vai trò quan trọng Trước đây chủng độc lực S.suis týp huyết thanh đã được chứng minh có khả năng sản xuất các cytokine

tiền viêm ở lợn, chuột và người Điều này được chứng minh trong cơ thể sống trên

mô hính chuột bị nhiễm S suis với giai đoạn sớm là sốc nhiễm trùng và giai đoạn

muộn là viêm màng não / viêm não [42] Các mức độ cao của cytokine hệ thống TNF-α, IL-6 và IL-12, IFN-γ và chemoattractants CCL2/MCP-1, CXCL1/KC, và CCL5/RANTES quan sát thấy trong cơ thể trong vòng 24 giờ sau khi nhiễm được cho là chịu trách nhiệm về cái chết ban đầu của động vật Sự tăng cường điều chỉnh

Cytokine IL-10 được thực hiện sau sự sản xuất mạnh mẽ của hầu hết các cytokine tiền viêm, chỉ ra một cơ chế liên hệ ngược âm tình để kiểm soát mức độ của phản ứng viêm

Hầu hết các yếu tố của S.suis liên quan đến hiện tượng viêm ở vật chủ vẫn

chưa được biết Nhiều nghiên cứu với các đột biến làm mất vỏ capsit chỉ ra các thành phần thành tế bào vi khuẩn là các yếu tố chình cảm ứng sản xuất cytokine nhưng cơ chế vẫn chưa được nghiên cứu Lipoprotein có mặt trong thành tế bào có thể một phần chịu trách nhiệm về sự nhận dạng của thụ thể trên tế bào [42] Rất gần đây, nó đã được chỉ ra rằng một prolipoprotein giả định diacylglyceryl transferas có

mặt trong thành tế bào S suis là cần thiết để kìch hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh

[42] Tuy nhiên, các yếu tố khác cũng có thể đóng góp vào quá trính gây viêm Suilysin kìch hoạt các đại thực bào và gây ra việc sản xuất các cytokine tiền viêm [42] Ngoài ra, suilysin có thể tạo ra hemoglobin từ các tế bào hồng cầu, góp phần nâng cao mức độ của các yếu tố trung gian tiền viêm bằng cách hoạt hóa các thành

phần của thành tế bào S suis Một subtilisin protease (SspA) gần đây đã được

chứng minh liên quan đến việc kìch thìch việc tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokines khác nhau bởi các đại thực bào Nồng độ thấp của SspA làm cho CCL5 được tiết ra với hàm lượng cao, trong khi việc sử dụng các protein tương tự ở nồng

độ cao thí hàm lượng CCL5 thấp S suis có thể là tăng khả năng tiết các chất trung

gian gây viêm dẫn đến việc thu hút số lượng lớn bạch cầu và tiết các chất trung gian

khác gây viêm nhiễm Tuy nhiên, S suis có thể điều chỉnh phản ứng này để phục vụ

cho sự tồn tại của nó bằng cách tìch cực làm giảm các chemokines do đó trí hoãn sự thu hút bạch cầu trung tình vào vị trì bị viêm nhiễm

Sự xâm nhập hệ thần kinh trung ương và viêm màng não

Nếu bệnh nhân không bị tử vong do nhiễm trùng huyết hoặc hội chứng sốc

độc, nhưng mức độ nhiễm trùng huyết vẫn còn cao, S suis có thể gây ra bệnh viêm

màng não [7, 8] Đáng chú ý, trong một số trường hợp nhiễm trùng có thể không xuất hiện và viêm màng não có thể xảy ra bất ngờ Giống như các tác nhân gây

bệnh khác, S suis phải vượt qua hàng rào máu não (BBB) và / hoặc chất dịch máu -

não tủy (CSF) để gây ra nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương BBB là một rào cản duy nhất về giải phẫu và chức năng ngăn cách giữa não và nội mạch bằng cách duy trí sự cân bằng nội môi của môi trường hệ thần kinh trung ương [42] Các loại tế

bào chình của hàng rào máu não là tế bào nội mô vi mạch của não(BMEC) S.suis

bám dình nhưng không xâm nhập vào các tế bào BMEC của người Các yếu tố vi khuẩn liên quan đến sự bám dình không được làm sáng tỏ và không có sự tham gia

của CPS vào quá trính này S suis có thể tồn tại 7 h trong tế bào BMEC của lợn Các thành phần huyết thanh cũng có thể tham gia vào sự tương tác giữa S suis và

các tế bào BMECs của lợn Trong số đó, fibronectin đóng một vai trò quan trọng trong sự tương tác này; Ngoài ra, các kháng thể chống lại enolase (protein liên kết

fibronectin quan trọng của S suis) làm giảm đáng kể sự bám dình và sự xâm nhập của S.suis vào tế bào BMEC của lợn [42] Các chủng có Suilysin cũng có thể phá vỡ

hàng rào máu não thông qua các hiệu ứng độc tế bào, với hàm lượng cao của các

chủng có suilysin gây độc cho các tế bào BMEC của lợn Tuy nhiên, suilysin không

phải là yếu tố quyết định ví các chủng đột biến mất suilysin vẫn có thể xâm nhập vào các tế bào này

Một cách khác để S suis có thể xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương cho

có thể là các tế bào biểu mô đám rối thần kinh màng mạch của hàng rào dịch não tủy Thật vậy, mặc dù hàng rào máu-dịch não tủy có một diện tìch bề mặt nhỏ hơn so với hàng rào máu não, nó có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự di chuyển của vi khuẩn cũng như trong luân bạch cầu Gần đây, một thử

máu-nghiệm về sự xâm nhập và di chuyển của S suis qua hàng rào máu-dịch não tủy

đã được thực hiện Sự di chuyển của S.suis qua hàng rào máu-dịch não tủy đã kìch hoạt bạch cầu trung tình S suis gây ra hoại tử tế bào CPEC, mặc dù

apoptosis cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trính làm chết tế bào Suilysin đó đóng một vai trò quan trọng như là một chất độc ảnh hưởng đến chức năng hàng rào máu-dịch não tủy, tuy nhiên, các yếu tố hòa tan khác cũng có thể tham gia vào quá trính này

Viêm màng não, chấn thương não và chết tế bào thần kinh là triệu chứng liên quan đến phản ứng của vật chủ với các yếu tố của vi khuẩn Một thì nghiệm thực hiện trên cơ thể sống cho thấy rằng những con chuột bị nhiễm bệnh sống sót sau giai đoạn nhiễm trùng máu có thể phát triển các dấu hiệu nghiêm trọng của tính

trạng viêm ở hệ thần kinh trung ương S suis có thể kìch thìch các tế bào BMEC tiết

acid arachidonic, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào hệ thần kinh

trung ương [135] Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng S suis có thể kìch thìch tế

bào BMEC của người và lợn tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokines, tiểu thần kinh đệm và các tế bào hính sao ở chuột [42]

1.2 SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis

Streptococcus suis (S suis) hay còn gọi là liên cầu khuẩn lợn là một trong

những vi sinh vật gây bệnh ở lợn làm tổn thất lớn về kinh tế Bệnh xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới và hầu hết ở các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển Các biểu hiện bệnh lý của lợn bao gồm viêm màng não, viêm khớp, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, các ổ áp xe Nghiêm trọng hơn, vi khuẩn có thể gây bệnh cho người với các biểu hiện của viêm màng não, nhiễm trùng máu, viêm nội tâm mạc v.v Chình ví vậy, bệnh được xếp vào nhóm các bệnh chung của người và động vật

S suis lần đầu tiên được báo cáo bởi các bác sĩ thú y năm 1954, sau khi bùng

phát dịch viêm màng não, viêm khớp nhiễm khuẩn huyết, và có mủ xảy ra ở lợn con

[23] Sau đó, vào năm 1968, bệnh do S suis được ghi nhận ở người qua mô tả lần

đầu tiên về 2 trường hợp viêm màng não mủ và một trường hợp nhiễm trùng huyết nặng tại Đan Mạch Từ đó, bệnh được ghi nhận ở các nước khác thuộc Châu Âu (Anh, Hà lan,…) và Hồng kông [23]

Tại Anh, trong khoảng từ năm 1975 đến năm 1990, có tất cả 35 trường hợp

nhiễm Streptococcus suis được báo cáo, trong số đó, 34 trường hợp bệnh nhân nam

25 bệnh nhân đã được xác nhận bị nhiễm Streptococcus suis từ năm 1984 và

1993 ở Hồng Kông Trong số đó, 15 trường hợp (60%) đã có một tiếp xúc với lợn hoặc thịt lợn Xét nghiệm dịch não tủy của 21 bệnh nhân đã xác nhận sự hiện diện của viêm màng não, 4 bệnh nhân còn lại bị viêm khớp, viêm phế quản phổi, viêm nội tâm mạc và sốt [30]

Có 7 trường hợp nhiễm S suis ở Nhật Bản từ năm 1994 đến 2006 Tất cả các

trường hợp có tiếp xúc với lợn và 5 người trong số họ đã có tổn thương da tay trong quá trính tiếp xúc 5 trường hợp trên có các triệu chứng của viêm màng não, nhiễm

trùng huyết, và có 1 trường hợp đã tử vong Tất cả S suis được phân lập thuộc

nhóm D theo phân loại của Lancefield và týp huyết thanh 2 Chúng nhạy cảm với penicillin G, ampicillin, cefotaxim, và ciprofloxacin Tuy nhiên, sáu trong số chúng

có khả năng kháng cả erythromycin và clindamycin, và cũng đề kháng với minocycline [9]

Một nghiên cứu hồi cứu đã được tiến hành tại Bệnh viện Đại học Chiang Mai

từ tháng 5 năm 2000 đến tháng 12 năm 2002 Theo nghiên cứu, 41 bệnh nhân (32

nam và 9 nữ, tuổi trung bính là 51 tuổi) được xác định lây nhiễm S suis Trong đó,

3 bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với lợn hoặc thịt lợn và 1 bệnh nhân đã ăn thịt bò sống [56]

Từ ngày 1/1/2003-31/7/2005, có 21 trường hợp được xác định là nhiễm S suis

, trong đó có 1 trường hợp (5%) tử vong, 18 trường hợp (86%) là nam giới và 3 trường hợp (14%) là nữ Độ tuổi trung bính là 62 tuổi (từ 26-89 tuổi), 12 trường hợp (57%) khởi phát bệnh trong tháng 5, tháng 6, tháng 7 hoặc tháng 8 Họ sống ở các huyện khác nhau ở Hồng Kông và không có phân nhóm địa lý [37]

Gần đây, trong tháng 7-8/2005, tại tỉnh Sichuan, Trung Quốc đã xảy ra một

vụ dịch lớn do S suis lây truyền từ lợn sang người Tổng số 215 người mắc,

trong đó, 61 (người) 28% trường hợp nhiễm khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng nhiễm độc, 38 người chết (62%), 48% viêm màng não mủ Tỷ lệ tử vong trung bính của tất cả các trường hợp > 20% Một số trường hợp sau khi khỏi bệnh

nhiễm khuẩn S suis cấp tình bị những di chứng như điếc không hồi phục, mất

thăng bằng [28]

Tổng số người nhiễm S suis báo cáo cho đến khi tháng 8 năm 2006 ≈ 400, và

gần 90% các trường hợp này xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan, Hồng Kông, Đài

Loan, và Hà Lan Tất cả các trường hợp người nhiễm S suis đã báo cáo hầu hết là

typ 2, ngoại trừ 1 trường hợp typ huyết thanh 1, 1 trường hợp typ huyết thanh 4, và

1 trường hợp typ kiểu huyết thanh 14 [27]

Số lượng trường hợp lây nhiễm S suis ở người báo cáo đã tăng đáng kể Trong một bài báo xuất bản năm 2007, 409 trường hợp con người S suis được báo

cáo, hầu hết trong số đó xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan và Hà Lan, 73 trường hợp

bị tử vong [35]

Từ 2000-2011, 8 bệnh nhân bị nhiễm S suis đã được xác định ở Đài Loan Sáu trường hợp ban đầu được xác định nhầm là Streptococcus acidominimus, nhưng sau khi giải trính tự gen 16S rRNA của chủng phân lập được thí chúng được xác định là

S suis Đa số các trường hợp trên được xác định là S.suis typ 2 [29]

Một nghiên cứu về sự lây nhiễm S suis ở người đã được tiến hành ở tỉnh Phayao, miền bắc Thái Lan trong năm 2010 Có 31 trường hợp S.suis đã được xác

nhận trong nghiên cứu này Các trường hợp tử vong chiếm tỉ lệ 16,1%, và tỷ lệ ước tình là 6,2/100.000 người dân Tỷ lệ mắc cao điểm xảy ra vào tháng 5 Độ tuổi trung bính của bệnh nhân là 53 tuổi và 64,5% trong số đó là nam giới Có 22 trường hợp

bị lây nhiễm là do tiêu thụ thịt lợn sống và thời gian ủ bệnh trung bính là 2 ngày

Trong số các chủng được phân lập từ 31 bệnh nhân, 23 bệnh nhân bị nhiễm S.suis typ 2 (74,2%) 8 bệnh nhân bị nhiễm S.suis typ 14 (25,8%) [12]

Trong số 116 trường hợp viêm màng não do S suis ở Bệnh viện Bệnh nhiệt

đới Thành phố Hồ Chì Minh từ năm 1997 đến năm 2005, 115 trường hợp dotyp huyết thanh 2 và 1 trường hợp do typ huyết thanh 14 [27]

Trong hai năm 2005 - 2006, có 72 trường hợp nhiễm S.suis nhập Bệnh viện

Bệnh nhiệt đới Thành phố Hồ Chì Minh, 58 bệnh nhân (81%) là nam giới Phần

lớn bệnh nhân là nông dân, 38% bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với lợn hay thịt lợn, tuy nhiên chỉ có 6 bệnh nhân (8%) có tổn thương da nghi ngờ 69 bệnh nhân (96%) biểu hiện bệnh cảnh viêm màng não như: sốt, nhức đầu, ói, cổ cứng, rối loạn tri giác là những triệu chứng thường gặp 68% trường hợp viêm màng não mủ

có triệu chứng ù tai, điếc Một bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết bị sốc do nhiễm độc

tố liên cầu Sau 10 đến 14 ngày dùng kháng sinh Ceftriaxone, hầu hết bệnh nhân đều hồi phục Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được còn nhạy cảm với penicillin và ceftriaxone [1, 2]

Nhưng năm 2007 có tới hơn 48 ca (22 ca ở miền Bắc, 20 ca ở miền Nam, 6 ca

ở miền Trung) được chẩn đoán bị bệnh liên cầu khuẩn lợn, có một số ca xét nghiệm

xác định được tác nhân gây bệnh là S.suis týp II Có 3 ca trong số này đã tử vong

Từ tháng 1/2007 đến tháng 09/2008 : 68 trường hợp tại Bệnh viện Nhiệt đới trung ương

Từ tháng 1/2006 đến tháng 12/2010 có hơn 140 trường hợp viêm màng não và nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Trung ương Huế

Một trường hợp nhiễm S.suis typ 16 tại Việt Nam vào năm 2001 đã được báo

cáo Bệnh nhân là nam giới, 57 tuổi, quê tại tỉnh Long An [27].Typ huyết thanh 16 chưa từng được phân lập từ người trong các báo cáo trước đó và cũng rất ìt gây bệnh ở lợn, chỉ có 1 trường hợp ở Đức và 4 trường hợp tại Hàn Quốc [27]

Một nghiên cứu thực hiện trên 450 bệnh nhân nghi ngờ viêm màng não vi khuẩn 435 (96,7%) bệnh nhân tham gia trong một thử nghiệm để xác định hiệu quả

điều trị dexamethasone adjunctive Đối với bệnh nhân bị nhiễm S suis, DNA của vi

khuẩn ở bệnh nhân lúc nhập viện bệnh viện và trong quá trính điều trị đã được phân tìch trong các mẫu dịch não tủy bằng cách sử dụng kỹ thuật Realtime PCR Các yếu

tố độc tình giả định, bao gồm cả yếu tố ngoại bào protein, suilysin, và protein sản xuất muramidase, đã được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR và Western

blot Kết quả cho thấy S suis là tác nhân gây bệnh phổ biến nhất và được phát hiện

trong 151 (33,6%) bệnh nhân Có 50 (33,1%) bệnh nhân báo cáo tiếp xúc với lợn

hoặc thịt lợn Tỷ lệ tử vong thấp (2,6%; 4/ 151 bệnh nhân đã chết), nhưng mức độ nhẹ đến mất thình lực nghiêm trọng xảy ra ở 93 bệnh nhân (66,4%).Những trường hợp điếc nặng thường có độ tuổi> 50 DNA của vi khuẩn vẫn được phát hiện trong

58 (63%) trong tổng số 92 mẫu dịch não tủy sau 6-10 ngày điều trị kháng sinh

91/92 mẫu dịch não tủy nhiễm chủng S suis có týp huyết thanh 2 [43]

1.3 BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG

1.3.1 Đường lây truyền

Streptococcus suis có thể lây truyền qua người khi tiếp xúc với lợn bệnh hay

lợn mang vi khuẩn qua các tổn thương nhỏ, trầy xước trên da của những người giết

mổ, chế biến và ăn thịt lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn nấu không chìn Hiện nay, chưa có bằng chứng bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ người sang người Lợn mang vi khuẩn là nguồn lây nhiễm chình Bệnh có thể truyền qua đường

hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm khuẩn.Vi khuẩn có thể vẫn có mặt ở hạch hạnh nhân của lợn sau khi đã được điều trị bằng kháng sinh penicillin Lợn nái có thể mang vi khuẩn trong tử cung và âm đạo Lợn có thể bị nhiễm vi khuẩn ở bất kỳ tuổi nào Khả năng nhiễm và gây bệnh của vi khuẩn ở lợn con cao hơn ở lợn trưởng thành Các đàn lợn non trong trạng thái chịu stress và tiếp xúc với nguồn bệnh sẽ có khả năng phát bệnh cao

Phân, chất độn chuồng, các loại thức ăn và nước uống trong chuồng nuôi có thể trở thành nguồn bệnh thứ cấp Các động vật khác có khả năng truyền bệnh bao gồm ruồi, gián, chuột [1]

khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng nhiễm độc, có biểu hiện suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc (1,1%), viêm khớp (1,1%), viêm phổi (0,8%) và viêm phúc mạc (0,3%)

Ở thể viêm màng não mủ, bệnh nhân bị sốt cao, đau đầu, ớn lạnh, buồn nôn, nôn và chóng mặt Tiếp theo có thể có một hay nhiều triệu chứng sau: điếc, mất thăng bằng, hôn mê, cứng gáy, xuất huyết, đau khớp, liệt ngoại vi hoặc liệt mặt, đau

cơ nghiêm trọng, bầm tìm ban đỏ (Hính 1.3)

Hình 1.3 Bệnh nhân bị nhiễm S suis

(http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcus-suis-zoonotic-epidemic-in-asia_4091/)

Di chứng sau khi viêm màng não được điều trị khỏi thường là điếc vĩnh viễn

Tỷ lệ tử vong của thể viêm màng não khoảng 20% ở châu Á và 13% ở châu Âu

Ở thể sốc nhiễm trùng nhiễm độc, bên cạnh sốt cao, ớn lạnh, đau đầu, nôn, chóng mặt, đau bụng còn thêm các dấu hiệu khác như hạ huyết áp, tim đập nhanh, suy gan, chảy máu dưới da, đông máu nội mạch rải rác, suy thận cấp, hội chứng suy

hô hấp cấp Tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc thể này rất cao (>60%)

1.3.3 Biện pháp phòng bệnh

Tuyên truyền trên các phương tiện thông tin truyền thông để người dân biết và chủ động phòng tránh bệnh liên cầu khuẩn lợn [1]:

- Nên chọn mua thịt lợn đã qua kiểm định của cơ quan thú y

- Tránh mua thịt lợn có màu đỏ khác thường, xuất huyết hoặc phù nề

- Nấu chìn thịt lợn là điều rất quan trọng (Tổ chức Y tế Thế giới - WHO

khuyến cáo trên 700C) Không ăn lợn chết, không ăn các món ăn tái, đặc biệt là tiết canh lợn trong thời gian có dịch

- Những người có vết thương hở phải đeo găng tay khi tiếp xúc với thịt lợn

tái hoặc sống

- Phải giữ các dụng cụ chế biến ở nơi sạch sẽ, rửa sạch tay và các dụng cụ

chế biến sau khi tiếp xúc,chế biến thịt lợn Dùng riêng các dụng cụ chế biến thịt sống và thịt chìn

1.3.4 Biện pháp chống dịch

Khi nhận thấy có dịch liên cầu khuẩn, xảy ra thí phải xử lý đúng như xử lý một ổ dịch truyền nhiễm [1]:

- Tăng cường giám sát phát hiện các trường hợp bị bệnh nghi nhiễm liên cầu

khuẩn lợn ở người, nên đưa ngay đến bệnh viện để tổ chức cứu chữa kịp thời Đặc biệt chú ý giám sát những đối tượng có tiếp xúc gần với lợn bị bệnh như người chăn nuôi, giết mổ và buôn bán lợn

- Nghiêm cấm hoàn toàn việc di chuyển và giết mổ lợn Không giết mổ,vận

chuyển lợn bệnh, lợn chết phải tiêu huỷ đúng cách

- Lợn ốm, chết phải chôn, đổ thuốc sát khuẩn và tiêu huỷ Chuồng trại và môi

trường chăn nuôi phải phun thuốc sát khuẩn, khử khuẩn Để trống chuồng 2 tuần mới nuôi lợn trở lại

1.3.5 Nguyên tắc điều trị

- Lưu ý phát hiện sớm các trường hợp có biểu hiện viêm màng não và có tiếp

xúc với lợn bị bệnh, chẩn đoán và điều trị kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong do biến chứng gây ra

- Điều trị kháng sinh đặc hiệu Penicilline liều cao: uống, tiêm bắp

hoặc truyền tĩnh mạch, thường phải điều trị trên 10 ngày Có thể dùng các kháng

sinh khác cũng hiệu quả như: Ampicilline, Erythromycine hoặc nhóm Cephalosporine

- Điều trị triệu chứng và áp dụng các biện pháp hồi sức tìch cực

- Lọc máu nếu có điều kiện

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.4.1 Nuôi cấy phân lập

S suis là vi khuẩn Gram dương, mọc tốt trên môi trường thạch máu 5%

Khuẩn lạc tròn nhỏ (0,5-1mm), bóng ướt, trắng xám, gây tan huyết dạng α trên thạch máu cừu và gây tan huyết dạng β trên thạch máu ngựa

Sau khi đã phân lập được vi khuẩn trên các môi trường nuôi cấy nhân tạo (thạch máu 5%), vi khuẩn cần được khẳng định bằng xem xét hính thể vi khuẩn, tình chất bắt màu Gram và các phản ứng định danh, định týp

Nguyên lý: phản ứng catalase được sử dụng để phân biệt sơ bộ các vi khuẩn

trong cùng một giống (genera) Sự có mặt của catalase được phát hiện bởi phản ứng với H2O2 3%

2H2O2 2H2O+ O2

Streptococcus suis có phản ứng catalase âm tình

1.4.4 Xét nghiệm định danh, định typ:

a Phân loại nhóm huyết thanh Lancefield:

Là phản ứng ngưng kết nhằm xác định kháng nguyên nhóm của liên cầu dựa trên tình kháng nguyên của carbohydrate của vách tế bào vi khuẩn nhằm xác định sâu hơn

đặc điểm của loại vi khuẩn liên cầu Vi khuẩn S suis thuộc liên cầu nhóm D

b.Xác định đặc tính sinh hóa

Chủng vi khuẩn nghi ngờ S suis sẽ được khẳng định dựa trên một số đặc điểm

sinh hóa sau:

- Phản ứng VP (Voges- Proskauer): âm tình (-)

- Canh thang Trehalose: dương tình (màu vàng)

- Canh thang 1% Salicin: dương tình (màu vàng)

- Thạch TSA 6,5% NaCl: không mọc

Hoặc được xác định dựa trên bảng điểm của hệ thống API 20 Strep kit (BioMérieux Co.,)

c Xác định typ huyết thanh đặc hiệu:

Những chủng S suis sau khi đã được xác định bởi Hệ thống phân nhóm kháng

nguyên Lancefield và các đặc điểm sinh hóa sẽ được xác định typ huyết thanh đặc hiệu (được quyết định bởi cấu trúc vỏ polysaccharide của vi khuẩn)

Nguyên lý của phản ứng xác định typ huyết thanh: Phản ứng ngưng kết xảy ra khi một lượng tương ứng kháng thể và kháng nguyên đặc hiệu được trộn với nhau Phản ứng ngưng kết dương tình khi xuất hiện các hạt tủa có thể nhín thấy bằng mắt thường và hỗn dịch trở nên trong

Các loại kháng huyết thanh thường dùng là typ1, 2, 1/2 và typ 14 Trong đó typ 2 chiếm đa số

1.4.5 Phát hiện vi khuẩn S suis bằng phản ứng Realtime PCR

Phản ứng Realtime PCR phát hiện được vi khuẩn S suis và tình đếm được số

lượng phiên bản (copy) đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn có mặt trong bệnh phẩm tại

thời điểm lấy mẫu Kỹ thuật này có độ nhạy và tình chình xác cao nhưng chi phì đắt

và đòi hỏi kỹ năng cao cũng như nhiều kinh nghiệm khi phân tìch kết quả

Realtime PCR đã được thực hiện ở 2 bệnh viện lớn (BV Bệnh nhiệt đới TƯ-

Hà Nội và Bệnh viện Nhiệt đới-HCM) nhờ có sự giúp đỡ của chuyên gia phòng thì nghiệm Oxford- Anh

PCR đơn mồi, đa mồi chưa thực sự được áp dụng trên thực tế với các mẫu bệnh phẩm ở người, mà mới chỉ có ở một số nghiên cứu trong phòng thì nghiệm với các mẫu bệnh phẩm của lợn

1971 Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng rất phổ biến trong y tế, phòng thì nghiệm sinh học và nhiều ứng dụng khác Kỹ thuật PCR có tiềm năng trở thành một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi nhất ví nó cho kết quả nhanh, chi phì rẻ và đơn giản Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể ngay cả khi số lượng DNA đìch rất thấp Phát triển kỹ thuật PCR được coi là một trong những bước đột phá trong sự phát triển của nền khoa học thế giới [40]

1.5.2 Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR

PCR là một phản ứng dây chuyền: Phân tử DNA được sử dụng để tạo ra 2, 4, 8… bản sao Sự nhân lên liên tục của DNA được thực hiện bởi các protein cụ thể là polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp các chuỗi DNA từ các nucleotit Để

thực hiện tổng hợp DNA cần có 4 loại nucleotit là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) và guanine (G) PCR là một phương pháp được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của bất kỳ sợi axit nucleic nào Đây là một phương pháp khuếch đại một cách chọn lọc một đoạn DNA của hệ gen Trong quy trính PCR gốc của Mullis, DNA sợi kép được tách thành hai sợi đơn của DNA bằng cách nung nóng nó đến 96

° C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase của E.Coli bị phá hủy, cần phải bổ sung các enzyme mới sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trính PCR này không hiệu quả ví nó đòi hỏi nhiều thời gian, số lượng DNA polymerase lớn, và sự theo dõi liên tục trong suốt quá trính PCR [40]

kéo dài chuỗi xảy ra ở phần cuối của giai đoạn ủ mồi để tạo ra một bản sao của sợi DNA Để khuếch đại một đoạn của DNA bằng PCR, DNA khuôn được làm nóng để chúng biến tình và tách thành 2 chuỗi DNA sợi đơn Tiếp theo, một loại enzyme được gọi là "Taq polymerase" sẽ chịu trách nhiệm tổng hợp hai sợi DNA mới bằng cách sử dụng sợi DNA gốc làm khuôn Sau quá trính sao chép sẽ tạo hai phân tử DNA mới có 1 sợi khuôn và 1 sợi mới tổng hợp 7 Giai đoạn ủ xảy ra ở nhiệt độ thấp, 50-60 ° C Điều này cho phép các mồi bắt cặp với các đoạn bổ sung tương ứng trên DNA khuôn Taq polymerase thêm nucleotide có sẵn để kết thúc ủ mồi Việc kéo dài chuỗi bằng Taq polymerase xảy ra ở khoảng 72 ° C trong 2-5 phút DNA polymerase I không thể được sử dụng để kéo dài chuỗi bởi ví nó không ổn định ở nhiệt độ cao được sử dụng cho phản ứng PCR Ưu điểm của chu kỳ và quy trính PCR là nó rất nhanh so với các kỹ thuật khác và mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao của sợi DNA mong muốn Sau 25-30 chu kỳ, sản phẩm PCR sẽ chứa rất nhiều bản sao của mẫu DNA ban đầu để tiến hành thử nghiệm Nếu sử dụng thời gian tối đa cho mỗi bước, 30 chu kỳ sẽ chỉ mất 6 giờ để hoàn thành Khi quá trính biến tình, ủ và kéo dài chuỗi được tiếp tục mồi liên tục bắt cặp với cả hai gốc DNA mẫu và bổ sung các nucleotit và tổng hợp nên sợi DNA mới Cuối cùng, kết quả là số lượng bản sao của DNA được gia tăng theo cấp số nhân Một DNA polymerase chịu nhiệt đã được đưa vào sử dụng trong quy trính PCR đó là enzyme

Taq DNA polymerase.DNA polymerase này được phân lập từ Thermus aquaticus

(Taq) phát triển trong các mạch nước phun có nhiệt độ hơn 110 ° C, và đã đóng góp rất nhiều vào việc tăng năng suất, tình đặc trưng, tự động hóa, và tiện ìch của phản ứng PCR Sau chu kỳ cuối cùng, mẫu thường được ủ ở 72 ° C trong 5 phút để các sản phẩm PCR được tổng hợp một cách hoàn thiện Để đảm bảo thành công, cần phải thực hiện tốt cả hai giai đoạn là giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và thiết lập các điều kiện của phản ứng

Điện di: sản phẩm của đoạn DNA khuyếch đại được điện di trên thạch

agarose Tùy theo kìch thước của DNA mà sử dụng loại gel agarose đơn hay phối hợp và điện trường khác nhau

Đọc kết quả: Dựa vào DNA mẫu trên nền đèn cực tìm, xác định sản phẩm

khuyếch đại tương ứng với kìch thước của DNA đó

Ứng dụng của phản ứng PCR

PCR được ứng dụng nhiều trong việc điều tra và chẩn đoán của nhiều loại bệnh khác nhau Nó là phương pháp tiêu chuẩn trong tất cả các phòng thì nghiệm thực hiện nghiên cứu với axit nucleic Ngay cả một số kỹ thuật khác được sử dụng cũng đòi hỏi việc khuếch đại DNA là một bước cần thiết trong quy trính thực hiện Phản ứng PCR đã được rất nhiều nhà khoa học trong những lĩnh vực nghiên cứu khác nhau Việc sử dụng sao chép ngược để đánh giá RNA (RT-PCR) và phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR) là những tiến bộ lớn phát triển từ kỹ thuật PCR Phương pháp PCR cho phép xác định sự thay đổi trong biểu hiện gen đã cung cấp cho các nhà khoa học sự hiểu biết sâu sắc về quá trính mắc bệnh và tạo cơ sở cho chẩn đoán và nghiên cứu khoa học cơ bản Trong vi sinh học và sinh học phân

tử, PCR được sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng DNA, phương pháp lai DNA Southern Blotte, giải trính tự DNA và công nghệ DNA tái tổ hợp Trong vi sinh học lâm sàng, PCR đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán nhiễm vi sinh và nghiên cứu dịch tễ học PCR cũng được sử dụng trong các phòng thì nghiệm pháp y và đặc biệt hữu ìch ví chỉ cần một lượng rất nhỏ DNA đìch, vì dụ chỉ cần 1 giọt máu hoặc 1 cái tóc cũng có thể cung cấp đủ lượng DNA cần thiết Trong thực tế, một số thử nghiệm bằng cách sử dụng PCR để phát hiện một loạt các vi khuẩn trong mẫu dịch

não tủy đã được báo cáo Kể từ khi quá trính nuôi cấy C pneumoniae gặp khó khăn

trong hầu hết các phòng thì nghiệm lâm sàng, phương pháp PCR đã được sử dụng

để xác định vi khuẩn này trong các mẫu lâm sàng Nested PCR là một trong những quy trính để phát hiện một vài vi khuẩn trong các mẫu lâm sàng PCR định tình có thể được sử dụng để phát hiện không chỉ các gen của người mà còn phát hiện gen của vi khuẩn và vi rút Một trong những ứng dụng y tế ứng dụng quan trọng nhất của PCR là phát hiện tác nhân gây bệnh Nhiều vi rút chứa RNA hơn là DNA Ví thế, RT-PCR được sử dụng để phát hiện các RNA của những loại vi rút này Phương pháp PCR có thể phát hiện DNA của vi sinh vật trong bất kỳ mẫu nào, cho

dù là dịch của cơ thể, thực phẩm hoặc nước uống Phương pháp PCR định lượng cung cấp thông tin bổ sung ngoài việc đơn thuần phát hiện DNA Phương pháp này không chỉ cho biết sự có mặt của 1 đoạn DNA cụ thể trong mẫu mà còn cho biết số lượng của đoạn DNA đó là bao nhiêu Một ứng dụng quan trọng của PCR định lượng là trong chẩn đoán phân tử, nghĩa là việc chẩn đoán bệnh dựa trên những phát hiện phân tử chứ không phải là trên các triệu chứng sinh lý PCR là xét nghiệm nhạy nhất với vi rút herpes simplex, vi rút varicella-zoster, và human papillomavirus Chẩn đoán khác sử dụng bao gồm cả xét nghiệm các bệnh di truyền, bệnh ung thư, và các bệnh truyền nhiễm khác Một ứng dụng quan trọng khác của phương pháp PCR định lượng đó là xét nghiệm HIV Nó có thể phát hiện

vi rút HIV sớm hơn trong vài tuần đầu sau khi nhiễm bệnh, nhạy hơn phương pháp ELISA [40]

Cả PCR định tình và định lượng đóng một vai trò quan trọng trong việc chiến đấu chống lại căn bệnh ung thư PCR có thể xác định gen liên quan trong

sự phát triển của ung thư Có rất nhiều các ứng dụng PCR định lượng trong phòng thì nghiệm Nó thường được sử dụng cho cả hai mục đìch nghiên cứu cơ bản và được triển khai như một công cụ để mới phát hiện bệnh mới nổi Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng tiềm năng, bao gồm cả phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh có mật độ thấp, các trính tự di truyền hiếm gặp, và gen biểu hiện trong tế bào đơn lẻ [40]

1.5.3 Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi

1.5.3.1 Giới thiệu chung

PCR đa mồi là một loại phản ứng khuếch đại gen nhưng không phải chỉ khuếch đại một trính tự gen đìch mà có thể cùng một lúc khuếch đại hai hay nhiều hơn hai trính tự gen đìch khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại mồi khác nhau (primers) với cùng một quy trính khuếch đại trong cùng một ống phản ứng Do đó,

sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm được thời gian, công sức xét nghiệm và có khả năng phát hiện được hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc

Phân tìch được các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể (hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phương pháp PCR đa mồi trở thành một phương pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả lâm sàng và nghiên cứu

Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng

1.5.3.2 Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi

Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi

Để có được hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen đìch người ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khìa cạnh của kỹ thuật PCR như mồi (vị

trì, trính tự, hàm lượng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lượng Taq polymerase; nồng độ

MgCl2; sự tương quan giữa các thành phần phản ứng và gen đìch… thêm nữa là các loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của

tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đìch hay „template‟) Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hính thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng „khuôn‟ hoặc cho dư thừa mồi Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107

phân

tử đối với khuôn Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM ví sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi ví các chuỗi đìch mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trính biến tình (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế

sự hính thành sản phẩm PCR Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hính thành các sản

phẩm không đặc hiệu (các dimer)

Lựa chọn mồi:

Chiều dài của mỗi mồi ở khoảng 18-24 bp, nếu mồi có độ dài lớn hơn 35bp) thí dường như cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tương tự như mồi có độ

(30-dài ngắn, tuy vậy mồi ở độ (30-dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chình, ngăn các sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi

Nếu có thể, trính tự của mỗi mồi nên được „bắt đầu‟ và „kết thúc‟ bởi 1-2 cặp

GC

Hai mồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau

Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp primer để việc khuếch đại các vùng đìch được đặc hiệu

Nồng độ mồi

Thông thường, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ phân tử dùng cho mỗi mồi từ 100 – 500 nM Trong phản ứng PCR đa mồi, lượng mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhín thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ìt…và sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nên tránh sử dụng lượng mồi quá cao hoặc quá thấp Lượng mồi quá cao có thể gây

ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhưng ngược lại lượng mồi quá ìt thí không đủ để có sản phẩm khuếch đại Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản phẩm ìt nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ưu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thí việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng lượng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lượng mồi cho sản phẩm mạnh hơn (vùng mạnh) Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 -500nM) có thể thay đổi đáng kể trong vòng vùng này và thường được thiết lập theo kinh nghiệm [24] Với DNA có số copy thấp hoặc có tình phức tạp cao thí nồng độ mồi nên dùng từ 300nM - 500nM (0,3 – 0,5µM) Đối với DNA có số copy cao hoặc tình phức tạp thấp nồng độ mồi được khuyên là từ 40nM – 400nM (0,04-0,4µM) [38]

Sự cân xứng giữa lượng mồi và lượng DNA khuôn (DNA đích)

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đìch hay „template‟) Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hính thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng „khuôn‟ hoặc cho dư thừa mồi Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân

tử đối với khuôn Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM ví sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi ví các chuỗi đìch mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trính biến tình (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế

sự hính thành sản phẩm PCR Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hính thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer)

Nồng độ mồi và nồng độ DNA đích:

Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đìch của phản ứng PCR Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng được coi như một cách tối ưu phản ứng PCR

Nồng độ dNTP và MgCl 2

Về dNTP: nồng độ MgCl2 được giữ ổn định (2mM) trong khi đó tổng nồng

độ các dNTP được tăng dần Kết quả tốt nhất ở giữa 200-400µM cho mỗi loại dNTP, nếu cao hơn sự khuếch đại bị ức chế nhanh Nếu thấp hơn (100µM mỗi loại) vẫn có sự khuếch đại nhưng lượng sản phẩm ìt và sản phẩm được nhín thấy mờ dNTP (ở dạng cất giữ) nhạy cảm với việc đông/ tan đông Sau 3-5 lần như vậy sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR đa mồi Để tránh vấn đề này, nên chia nhỏ dNTP và giữ ở nhiệt độ âm (-20oC) Sự kém ổn định này của dNTP không thể hiện rõ khi chỉ khuếch đại 1 trính tự (một vùng)

Về MgCl 2 , phải tối ưu hóa Mg++ ví Taq DNA polymerase là 1 enzym phụ thuộc Mg Cùng với Taq DNA polymerase, mồi của DNA khuôn và dNTPs cũng kết hợp Mg2+ Ví vậy tối ưu hóa nồng độ Mg2+ phải tùy thuộc nồng độ dNTP, DNA đìch và thành phần đệm (có một số đệm đã có sẵn một lượng Mg++) Nếu mồi, DNA đìch chứa chất ức chế như EDTA hoặc EGTA thí nồng độ Mg2+

có thể thay đổi Lượng Mg2+

thừa làm cho chuỗi kép DNA bền và ngăn cản sự biến tình hoàn toàn của DNA, điều này dẫn đến giảm sản phẩm Mg2+ dư thừa cũng có thể làm bền

sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với vị trì không chình xác của khuôn dẫn đến làm giảm độ đặc hiệu Mặt khác nếu không đủ Mg2+ cũng làm giảm sản phẩm

khuếch đại [38]

Để hoạt động tốt, Taq DNA polymerase cần Mg tự do (dNTP và DNA cũng

được gắn với Mg) Điều này có thể giải thìch tại sao khi tăng nồng độ dNTP có thể

ức chế PCR Trong khi đó tăng nồng độ Mg thường cho hiệu quả tốt Bằng cách kết hợp lượng dNTP và MgCl2 khác nhau Nghiên cứu cho thấy với 200µM mỗi loại dNTP và 1,5 mM MgCl2 thường có kết quả đạt yêu cầu, tuy nhiên ở nồng độ 3mM MgCl2 thí kết quả có thể tốt hơn Nồng độ Mg thấp sẽ giảm khả năng khuếch đại của phản ứng PCR [24,38]

Lượng DNA đích (khuôn) và Taq DNA polymerase

Khi lượng DNA đìch quá thấp, sự khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả có thể đạt được ở nhiệt độ bắt cặp thấp hơn Thử nghiệm những nồng độ khác nhau của Taq DNA polymerase cho thấy nồng độ enzym hiệu quả nhất khoảng 2,5U/50µl thể tìch phản ứng Lượng enzym thừa, do nồng độ glycerol ở dung dịch gốc dẫn đến sự khuếch đại không cân xứng giữa các trính tự khác nhau Tỷ lệ kéo dài của phân tử lai mồi - đìch phụ thuộc vào hoạt tình của enzym này và sự có mặt của các thành phần cần thiết như MgCl2, dNTP và bản chất của DNA đìch Ví vậy vấn đề chủ yêú

để thay đổi PCR phải tác động trực tiếp đến các yếu tố ảnh hưởng tới sự bắt cặp

hoặc kéo dài hoặc cả hai [38]

Lượng gen đìch có mặt trong mẫu ảnh hưởng mạnh tới hiệu quả PCR Nếu lượng gen đìch rất ìt, điều kiện của phản ứng hay chu trính phản ứng cần phải được thay đổi, cải tiến để thìch nghi nhằm đạt hiệu quả phát hiện

Nồng độ đệm PCR

Qua khảo sát cho thấy đệm PCR cho hiệu quả tốt là 1,6 x của các thành phần đệm PCR sau đây: KCl (50mM), Tris HCl pH 8,3 (10mM) và MgCl 2 (1,5mM)