(LUẬN văn THẠC sĩ) phân tích đặc điểm phân tử của canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố hồ chí minh

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh” là kết quả của sự nghiên cứu

Nguyễn Thanh Việt

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE

PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thanh Việt

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS

GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHÓ

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Thân Văn Thái

Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Hoàng Dũng

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus

gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh” là kết quả của sự nghiên cứu nghiêm túc, được tiến hành dựa trên sự cố gắng học hỏi của bản thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS Thân Văn Thái và thầy TS Nguyễn Hoàng Dũng

Tôi xin cam đoan số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

Người cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt là các anh chị tại Viện Khoa học môi trường nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp BIO2019B, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 5

DANH MỤC HÌNH 6

MỞ ĐẦU 7

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 10

1.1 Tổng quan về Canine parvovirus 10

1.2 Phân loại Canine parvovirus 11

1.3 Cấu trúc genome của CPVs 11

1.4 Phương thức lây nhiễm của CPVs 13

1.5 Đặc điểm sinh bệnh học CPVs 13

1.6 Phương pháp phòng và điều trị bệnh 15

1.7 Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra 16

1.8 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3 Đối tượng nghiên cứu 23

2.4 Vật liệu nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu 23

2.4.2 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 23

2.5.1 Chẩn đoán CPVs bằng Kít xét nghiệm nhanh 24

2.5.2 Phương pháp PCR 25

2.5.2.1 Tách chiết DNA 25

2.5.2.2 Thực hiện phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) 25

2.5.3 Giải trình tự gen 27

2.5.4 Phân tích trình tự gene 28

2.5.5 Xây dựng và phân tích cây phát sinh loài 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả thu nhận mẫu 29

3.2 Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu bệnh phẩm 30

3.3 Kết quả PCR khuyếch đại gen VP2 31

3.4 Kết quả PCR genome hoàn chỉnh của chủng CPVs trong nghiên cứu này

32

3.5 Kết quả giải trình tự gen VP2 33

3.6 Kết quả giải trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu 33

3.8 Kết quả phân tích và so sánh trình tự amino acid (aa) của VP2 protein 35

3.9 Kết quả phân tích cây phát sinh loài 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị 46

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN CỦA TÁC GIẢ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 62

DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT

CPV Canine parvovirus

RCR rolling-circle replication

PIF Parvovirus initiation factor

Glu Axit glutamic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các thành phần trong phản ứng PCR……… 25 Bảng 2.2 Primers sử dụng trong phản ứng PCR……… 26 Bảng 2.3 Các cặp mồi sử dụng trong khuếch đại trình tự bộ genome CPV………26

Bảng 3.1 Kết quả thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy trong nghiên cứu này………29 Bảng 3.2 Kết quả sau điều trị của có bị nhiễm CPV……… 29 Bảng 3.3 Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu thí nghiệm……… 30 Bảng 3.4 Trình tự nucleotide và amino acid của gene VP2 của các mẫu CPVs sử

dụng trong nghiên cứu này……….37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian……….10

Hình 1.2 Cấu trúc của Canine parvovirus ……… 11

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa genome của chủng CPV (mã số NC_001539) …………12

Hình 1.4 Kết quả chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs……….16

Hình 2.1 Thu thập mẫu ………24

Hình 2.2 Chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs ……….24

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa genome và vị trí các cặp mồi………27

Hình 3.1 Kết quả PCR chẩn đoán CPVs ……… 30

Hình 3.2 Kết quả PCR khuếch đại trình tự đầy đủ gen VP2 ………31

Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs trong nghiên cứu này……… 32

Hình 3.4 Kết quả so sánh tương đồng trình tự trên hệ thống BLAST NCBI …… 33

Hình 3.5 So sánh trình tự genome của các chủng trong nghiên cứu này với chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập tại Trung Quốc ……….34

Hình 3.6 Cây phát sinh loài dựa trên gene VP2 trong nghiên cứu này ………39

Hình 3.7 Cây phát sinh loài dựa trên gene VP1 trong nghiên cứu này ………41

Hình 3.8 Cây phát sinh loài dựa trên gene NS1 trong nghiên cứu này ………42

Hình 3.9 Cây phát sinh loài dựa gene NS2 trong nghiên cứu này ………43

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên vùng mã hóa genome trong nghiên cứu này……….44

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết:

Việt Nam là quốc gia có số lượng chó nuôi tương đối lớn và đặc biệt là chó nuôi làm cảnh (thú cưng) có xu hướng ngày càng tăng do điều kiện kinh tế và nhu cầu nuôi thú cảnh ngày càng tăng Tuy nhiên, việc quản lý và chăm sóc gặp rất nhiều khó khăn

do chó được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức đề kháng và khả năng thích nghi cũng rất khác nhau Bên cạnh đó các yếu tố như điều kiện nuôi dưỡng,

vệ sinh, khí hậu nóng ẩm, vv cũng làm cho sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn tại nước ta

Canine paroviruses (CPVs) là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp tính nguy hiểm

trên chó, đặc biệt là chó ở độ tuổi từ 6 tuần tới 6 tháng và chưa được tiêm vắc-xin CPVs có khả năng lây lan rất nhanh chủ yếu qua đường tiêu hóa thông qua thức ăn hoặc dụng cụ bị nhiễm vi-rút Bệnh thường phát triển rất nhanh trong vòng từ 3-7 ngày, tỷ lệ tử vong khoảng 10% đối với chó trưởng thành và 91% đối với chó con

CPVs là vi-rút DNA sợi đơn, thuộc giống Parvovirus trong họ Parvoviridae CPVs

phân chia thành 2 nhóm là CPV-1 và CPV-2 Trong đó CPV-2 có 3 phân nhóm là CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c Tính đến nay thì CPV-2c được đánh giá là có đặc tính kháng nguyên và độc lực là mạnh nhất Bộ gen của CPVs dài khoảng 5,3 kb, có 2 gen

mã hóa protein phi cấu trúc NS1 và NS2, và 2 gen mã hóa protein cấu trúc là VP1 và VP2 Vỏ capsid của CPVs được tạo thành từ phức hợp của khoảng 60 bản sao của hai protein cấu trúc VP1 (84 kDa) và VP2 (67 kDa) với tỷ lệ tương đương khoảng 10%

và 90% Ngoài ra, protein VP2 là yếu tố độc lực chính có vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh và kích thích hệ thống miễn dịch hình thành kháng thể trung hòa; và protein VP1 hình thành nên một cấu trúc khối 20 mặt (icosahedral) đối xứng giúp vi-rút có khả năng chống lại axit, bazơ, dung môi và nhiệt độ lên đến 50ºC [1]

Bệnh do CPVs gây ra xuất hiện vào cuối những năm 1970, được công nhận lần đầu tiên vào năm 1978 và được xác nhận nguồn gốc từ đột biến của vi-rút gây bệnh bạch cầu ở mèo và có xu hướng lan rộng tại nhiều khu vực trên thế giới [2], [3] Từ năm 1979, CPV-2a (một biến thể di truyền của CPV-2) lây lan trên toàn cầu Các chủng CPV-2a trải qua các quá trình tiến hóa và giữ lại một số đột biến điểm tại vùng kháng nguyên vỏ và do đó có khả năng lây lan cao Ngoài loại kháng nguyên CPV-2a ban đầu, có hai biến thể kháng nguyên được biết đến, được gọi là CPV-2b và CPV-2c CPV-2b được phát hiện lần đầu vào năm 1984 tại Hoa Kỳ [4], [5] và CPV-2c được phát hiện lần đầu vào năm 2001 tại Ý [6] Sự khác biệt về kháng nguyên giữa

ba biến thể được thể hiện qua biến đổi tại vị trí amino acid 426 (Asn trong CPV-2a, Asp trong CPV-2b, và Gla trong CPV-2c) trên vùng gene VP2 [4], [5] Các nghiên cứu cho thấy khi một biến thể CPV-2 mới xuất hiện, nó sẽ thay thế rất nhanh các biến thể cũ [6], [7] Trong những năm gần đây, CPV-2c đã được phát hiện phổ biến ở các nước Châu Âu [6], Hoa Kỳ [8], Nam Mỹ [9] và Châu Phi [10] Lần đầu tiên CPV-2c được báo cáo ở Việt Nam vào năm 2004 [11] Hiện nay, chủng CPV-2c không còn phổ biến ở Châu Á [12] mà được thay thế bởi các biến thể CPV-2c mới xuất hiện và phổ biến tại nhiều quốc gia như Trung Quốc [13-15], Đài Loan [16], Thái Lan và Việt Nam [11] Nhìn chung, các biến thể của CPV (-2a, -2b và -2c) đang lưu hành trên thế giới với tần suất và mức độ tiến hóa thay đổi theo địa lý và thời gian [12], [13] Hiện nay, tại Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do CPVs trên chó vẫn còn hạn chế, trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phương pháp chẩn đoán phát hiện, phân lập, và đánh giá đặc điểm di truyền dựa trên phân tích một phần trình tự đoạn gen VP2 của các chủng CPVs đang lưu hành [11], [14-17] Gần đây, chỉ có duy nhất một nghiên cứu phân tích phân tử và phát sinh loài bộ gen đầy đủ của các biến thể CPV-2c được phân lập từ 2017 đến năm 2018 ở Việt Nam [18] Điều này, cho thấy sự thiếu hụt thông tin về đặc điểm di truyền của các chủng CPVs tại Việt Nam nói riêng và chủng CPVs trên thế giới nói chung Vì vậy, để xác định các đột biến có thể ảnh hưởng đến vắc-xin và cơ chế tiến hóa của các chủng CPV thì cần có thêm nhiều nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về đặc điểm trình tự genome chứa đầy đủ các vùng

mã hóa của protein phi cấu trúc NS1/NS2 và protein cấu trúc VP1/VP2 của các chủng CPVs đã và đang lưu hành hiện tại

Chó nhiễm CPVs hiện không có thuốc đặc hiệu để điều trị mà sử dụng các biện pháp như truyền dịch, bổ sung chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng, kết hợp

sử dụng kháng sinh để tránh bội nhiễm vi khuẩn Do đó, việc sử dụng vắc-xin được coi là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra Tuy nhiên, các loại vắc-xin CPV-2 được sử dụng ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài và đa số chỉ được sử dụng tiêm cho các loại chó giống nhập khẩu và chó lai từ

6 tuần đến 6 tháng tuổi Chó bản địa Việt Nam hiếm khi được tiêm phòng vì vậy đây

có thể là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự lây lan CPV-2 trên khắp cả nước Hơn nữa, đây cũng có thể là nguồn gốc dẫn đến sự đột biến, khi có nhiều trường hợp mặc dù đã được tiêm vắc-xin nhưng vẫn nhiễm bệnh tiêu chảy cấp tính nặng do các biến thể CPVs mới gây ra được báo cáo trên toàn quốc [19] Sự bùng phát CPVs ở những con chó được tiêm chủng cũng được báo cáo ở nhiều quốc giá khác nhau trên thế giới

Từ các yếu tố thực tiễn trên, các nghiên cứu nhằm bổ sung và cập nhật các thông tin như dịch tễ học, đặc điểm di truyền phân tử, mức độ tương đồng của các chủng vắc-xin CPVs thương mại so với các chủng CPVs đang lưu hành, vv… là cần thiết

để hỗ trợ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh do CPVs gây ra Do đó, để xây dựng cơ

sở dữ liệu nhằm hỗ trợ trong công tác sàng lọc CPV vắc-xin phù hợp và đồng thời giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tiến hóa của CPVs tại Việt Nam chúng tôi đề xuất thực

hiện đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus gây bệnh tiêu chảy

cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh”

Mục đích của đề tài

Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính

trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh

Nội dung nghiên cứu:

- Thu thập và bảo quản mẫu phân tiêu chảy của chó tại phòng khám Thú y với kết quả dương tính CPVs bằng Kit chẩn đoán nhanh

- Chẩn đoán và nhận diện phân tử CPVs bằng phản ứng PCR

- Giải trình tự và phân tích đặc điểm trình tự (trình tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài) của gene mã hóa protein bề mặt VP2

- Giải trình tự và phân tích trình tự genome đầy đủ của 02 mẫu CPVs (trình tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài)

Kết quả đạt được trong nghiên cứu:

Bổ sung và cập nhật thông tin về dịch tễ học, xác định các đặc điểm di truyền trên gene VP2 và genome của các chủng CPVs đang lưu hành tại Tp Hồ Chí Minh

so với các chủng lưu hành trên thế giới Ngoài ra, kết quả đạt được góp phần xác định đặc điểm đa dạng trong tiến hóa cũng như cung cấp thông tin nhằm hỗ trợ công tác sản xuất vắc-xin phù hợp trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra tại nước ta

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về Canine parvovirus

Canine parvovirus (CPVs) được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1976

trên chó tại Châu Âu Đến năm 1978, CPV đã lây lan rộng rãi và trở thành đại dịch, gây ra các chứng bệnh viêm cơ tim và viêm dạ dày và gây chết nhiều ở chó con, chó

trưởng thành trên khắp thế giới CPVs được xem như là một biến thể của Feline

panleukopenia virus (FPV), một loại vi-rút được phát hiện từ những năm 1920, gây

ra các bệnh trên mèo, chồn và một số động vật khác CPV có thể phát sinh do quá trình đột biến gen cho phép nó mở rộng phạm vi vật chủ lên trên chó, chó sói, gấu trúc cũng như một số động vật hoang dã khác [20]

Ngay sau khi xuất hiện, CPV-2 đã trải qua quá trình tiến hóa liên tiếp tạo ra 2 biến thể kháng nguyên: CPV-2a được báo cáo năm 1979 và CPV-2b năm 1984, hai biến thể này dần thay thế các chủng CPV ban đầu Năm 2000, tiếp tục xuất hiện biến thể kháng nguyên mới là CPV-2c, được phát hiện đầu tiên ở Ý và nhanh chóng lây lan sang nhiều số quốc gia khác nhau CPV-2c dần trở nên phổ biến ở các khu vực địa lý khác nhau và gây ảnh hưởng đến cả trên các loại chó trưởng thành và cả những giống chó đã được tiêm ngừa vắc-xin [21] Các nghiên cứu cho thấy các biến chủng của CPV-2c có khả năng chịu tác động một phần hoặc né tránh được hệ miễn dịch của chó đã được tiêm phòng với vắc-xin chủng CPV-2b [22] (Hình 1.1)

Mặc dù đã có nhiều loại vắc-xin CPV có hiệu lực giúp giảm tỷ lệ nhiễm và tỷ

lệ tử vong do CPVs gây ra Tuy nhiên do đặc tính dễ phát sinh những biến chủng mới của CPVs với độc tính thay đổi thì CPVs vẫn luôn là tác nhân gây bệnh hàng đầu cho chó nhà và chó hoang [22] Do đó việc nghiên cứu các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh hiệu quả do CPVs là vô cùng quan trọng (Nguồn https://www.vet.cornell.edu/)

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian [22]

1.2 Phân loại Canine parvovirus

Phân loại khoa học:

Họ Parvoviridae bao gồm hai phân họ, Parvovirinae và Densovirinae, lây nhiễm lần lượt trên vật chủ là động vật có xương sống và côn trùng Tính đến nay, có năm

chi nằm trong phân họ Parvovirinae, bao gồm Protoparvovirus, Erythrovirus,

Dependovirus, Amdovirus và Bocavirus CPV nằm trong chi Protoparvovirus, cùng

với Feline panleukopenia virus (FPV), Mink enteritis virus (MEV) và Racoon

parvovirus (RPV) Có hai loại CPV gây bệnh trên chó là CPV-1 và CPV-2 Tuy nhiên,

tác nhân phổ biến gây ra bệnh tiêu chảy cấp trên chó là do CPV-2 còn CPV-1 đã được phân loại vào trong chi Bocavirus cùng với Parvovirus gây bệnh trên bò [23]

1.3 Cấu trúc genome của CPVs

Canine parvovirus là vi-rút DNA sợi đơn (single strain, ssDNA), đường kính từ

20-26mm Genome của CPVs có chiều dài khoảng 5,3 kb Chứa hai khung đọc mở (open reading frame, ORF) chính (Hình 1.3)

Hình 1.2 Cấu trúc của Canine parvovirus [24]

Khung đọc mở đầu tiên của nửa đầu 3’ mã hóa hai gen phi cấu trúc NS1 và NS2, đây là các gen đóng vai trò thiết yếu cho sự nhân lên của vi-rút và gây ra quá trình apoptosis trong các tế bào vật chủ [24] Trong đó:

NS1 (non-structural protein 1): đây là loại protein đa chức năng hiển thị các hoạt động endonuclease và helicase cần thiết để bắt đầu và điều khiển quá trình sao chép DNA của vi-rút Ngoài ra, NS1 còn đóng vai trò trong quá trình đóng gói vi-rút và chuyển hóa một số chất xúc tác [24]

NS2 (non-structrual protein 2): đây là loại protein được tạo ra từ khung đọc mở chứa 87 acid amin đầu tận cùng với NS1 liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc

mở tiếp theo NS2 của CPV gây bệnh trên loài gặm nhấm đóng vai trò kiểm soát quá trình lắp ráp và dịch mã protein Tuy nhiên, theo Wang và cs thì NS2 của CPV được dự đoán khác với protein của parvovirus gây bệnh ở loài gặm nhấm Các đặc tính và chức năng của protein NS2 của CPV vẫn chưa được nghiên cứu chính xác [24] Khung đọc mở thứ hai từ nửa đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc, VP1 và VP2,

có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2, chúng còn là kháng nguyên chính tạo ra các kháng thể trung hòa và cũng là yếu tố gây độc lực [25] Vỏ CPV (capsid) có đường kính khoảng 25 nm, được lắp ráp từ 60 bản sao kết hợp từ các protein VP1 và VP2, khác nhau bởi sự hiện diện của N- mở rộng đầu cuối trong minor protein VP1 capsid bao bọc ssDNA của bộ gen Trong đó: VP1 chiếm khoảng 10%, hình thành nên một icosa-herdal giúp chúng có khả năng chống lại acid, bazơ, v.v Đây là protein có vai trò chủ chốt trong quá trình lây nhiễm trong tế bào, chúng thường nằm sâu trong capsid và khó bị phát hiện bởi các kháng thể Đây là protein cần thiết trong vai trò lây nhiễm của capsid nhưng lại không đóng góp cao trong việc hình thành vỏ của vi-rút Vùng kết thúc của VP1 còn chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự được bảo tồn gần cuối vùng kết thúc bao gồm 4 acid amin cơ bản, có nhiệm vụ vận chuyển các protein vào trong nhân tế bào [26]

VP2 chiếm phần lớn còn lại có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid và là yếu tố độc lực chính Các protein Capsid chịu trách nhiệm cho việc gắn vào TFRC (Transferrin receptor) thụ thể của tế bào chủ Sự gắn kết này chủ yếu gây ra sự nội hóa virion thông qua quá trình nội bào hóa clathrin Liên kết với các thụ thể vật chủ cũng gây ra sự sắp xếp lại capsid dẫn đến sự tiếp xúc trên bề mặt của VP1 N-endinus, đặc biệt là vùng giống như phospholipase A2 của nó [25]

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa genome của chủng CPVs

1.4 Phương thức lây nhiễm của CPVs

CPVs có khả năng chống lại tác động của nhiệt độ, chất tẩy rửa và cồn nên chúng có thể tồn tại rất lâu từ năm tháng trở lên trong môi trường tự nhiên và có khả năng lây nhiễm rất cao Nguồn lây nhiễm CPVs là chất thải từ phân của chó bệnh, nó

dễ dàng lây truyền qua lông hoặc chân của những con chó bị nhiễm bệnh và cả những vật bị ô nhiễm như lồng hoặc giày Bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp khi tiếp xúc với phân của chó bệnh hay tiếp xúc gián tiếp qua quần áo, giày dép, thiết bị, dây xích, chuồn nuôi nhốt, trên da người đã từng tiếp xúc với mầm bệnh hay trong môi trường

bị ô nhiễm như bệnh viện thú y, cửa hàng thú cưng, các cơ sở chăn nuôi thương mại, vv… Vì vậy việc quản lý và chăm sóc gặp rất nhiều khó khăn do chó được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức đề kháng cũng khác nhau Bên cạnh đó các yếu tố như điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, khí hậu nóng ẩm, vv cũng làm cho

sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn

1.5 Đặc điểm sinh bệnh học CPVs

CPVs lây nhiễm trên chó và phát triển rất nhanh, thông thường thời gian ủ bệnh trong khoảng từ ba đến bảy ngày và sau đó chó xuất hiện các biểu hiện lâm sàng CPVs sử dụng nguồn nguyên liệu trong tế bào của vật chủ để tiến hành phân chia hàng loạt Đầu tiên, vi-rút tấn công các hạch amidan hoặc hạch bạch huyết tại vùng hầu họng, tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho trong một hoặc hai ngày rồi tạo ra nhiều bản sao của nó Những vi-rút này cản trở đường đi bên trong của các tế bào lympho, nơi chúng được bảo vệ tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và xâm nhập vào máu Nhiều trong số các tế bào lympho bị nhiễm CPV này cuối cùng sẽ bị tiêu diệt, làm giảm số lượng bạch cầu Khi đi vào trong máu, vi-rút tấn công mạnh vào tủy xương cũng như trong các tế bào xếp dọc theo thành của ruột non

CPV có thể gây nhiễm trùng tim, dẫn đến viêm cơ tim, chức năng kém và rối loạn nhịp tim trên và bệnh trở nên đặc biệt nghiêm trọng ở chó non dưới 4 tháng tuổi Thống kê cho thấy tỷ lệ tử vong khi nhiễm CPVs trong khoảng 10% đối với chó trưởng thành và 91% đối với chó con nếu không được điều trị kịp thời [27]

Các thể bệnh điển hình:

Parvovirus đường ruột: tiến triển nhanh, đặc biệt với các chủng mới bao gồm

CPV-2a, -2b, và -2c Triệu chứng điển hình như nôn mửa dữ dội, tiêu chảy, chán ăn

và mất nước nhiều Phân chuyển màu xám vàng, có lẫn máu tươi và máu thẫm Nhiệt

độ trực tràng tăng cao (40-41oC) và tăng bạch cầu, đặc biệt là trong các trường hợp nghiêm trọng Chết trên chó xảy ra sớm trong vòng 2 ngày sau khi bị bệnh tấn công

và thường kết hợp bội khuẩn gram âm hoặc đông tụ nội mạc thành mạch hoặc cả hai [28]

Bệnh thần kinh: Dấu hiệu thần kinh có thể do sự xuất huyết trong hệ thống thần kinh trung ương hoặc bị giảm đường huyết trong suốt quá trình bệnh, sự nhiễm khuẩn hoặc sự rối loạn các ion acid-bazơ [28]

Bệnh về da: Những tổn thương gồm: loét ở gang bàn chân, miệng và màng nhầy

âm đạo Các hốc trong xoang mũi và các mảng ban đỏ ở bụng và vùng da xung quanh

âm hộ cũng được phát hiện [28]

Viêm cơ tim: CPV gây viêm cơ tim có thể phát triển do lây nhiễm từ dạ con hoặc bào thai nhỏ hơn 6 tuần thai Tất cả chó con đều bị ảnh hưởng, chó con bị nhiễm CPV gây viêm cơ tim đều bị chết hoặc chết sau một thời gian ngắn có biểu hiện triệu chứng, khó thở, và nôn mửa [28]

Chứng huyết khối: CPV gây ra tình trạng huyết khối động mạch chủ, do sự xuất hiện các cục máu đông trong động mạch chủ, dẫn đến sự gián đoạn truyền lưu lượng máu đến các mô được phân đoạn bởi động mạch chủ chó, có thể gây ra các biến chúng nghiêm trọng [28]

Nhiễm khuẩn nước tiểu: Do sự nhiễm bẩn từ phân của cơ quan sinh dục ngoài kết hợp với Neutropenia Bệnh phát triển trên hệ tiết niệu nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến bệnh đường niệu mạn tính (Nguồn: https://www.vet.cornell.edu/)

Chu kỳ nhân lên của CPV

CPV là một loại vi-rút DNA sợi đơn nhỏ, chưa phát triển Chu kỳ nhân lên CPV xảy ra trong nhân của các tế bào đang phân chia vào cuối pha S hoặc đầu pha G2 Sự lây nhiễm của các tế bào phân chia diễn ra nhanh chóng và vi-rút thường tác động trên tủy xương và đường tiêu hóa của vật chủ Một gam phân từ một con chó bị nhiễm trùng nặng có thể chứa đủ vật chất vi-rút để lây nhiễm cho hơn 10 triệu con chó thông qua việc tiếp xúc bằng tiêu hóa.[53] Vi-rút ban đầu nhân lên trong mô bạch huyết hầu họng và sau đó được cho là lây lan qua huyết tương Biểu mô của đường ruột thường

bị nhiễm vào ngày thứ 4 sau khi nhiễm bệnh Kháng thể bắt đầu xuất hiện khoảng 5 ngày sau khi nhiễm trùng và tăng đến mức tối đa vào ngày thứ 7 đến ngày 10 Các dấu hiệu lâm sàng xuất hiện từ 4 đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh [53]

Sự tương tác giữa virus CPV và vật chủ

Vi-rút tấn công vào tủy xương của vật chủ, làm suy yếu khả năng tự bảo vệ của

cơ thể vật chủ bằng cách phá hủy các tế bào miễn dịch non và gây giảm số lượng bạch cầu bảo vệ Vi-rút gây ra sự phá hủy này bằng cách nhắm mục tiêu vào biểu mô

của ruột non, lớp niêm mạc có vai trò hấp thụ chất dinh dưỡng và cung cấp màng bảo

vệ quan trọng chống lại sự mất chất lỏng và sự xâm nhập của vi khuẩn từ ruột vào cơ thể Các tế bào tạo nên bề mặt biểu mô tồn tại trong thời gian ngắn và được thay thế liên tục bởi các tế bào mới sinh ra Vi-rút xâm nhập vào các tế bào biểu mô mới được sinh ra và vô hiệu hóa khả năng bổ sung chất dinh dưỡng cho bề mặt ruột của cơ thể vật chủ

Bằng cách ngăn chặn việc thay thế các tế bào già và gây chết các tế bào mới sinh ra, khiến cho bề mặt ruột không thể hấp thụ đầy đủ chất dinh dưỡng, gây ra hiện mất nước trong cơ thể vật chủ Từ đó, gây ra tiêu chảy dữ dội và buồn nôn là kết quả ban đầu, nhưng cuối cùng bề mặt ruột có thể bị tổn thương đến mức bắt đầu phân hủy

và vi khuẩn thường sống trong ruột xâm nhập vào thành ruột và đi vào máu Điều này gây mất nước đáng kể do tiêu chảy và nhiễm trùng lan rộng bên trong cơ thể Tệ hơn nữa, hệ thống miễn dịch của cơ thể đã bị suy yếu, do khả năng sản xuất các tế bào bạch cầu mới để chống lại nhiễm trùng đã bị cản trở bởi sự xâm nhập của CPV vào tủy xương có khả năng dẫn đến tỷ lệ tử vong cao đối với vật chủ (Nguồn: https://www.vet.cornell.edu/)

1.6 Phương pháp phòng và điều trị bệnh

Ở chó nhiễm CPVs có tỷ lệ tử vong rất cao, do vi-rút gây mất nước, thiếu máu, nhiễm trùng máu, xuất huyết viêm ruột Để điều trị bước đầu tiên là điều chỉnh mất nước và mất cân bằng điện giải Điều này đòi hỏi phải sử dụng dịch truyền tĩnh mạch

có chứa chất điện giải Thuốc kháng sinh và thuốc chống viêm được dùng trong trường hợp ngăn ngừa hoặc kiểm soát nhiễm trùng máu Thuốc chống co thắt được

sử dụng để ức chế tiêu chảy và nôn mửa Hầu hết những chó bị nhiễm CPVs có khả năngphục hồi nếu điều trị tích cực trước khi quá trình nhiễm trùng máu nặng và mất nước xảy ra Vì những lý do khác nhau, một số giống có tỷ lệ tử vong cao hơn nhiều

so với các giống khác [28]

Sử dụng vắc-xin được coi là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng và trị bệnh

do CPVs gây ra Chó con được tiêm vắc-xin CPVs mũi đầu tiên ở 5 đến 6 tuần tuổi

và tiêm nhắc lại 2 mũi sau mỗi 2 đến 3 tuần và yêu cầu tiêm tăng cường sau mỗi 1 đến 3 năm [28] Hiện nay trên thị trường có nhiều loại CPV vắc-xin được nhập vào nước ta Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào cho thấy được hiệu quả sử dụng các loại vắc-xin này trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm dịch và phân tử của các chủng CPVs nhằm đánh giá khả năng bảo hộ của CPV vắc-xin cũng như lựa chọn được các chủng vi-rút phù hợp cho công tác sản xuất CPV vắc-xin đặc hiệu tại nước ta

1.7 Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra

Để chẩn đoán nguyên nhân bệnh là CPVs, có thể sử dụng các phương pháp dưới đây

Chẩn đoán theo triệu chứng: CPV có thể gây ra những triệu chứng như lờ đờ,

mệt mỏi, chán ăn, nôn mửa và đi phân ra máu Tuy nhiên, chỉ dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể chẩn đoán trong ít trường hợp Trên chó, không chỉ có CPV gây ra các triệu chứng trên mà còn có một vài chủng vi-rút gây hại đường ruột cũng biểu hiện như trên

Chẩn đoán theo nguyên lý kháng thể - kháng nguyên: Đây là phương pháp

phổ biến để phát hiện nhanh sự hiện diện của kháng nguyên CPV trong mẫu bệnh phẩm (CPV rapid test kit).Kết quả được quan sát thông qua sự biến đổi màu tín hiệu được thực hiện bởi cơ chất và enzyme của phản ứng (Hình 1.3) Tuy nhiên, phương pháp này có tỷ lệ kết quả chẩn đoán không chính xác (dương tính giả hoặc âm tính giả) do thao tác của người sử dụng

Hình 1.4 Kết quả chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs

Chẩn đoán bằng phương pháp PCR: Đây là phương pháp chẩn đoán dựa trên

trình tự di truyền của CPV Đây là phương pháp có độ chính xác cao và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp kháng thể-kháng nguyên Phương pháp PCR được thực hiện dựa trên tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các vùng trình tự ít biến đổi nhưng đặc trưng của CPVs (thông tin các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong chẩn đoán CPVs được trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu) Sản phẩm PCR được điện di và hiển thị màu trên gel argarose (Hình 3.1)

1.8 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs

Một số nghiên cứu về CPVs trong nước:

Sự lây nhiễm CPV-2 và sự bùng phát của nó ở Việt Nam đã được nghiên cứu

từ năm 1994 và sau đó được coi là mối quan tâm quan trọng nhất về sức khỏe của chó với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao ở cả chó nhà và chó hoang [14]

C T

Năm 2013, tác giả Trần Ngọc Bích và cộng sự đã tiến hành khảo sát tỷ lệ nhiễm

Canine parvovirus trên chó từ 1 đến 6 tháng tuổi tại Tp Cần Thơ, kết quả cho thấy

84 trong tổng số 184 chó nghi mắc bệnh bị nhiễm CPV với tỷ lệ là 45,1 % Chó dưới bốn tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm từ 45 - 55 % cao hơn so với chó ở lứa tuổi từ 4 đến 6 tháng tuổi (21,7 %) Chó nhiễm CPV có số lượng hồng cầu, hemoglobin và hematocrite thấp hơn bình thường với tỷ lệ lần lượt là 74,7 %, 72,3 % và 50,6 % Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu cho thấy 72,2 % chó nhiễm CPV có hàm lượng AST tăng 63,8 %, chó nhiễm CPV có hàm lượng ALT tăng cao hơn mức bình thường [16]

Một nhóm nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Yến Mai và cộng sự đã tiến hành một cuộc khảo sát về tỷ lệ lây nhiễm CPV trên chótừ tháng 11 năm 2017 đến tháng

5 năm 2018, dựa vào kit chẩn đoán nhanh CPV-Ag trên chó từ một đến sáu tháng tuổi

bị tiêu chảy, phân có lẫn máu tại phòng mạch Thú y, Chi cục Chăn nuôi và thú Tiền Giang, Phòng mạch thú y Nam Thủy Đồng Tháp và Bệnh xá Thú y Trường Đại học Cần Thơ Kết quả cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do parvovrus tại Tiền Giang, Đồng Tháp và Tp Cần Thơ lần lượt là 30%, 34% và 30% Chó ở độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở cả ba tỉnh với tỷ lệ lần lượt là 60%, 59%, 60%, và khác biệt có ý nghĩa thống kê với chó ở độ tuổi dưới 6 tháng tuổi ở cả ba tỉnh lần lượt là 6,7%, 5,9% và 0% Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ

lệ nhiễm bệnh ở chó đực và chó cái ở cả ba tỉnh Tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm chó giống nội và nhóm chó giống ngoại lần lượt là 53,3%, 46,6%, 52,9% và 47,0%, 53,3%, 46.6% Chó được tiêm ngừa vắc-xin phòng bệnh thì tỷ lệ bệnh thấp hơn so với chó không được tiêm ngừa vắc-xin ở ba tỉnh lần lượt là 6,6% so với 93,3%; 5,8% so với 94,1%; 13,3% so với 86,6% Hiệu quả điều trị bệnh Parvovirus trên chó ở tỉnh Tiền Giang và Tp Cần Thơ là tương đương nhau tỷ lệ là 86,6% và 58,8% [15]

Năm 2020, tác giả Đoàn Hoàng Phú và cộng sự của mình đã nghiên cứu về các yếu tố liên quan đến sự xuất hiện của bệnh do CPVs gây ra trên chó tại Thành phố

Hồ Chí Minh, Việt Nam Tổng số 132 con chó dưới sáu tháng tuổi đã được tuyển chọn trong nghiên cứu và chia thành hai nhóm: nhóm dương tính với CPVs gồm 44 (33,3%) con và nhóm đối chứng gồm 88 (66,7%) con khỏe mạnh Kết quả cho thấy đối với chó không được tiêm phòng có nguy cơ nhiễm CPV cao hơn 11,7 lần so với chó đã được tiêm phòng Nguy cơ nhiễm CPV ở chó được nuôi chung với chó cùng

độ tuổi là 5,01 Nguy cơ lây nhiễm CPV của chó có tiếp xúc với chó khác hơn 3,13 lần so với không tiếp xúc [19]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Nakamura và cộng sự của ông đã phát hiện một biến thể kháng nguyên mới của CPV từ mẫu chó bệnh do CPV gây bệnh tại Việt Nam Đây là một biến thể kháng nguyên mới của CPV-2b khi được kiểm tra bằng phản ứng hemag-glutination với kháng thể đơn dòng 21C3 và 19D7 Kết quả cho thấy

có sự thay thế axit amin ở vị trí 426, Asp thành Gla, sự thay thế tương tự này cũng

được tìm thấy ở chủng Canine parvovirus phát hiện ở Ý Nghiên cứu này lần đầu tiên

cho thấy sự thay thế các axit amin như trên gây ra sự khác biệt về kháng nguyên thông qua kháng thể đơn dòng, do đó nhận định có thể có sự xuất hiện các biến chủng khác nhau của CPV tại Việt Nam [14]

Năm 2019, nhóm nghiên cứu của tác giả Minh Hoàng và cộng sự đã tiến hành khảo sát sự lưu hành và phân bố của các kiểu gen CPV-2 từ ba vùng gồm miền Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 2 năm 2018 Kết quả thu được 6 mẫu (2,31%) được xác định là CPV-2a, 251 mẫu (96,54%) được xác định là CPV-2c Ở miền Bắc Việt Nam, tỷ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là 2,9% (3/101) và 97,3% (98/101) Ở miền Trung Việt Nam, tỷ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là 1,1% (1/90) và 98,8% (89/90) Ở miền Nam Việt Nam, tỷ lệ CPV-2a và CPV-2c lần lượt là 3,0% (2/66) và 96,9% (64/66), CPV-2b không được quan sát thấy trong nghiên cứu này Các gen VP2 của CPV-2c ở Việt Nam tương đồng về mặt di truyền với các gen CPV-2c ở Trung Quốc và Đài Loan [11]

Năm 2019, Nguyễn Thị Hiếu Dân và cộng sự đã khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột do CPVs gây ra tại Thành phố Bến Tre từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 2 năm

2019 Kết quả sau khi kiểm tra 516 mẫu bằng kit phản ứng nhanh Canine parvovirus

antigen có 172 mẫu dương tính (tỷ lệ 33,3%) Chó từ 2 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (46,2%) Những chó đã tiêm phòng vắc-xin có tỷ lệ nhiễm bệnh thấp hơn so với chó không được tiêm phòng (6,9% so với 52,3%) [29]

Năm 2021, nhóm tác giả Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự đã phân tích các trình tự gen mã hóa protein bề mặt VP2 (1755bp) tại Việt Nam Trong nghiên cứu này, 33 mẫu phân được thu thập từ tháng 2 năm 2017 đến tháng 6 năm 2019 từ những con chó tại tám tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam bị tiêu chảy xuất huyết và có các triệu chứng nhiễm CPVs, từ các mẫu này thu được 33 trình tự VP2 Phân tích trình tự 88 trình tự VP2 gồm 33 trình tự VP2 trong nghiên cứu, 1 trình tự vắc-xin thương mại và 54 trình tự được thu thập từ các nghiên cứu trước đó Kết quả sau khi

so sánh trình tự VP2 và phân tích phát sinh loài cho thấy sự hiện diện của hai nhóm lớn của các chủng CPV-2c lưu hành tại Việt Nam: “new” và “new-var” Các chủng CPV-2c Việt Nam ở khu một khu vực độc lập và tách biệt với các chủng CPV-2c ở

châu Á Sự phổ biến của các đột biến5G / 447M CPV-2c mới đã được quan sát thấy

từ năm 2016 đến năm 2019, khi chúng dường như thay thế các chủng 5G / 447I Sự thay đổi axit amin trong các biểu mô của VP2 có thể là nguyên nhân dẫn đến việc tạo

ra các biến phụ và ảnh hưởng đến tính kháng nguyên, tính sinh miễn dịch hoặc độc lực của vi-rút [17]

Nhìn chung, tại Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do CPVs gây ra vẫn còn hạn chế, trong đó chủ yếu tập trung vào các phương pháp chuẩn đoán phát hiện, phân lập,

và đánh giá đặc điểm di truyền của các chủng CPVs đã và đang lưu hành hiện tại Hơn nữa, việc thiếu thông tin về các chủng CPV-2c lưu hành trong khu vực và bằng chứng vắc xin hiệu quả là những lý do chính khiến dịch bệnh CPVs cắt đứt đã xuất hiện theo mùa trong nước Cần có thêm nhiều nghiên cứu cập nhật mới để bổ sung thông tin, hiểu rõ hơn tình hình dịch tễ, tỷ lệ nhiễm qua từng năm và về đặc điểm di truyền của chủng CPV-2c đang lưu hành ở Việt Nam để có các biện pháp ngăn ngừa

và kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả

Một số nghiên cứu về CPV trên thế giới:

Năm 2001, Buônavoglia và cộng sự đã phát hiện và phân lập CPV-2c tại Ý, cung cấp bằng chứng tiến hóa của CPV [6]

Năm 2006, Chinchkar và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học và phân tích đặc điểm di truyền của CPVs gây ra trên chó tại Ấn Độ Kết quả cho thấy các chủng phân lập tại Ấn độ thuộc CPV-2a ngoại trừ có bốn chủng thuộc CPV-2b

So sánh trình tự gene VP2 cho thấy các chủng trong nghiên cứu của Ấn Độ có sự khác biệt với các chủng tại khu vực Đông Nam Á và có xu hướng tiến hóa độc lập và các mô hình địa lý tiến hóa khác nhau không thể xác định được với các mẫu trong nghiên cứu [30]

Năm 2015, Roldán và các cộng sự đã giải trình tự và mô tả kiểu gen của các chủng CPV, cung cấp bằng chứng có giá trị về tần số thống trị của loại vi-rút này trong một quần thể chó ở miền tây Mexico [31]

Năm 2017, Woolford và cộng sự phát hiện phân nhóm Canine parvovirus 2c ở

chó Úc [32]

Năm 2018, Torre và cộng sự xác định sự hiện diện của các biến thể của chó, đặc

tính phân tử của các biến thể Canine parvovirus (CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c) dựa trên VP2 ở chó nhà bị ảnh hưởng ở Ecuador [33]

Chunmei và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu trình tự bộ gene của chủng CPV SC02/2011, được phân lập từ một con chó có mắc bệnh tiêu chảy cấp tính nặng

ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc Kết quả trình tự bộ gene của chủng CPV SC02/2011 gồm 4699 nucleotide chứa hai khung đọc mở (ORF) ORF1 (nt 151 đến 2157) mã hóa hai protein phi cấu trúc (NS1 và NS2), và ORF2 (nt 2164 đến 4419) mã hóa hai protein cấu trúc (VP1 và VP2) Trình tự bộ gen của SC02/2011 chia sẻ lần lượt mức

độ tương đồng 96,13% ( NC_001539 ), 98,51% và 99,4% trình tự nucleotide với của CPV-c (NC_001539), CPV-Y1 (D26079 ) và CPV-b (M38245) Nghiên cứu này sẽ giúp tăng sự hiểu biết về dịch tễ học phân tử và sự đa dạng di truyền của các chủng CPV tại miền Nam Trung Quốc và giúp cho việc phòng ngừa và kiểm soát lây nhiễm CPV trong tương lai [34]

Năm 2015, Han và cộng sự đã mô tả đặc điểm genome đầy đủ của hai chủng CPVs đang lưu hành phổ biến ở Tây Bắc Trung Quốc Bộ gene đầy đủ của hai chủng

là CPV-LZ1 và CPV-LZ2 đã được xác định và phân tích, so sánh với bộ gene của các chủng CPV tham chiếu Trình tự hai bộ gene của hai chủng CPV-LZ1 và CPV-LZ2 gồm 5053 nucleotide, lần lượt là CPV-2a; CPV-2b Kết quả phân tích trình tự cho thấy rằng hai chủng mới này đã trải qua các biến thể đặc biệt cụ thể trong quá trình thích nghi ở địa phương Kết quả nghiên cứu này cho thấy bằng chứng cụ thể hơn về dịch tễ học cũng như sự đa dạng di truyền của CPV phân lập từ Tây Bắc Trung Quốc,

từ đó hỗ trợ ngăn ngừa và kiểm soát bệnh do CPVs ở khu vực này.Ngoài ra, nghiên cứu cung cấp phương pháp để xác định bộ gene hoàn chỉnh CPVs lưu hành [35] Silva và cộng sự (2017) đã mô tả đặc điểm genome và phân tử với chiều dài đầy đủ của chủng CPV gây bệnh trên chó ở Brazil Thông qua việc giải trình bộ gene đầy đủ (NS1, NS2, VP1, VP2), chủng CPV-2 đang lưu hành tại Belém được xác định

là CPV-2b (426Asn-Asp) Chủng CPV-2b với sự thay đổi khác nhau ở vị trí 324Tyr-Leu

đã được phát hiện trong tất cả các mẫu được đánh giá Phân tích phát sinh loài cho thấy các chủng ở Belém là CPV-2b và CPV-2a có mối quan hệ gần gũi và có thể là biến chủng của các chủng CPVs lưu hành sau 1990 Phân tích trình tự gene bằng phương pháp bằng RDP4 và SplitsTree4 cho thấy không có hiện tượng tái tổ hợp xảy

ra Kết quả này cho thấy, cần theo dõi liên tục và xác định đặc điểm phân tử của các mẫu CPV-2 không chỉ để xác định các thay đổi về gene và kháng nguyên có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vắc-xin mà còn để hiểu rõ hơn về các cơ chế thúc đẩy sự phát triển của CPV-2 ở Brazil [36]

Năm 2019, Mira và cộng sự đã nghiên cứu sự lây lan của CPV-2c có nguồn gốc từ CPV Châu Á đang lưu hành ở miền nam nước Ý Đặc điểm di truyền của các

chủng CPV-2c hiện đang lan truyền ở Ý thông qua các trình tự genome gần đầy đủ Sự đồng lưu hành của hai chủng CPV-2c khác nhau nhưng có liên quan, với sự thay đổi axit amin đặc trưng của các chủng CPV có nguồn gốc châu Á (NS1: 60V, 544F, 545F, 630P-NS2: 60V, 151N, 152V-VP2: 5A/G, 267Y, 297A, 324I, 370R), các phân tích phát sinh loài từ trình tự gen NS1 và VP2 đã xác nhận mối quan hệ với các chủng CPV-2c châu Á Kết quả nghiên cứu này báo cáo sự lây lan của các đột biến CPV-2c mới ở Ý và hỗ trợ các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá sự tồn tại và khả năng lây lan của các biến chủng này tại Ý [37]

Năm 2019, Ogbu và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm genome gần như đầy đủ chiều dài của các chủng Canine parvovirus lưu hành ở Nigeria Kết quả sau khi phân tích gen phi cấu trúc đã chứng minh những thay đổi amino acid chưa từng được báo cáo trước đây Phân tích phân tử dựa trên trình tự genome đã chứng minh mô hình phân bố địa lý của các chủng được phân tích, cho thấy nguồn gốc tiến hóa chung tiềm năng với CPV có nguồn gốc Châu Á Nghiên cứu này đại diện cho đặc điểm phân tử CPV đầu tiên bao gồm tất cả các trình tự gen mã hóa được tiến hành ở lục địa Châu Phi và góp phần xác định sự lây lan địa lý hiện tại của các biến thể CPV trên toàn thế giới [38]

Năm 2020, Hao và cộng sự đã báo cáo về sự phổ biến ngày càng tăng của chủng CPV-2c gây ra ở chó nuôi tại Trung Quốc từ năm 2016 đến năm 2019 tại tỉnh Quảng Đông, Quảng Châu, Thâm Quyến và Đông Quan Kết quả cho thấy 55,7% (34/61) mẫu dương tính với CPV-2, phát hiện hai vị trí axit amin được tương đồng báo cáo trước đây, A5G và Q370R của các đột biến CPV-2c và một số phân lập CPV-2 với đột biến 13P-S và 582K-N đã được phát hiện trong nghiên cứu này [39]

Năm 2020, Ramirez và cộng sự đã nghiên cứu phân tích phát sinh loài, tiến hóa

và cấu trúc của các biến thể kháng nguyên CPV-2 đang lưu hành ở Colombia bằng phản ứng PCR và giải trình tự gene VP2 Kết quả thu được 93,1% mẫu thuộc về biến thể CPV-2a mới trước đây Phân tích trình tự axit amin cho thấy rằng tất cả CPV-2a đều chứa đột biến 297Ala-Asn, có liên quan đến nhánh CPVs phân lập tại Nam Mỹ và đột biến 514Ala-Ser, cho phép mô tả đặc điểm là một biến thể phụ CPV-2a mới Biến thể CPV-2b, có 267Phe-Tyr, 324Tyr-Ile và 440Thr-Ala liên quan đến các biến thể nhánh Asia-I CPV-2c không được phát hiện trong các mẫu [40]

Nhìn chung các nghiên cứu đều nhằm mục đích theo dõi tình hình dịch bệnh và khả năng tiến hóa của CPVs, giúp phục vụ cho quá trình nghiên cứu đặc điểm dịch

tễ, chế tạo vắc-xin cho công tác phòng và điều trị bệnh Do đó, việc nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu để cập nhật tình hình dịch tễ, đặc điểm phân tử CPV và cơ chế

tiến hóa của CPVs ở nhiều vùng địa lý khác nhau sẽ góp phần dự đoán xu thế lây nhiễm cũng như biến đổi của CPVs là hết sức cấp thiết.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Thời gian thực hiện đề tài: từ 02-08/2021

- Địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

- Địa điểm lấy mẫu: Một số phòng khám Thú y trên địa bàn TP Hồ Chí Minh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và bảo quản mẫu phân tiêu chảy của chó tại phòng khám Thú y với kết quả dương tính CPVs bằng Kit chẩn đoán nhanh

- Chẩn đoán và nhận diện phân tử CPVs bằng phản ứng PCR

- Giải trình tự và phân tích đặc điểm trình tự (trình tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài) của gene mã hóa protein bề mặt VP2

- Giải trình tự và phân tích trình tự genome hoàn chỉnh của 05 mẫu CPVs (trình

tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài)

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Canine parvovirus trong mẫu phân tiêu chảy cấp tính của chó thu thập tại một

số phòng khám Thú y tại Tp Hồ Chí Minh

2.4 Vật liệu nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Mẫu bệnh phẩm là mẫu phân tiêu chảy cấp tính của chó được thu thập ở một số Phòng khám Thú y trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh nhiễm CPVs có các dấu hiệu lâm sàng như lờ đờ, nôn mửa, tiêu chảy ra máu (Hình 2.1)

2.4.2 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu được thu nhận từ trực tràng bằng tăm bông khử trùng, sau đó được bảo quản trong ống ly tâm 15 ml khử trùng và có chứa sẵn môi trường đệm PBS (pH 7.2) (Hình 2.1) Sau đó, mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm và được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở nhiệt độ -20 ºC tới khi sử dụng

Hình 2.1 Thu thập mẫu (a) biểu hiện lâm sàng của chó nhiễm CPVs, (b) phân tiêu

chảy lẫn máu, (c) thu nhận mẫu phân thí nghiệm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Chẩn đoán CPVs bằng Kít xét nghiệm nhanh

Chẩn đoán nhanh CPVs bằng Kit Canine parvovirus Ag (CPV Ag, Green Age, Việt Nam) Kit test nhanh dựa vào nguyên lý của kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus Parvo trên chó từ các mẫu phân xét nghiệm Hai kháng thể đơn dòng chuyên biệt từ bộ kit kết hợp với các điểm quyết định kháng nguyên khác nhau của của kháng nguyên cần chẩn đoán Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm cellu-lozo của thiết bị, các kháng nguyên của virus Parvo sẽ di chuyển và kết hợp với chất keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus Parvo khác trong màng nitơ-cellulozo của thiết bị, để tạo thành hợp chất kẹp hoàn chỉnh “Kháng thể-Kháng nguyên-Kháng thể” Tóm tắt phương pháp như sau: lấy mẫu phân bằng một tăm bông

và cho vào ống tuýp (1.5 ml) có chứa 1 ml dung dịch pha loãng Khuấy đều cho đến khi mẫu tan đều trong dung dịch sau đó nhỏ 3 đến 5 giọt hỗn hợp vào que thử, đợi từ

5 - 10 phút Đọc kết quả như sau: nếu que thử hiện lên một vạch (C, control) là âm tính, hai vạch (C và T, test) là dương tính (Hình 2.2)

Hình 2.2 Chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs (1) Giếng nạp mẫu; (2)

Vạch mẫu thử nghiệm; (3) Vạch đối chứng Mũi tên chỉ hướng thẩm thấu của mẫu

(3) (2) (1)

2.5.2 Phương pháp PCR

2.5.2.1 Tách chiết DNA

DNA của CPVs được tách chiết sử dụng bộ Kít TopPURE® Genomic DNA Extraction của công ty TNHH Giải pháp Y sinh ABT, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Tóm tắt các bước thực hiện như sau:

Bước 1: Huyền phù mẫu trong 200 µL PBS Thêm 20 µL Proteinase K và chuyển sang bước kế tiếp

Bước 2: Thêm 200 µL CL buffer, vortex đều và ủ khoảng 10 phút ở 60°C Bước 3: Thêm 200 µL Ethanol (96-100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 4: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Thêm 500 µL WB1 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Thêm 500 µL WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút

Bước 7: Chuyến cột sang tube 1,5 mL mới Thêm 50 µL EB buffer và ủ một phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới

Bước 8: DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20°C

2.5.2.2 Thực hiện phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)

DNA thu được sẽ được khuếch đại bằng phương pháp PCR với máy PCR

(Mastercycler® X50-Eppendof) và các cặp mồi đặc hiệu CPVs với chu trình nhiệt

tương ứng Thành phần của phảng ứng PCR được mô tả trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thành phần trong phản ứng PCR

5 Mồi ngược 1 10X

6

7

DNA khuôn Nước khử ion

5 13.75

10X

Các cặp mồi được sử dụng phát hiện Canine parvovirus là 555F và

Pav-555R [6] với kích thước 583 bp và cặp mồi khuếch đại vùng gene VP2 để giải trình tự gene là cặp mồi đặc hiệu VP2 có kích thước là 1755bp (VP2-51F và VP2-R3) [28]

Bảng 2.2 Primers sử dụng trong phản ứng PCR

Các cặp mồi sử dụng để khuếch đại trình tự genome được thiết kế trong nghiên cứu này dựa trên các vùng trình tự bảo thủ của các chủng CPVs

(CPV/Y1/Japan/1993/D26079) thu thập trên dữ liệu NCBI-Genbank

Bảng 2.3 Các cặp mồi sử dụng trong khuếch đại trình tự bộ genome CPV

(bp)

G/C (%)

Tm (°C)

Parvo-F1 TTAGAACCAACTGACCAAGTTCA

CG

(+), 6-30

1225 44 64.1 Parvo-R1 CACCTCCTGGTTGTGCCATC (-), 1230-1211 60 62.5

Parvo-F2 CAAAGCGCGGGAGAATTCAA (+), 1084-1103

1427 50 58.4 Parvo-R2 CAGAGCGAAGATAAGCAGCG (-), 2511-2492 55 60.5

Parvo-F3 GGACTTGTGCCTCCAGGTTA (+), 2385-2404

1358 55 60.5 Parvo-R3 CCCATTTGAGTTACACCACGTC (-), 3742-3721 55 62.1

Parvo-F4 AGAGCATTGGGCTTACCACC (+), 3630-3649

1387 55 60.5 Parvo-R4 CCTGGTTGGTTGCTCTGCTTA (-), 5016-4996 55 61.3

ParvoSeq-171R ATTAGCCCGCCACCTTTTCC (-), 171-152 171 60 60.5

ParvoSeq-4760F TTATGGTGTGGGTGGTTGGT (+), 4760-4779 256 50 58.4

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa genome và vị trí các cặp mồi

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Bảng 2.4.Nhiệt độ và thời gian trong phản ứng PCR

Kiểm tra sản phẩm PCR: Sau khi phản ứng PCR khuếch đại kết thúc, DNA sẽ

được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% (FMC, Rockland)

2.5.3 Giải trình tự gen

Sản phẩm PCR của các đoạn gene khuếch đại được tinh sạch bằng bộ kít QIAquick PCR Purification (QIAgen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh sạch được sử dụng để giải trình tự theo phương pháp Sanger sequencing với cặp mồi khuếch đại đặc hiệu như trình bày tại bảng 2.5 và bảng 2.6 tại công ty FirstBase, Malaysia

2.5.4 Phân tích trình tự gene

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm DNASTAR Lasergene (DNASTAR®) Trình tự nucleotide (nt) và amino acid (aa) của các chủng CPVs và các chủng tham chiếu được phân tích, so sánh bằng phần mềm BioEdit 6.0 [41]

2.5.5 Xây dựng và phân tích cây phát sinh loài

Trình tự di truyền gen CPVs của nghiên cứu này được so sánh với các chủng CPVs tham chiếu thu thập từ dữ liệu NCBI-Genbank Trình tự gen được sắp xếp sử dụng chương trình CLUSTAL-X alignment [42] Cây phả hệ được xây dựng dựa vào phần mềm Mega 7.0 với tham số Kimura-2 parameter mô phỏng sự thay đổi nt và Bootstrapre-sampling 1,000 lần [43]

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả thu nhận mẫu

Từ tháng 08/2019-08/2020 có tổng số 130 mẫu phân tiêu chảy cấp tính của chó với các triệu chứng điển hình bao gồm sốt, lờ đờ, ít vận động, nôn mửa, tiêu chảy và phân lẫn máu được thu thập tại một số Phòng khám Thú y trên địa bản Tp Hồ Chí Minh Trong đó 75 mẫu được thu thập từ Phòng khám Thú y tại quận Bình Tân và 55 mẫu được từ Phòng khám tại Quận 12

Tại Phòng khám, mẫu bệnh phẩm được chẩn đoán nhanh với CPVs bằng Kít CPV-Ag theo yêu cầu của chủ vật nuôi Tổng số 25/130 mẫu được thực hiện chẩn đoán nhanh (Bảng 3.1) Mặc dù đây là phương pháp xác định CPVs nhanh, có vai trò quan trọng trong hỗ trợ điều trị bệnh, tuy nhiên do giá thành tương đối cao nên đa phần các chủ hộ có chó nuôi giá trị kinh tế thấp thường không thực hiện Bác sĩ Thú

Y chủ yếu dựa vào các đặc điểm về dịch tễ và các triệu chứng đặc trưng kèm theo để quyết định phương pháp điều trị cho chó bệnh

Bảng 3.1 Kết quả thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy trong nghiên cứu này Địa điểm Chẩn đoán bằng Test CPV-Ag Triệu chứng lâm sàng

Bảng 3.2 Kết quả sau điều trị của có bị nhiễm CPV

Kết quả thu mẫu có thể cho ta thấy được tỷ lệ chó bị tiêu chảy cấp tính hiện tại

ở thành phố Hồ Chí Minh xảy ra phổ biến đặc biệt là những nơi nuôi nhốt mật độ cao

và điều kiện vệ sinh kém CPVs thường gây bệnh thường theo mùa, tỷ lệ bệnh tăng nhanh vào mùa mưa (miền Nam) hoặc khi thời tiết thay đổi bất thường Trong nghiên

cứu này, tỷ lệ chó bị chết khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy cấp tính là rất cao, khoảng 90.8 % (118/130) Tỷ lệ này cao hơn so với tỷ lệ trung bình gây chết do CPVs

đã được công bố trong các nghiên cứu trước đó Nguyên nhân chủ yếu là chó nghiên cứu đa phần là chó con, sức đề kháng yếu, phát hiện bệnh muộn do chủ vật nuôi tự điều trị tại nhà trong một khoảng thời gian khiến bệnh trở nặng hơn

3.2 Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu bệnh phẩm

Những mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm CPVs thu được tại các phòng khám Thú

Y được vận chuyển về phòng thí nghiệm Tiếp theo, mẫu được tách chiết DNA và sử dụng cho phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu CPVs trên gen VP2 (Pav-555F và Pav-555R) (Bảng 2.2) Sản phẩm PCR được nhận diện trên trên gel agarose 1,2 % (FMC, Rockland) với kích thước 583 bp (Hình 3.1)

Hình 3.1 Kết quả PCR chẩn đoán CPVs Mẫu thí nghiệm (làn 1-10), thang DNA (M)

Kết quả PCR chẩn đoán CPVs trong các mẫu phân tiêu chảy thu thập được trình bày chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu thí nghiệm

Cần Thơ, 84/184 (45.1%) mẫu cho kết quả dương tính với CPVs [16] Trong khi đó, Nguyễn Thị Yến Mai và cộng sự (2018) đã khảo sát tỷ lệ nhiễm CPVs từ tháng 11/2017-5/2018 dựa vào kit chẩn đoán nhanh CPV-Ag với mẫu phân tiêu chảy có lẫn máu tại phòng mạch Thú y, chi cục Chăn nuôi và thú Tiền Giang, phòng mạch Thú y Nam Thủy Đồng Tháp và Bệnh xá Thú y Trường Đại học Cần Thơ Kết quả cho thấy

tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do CPVs trên chó tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ lần lượt là 30%, 34% và 30% [44] Một nghiên cứu khác của Minh Hoàng và cộng sự (2019) điều tra về tình hình dịch tễ học do CPV-2 gây ra

ở Việt Nam với tổng số 260 bệnh phẩm thu được ba vùng gồm miền Bắc, miền Trung

và miền Nam Việt Nam từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 2 năm 2018 Kết quả 260/260 (100%) mẫu bệnh phẩm xác định dương tính với CPVs bằng phương pháp PCR [11] Điều này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do CPVs gây ra tại Việt Nam ngày càng tăng cao Cần có các phương pháp chẩn đoán nhanh chính xác để phát hiện bệnh kịp thời nhằm đưa ra các phương án kiểm soát dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng, điều trị bệnh hiệu quả

3.3 Kết quả PCR khuyếch đại gen VP2

Sau khi xác định được các mẫu dương tính với CPVs bằng phương pháp PCR, chúng tôi lựa chọn 15 mẫu thí nghiệm và mẫu vắc-xin thương mại VANGUARD

®PLUS 5 để tiến hành thực hiện phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen VP2 với cặp mồi đặc hiệu (VP2-51F và VP2-R3) được mô tả trong Bảng 2.2 Kết quả điện di

sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1,2 % (FMC, Rockland)

Hình 3.2 Kết quả PCR khuếch đại trình tự đầy đủ gen VP2 M-thang DNA

Kết quả khuếch đại gen VP2 của 15 mẫu thí nghiệm và vắc-xin lên đúng với kích thước 1755 bp Sản phẩm PCR đều, rõ, không xuất hiện hiện tượng vệt mờ, thích

hợp cho việc giải trình tự Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế và giải trình tự bằng phương pháp Sanger Sequencing tại công ty First Base, Malaysia

3.4 Kết quả PCR genome hoàn chỉnh của chủng CPVs trong nghiên cứu này

Từ kết quả xác định các mẫu dương tính CPVs trước đó, chọn 05 mẫu CPVs với kết quả PCR chẩn đoán lên đúng vị trí và không bị các vệt mờ để tiến hành khuếch đại trình tự genome hoàn chỉnh sử dụng các cặp mồi được thiết kế như mô tả trong Bảng 2.3 Chiều dài bộ gene CPV ước tính trong khoảng >5kb, do đó chúng tôi tiến hành khuếch đại 4 đoạn DNA với các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự kiến như sau: ParvoF1/Parvo-R1, 1024bp; Parvo-F2/Parvo-R2, 1427bp; Parvo-F3/Parvo-R3, 1358bp; Parvo-F4/Parvo-R4, 1193bp Kết quả khuếch đại cho thấy các cặp mồi thiết kế có độ nhạy và đặc hiệu với các chủng CPVs trong nghiên cứu này Sản phẩm PCR được nhận diện trên trên gel agarose 1,2% với kích thước tương đương với các kích thước dự kiến (Hình 3.3)

Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs trong nghiên

cứu này Thứ tự từ trái qua phải, từ trên xuống dưới trình bày sản phẩm PCR khuếch đại với các cặp primers Parvo-F1/Parvo-R1; Parvo-F2/Parvo-R2; Parvo-

F3/Parvo-R3; Parvo-F4/Parvo-R4 M-thang DNA

3.5 Kết quả giải trình tự gen VP2

Chúng tôi chọn ra 15 mẫu khuếch đại gen VP2 để tiến hành giải trình theo phương pháp Sager Sequencing tại công ty 1st Base, Malaysia và trình tự được đánh giá bằng phần mềm Seqman 5.0 DNASTAR Kết quả thu được gene VP2 của toàn bộ 15 mẫu nghiên cứu có độ dài là 1755 bp Trình tự các mẫu được tiến hành so sánh trên hệ thống BLAST NCBI Genbank Kết quả cho thấy tất

cả 15 mẫu nghiên cứu giống nhau đều thuộc CPV genotype 2c (CPV-2c) (Hình 3.4)

Hình 3.4 Kết quả so sánh tương đồng trình tự trên hệ thống BLAST NCBI 3.6 Kết quả giải trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu

Sản phẩm PCR khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu cho trình tự genome hoàn chỉnh được tinh chế bằng bộ kít QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm tinh chế được giải trình tự bằng phương pháp Sanger Sequencing tại công ty FirstBase, Malaysia

Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm DNAstar cho thấy trình tự genome thu được là 4559 bp Trình tự được sử dụng để so sánh trên cơ sở dữ liệu

BLAST-NCBI cho kết quả 05 mẫu vi-rút phân lập được là thuộc chủng Canine

parvoviruses, thuộc genotype CPV-2c với mức độ tương đồng cao từ >99% Khi so

sánh với chủng tham chiếu CPV-SH1516/China/2017/MG013488 phân lập tại Trung Quốc với trình tự đầy đủ của bộ gene là 5059 bp thì các chủng CPVs trong nghiên cứu này xuất phát từ nucleotide 208 đến 4599 (Hình 3.5) Trình tự thu được chứa đầy

đủ các gene mã hóa cho các proteins VP2, VP1, NS1 và NS2 với các kích thước tương

ứng 1755 nt (nt 2784-4538), 2256 nt (nt 2283-4538), 2007 nt (nt 270-2276) và 1977

nt (nt 300-2276)

Hình 3.5 So sánh trình tự genome của các chủng trong nghiên cứu này với chủng

tham chiếu CPV-SH1516 phân lập tại Trung Quốc

Phân tích trình tự genome chủng HCM2019-01 cho thấy tỷ lệ % các nucleotide

A, T, G, và C lần lượt là 36.1%, 27.8%, 20.1%, và 16% Trong đó, tỷ lệ A+T và G+C lần lượt là 63.9% và 38.1% Trong cấu trúc DNA, các liên kết hidro tạo nên giữa A-

T và G-C lần lượt là 2 và 3 [45] Do đó, tỷ lệ G+C trong trình tự CPV tương đối thấp,

và đây có thể là nguyên nhân làm cho DNA của CPV kém ổn định và dễ phát sinh biến dị trong quá trình tiến hóa [25] [45] Tỷ lệ đột biến của CPV tương tự như các RNA vi-rút vào khoảng 10-4 vị trí/năm [45]

3.7 Kết quả so sánh trình tự gen VP2 và trình tự genome hoàn chỉnh của các chủng CPVs trong nghiên cứu này

Gene VP2 của CPVs có độ dài 1755 bp mang đột biến rất phong phú và đóng vai trò quan trọng trong quá trình kích thích đáp ứng miến dịch của cơ thể vật chủ Các phân tích về trình tự của gene VP2 đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các kiểu huyết thanh của CPVs và hỗ trợ phân tích xác định các dạng CPVs ngoài tự nhiên [46] Trong đó các genotypes -2a, 2b, và -2c được phân biệt tại vị trí amino acid số 426 (426Asn cho CPV-2a, 426Asp cho CPV-2b, và 426Glu cho CPV-2c) [6] Những khảo sát về protein VP2 của CPVs là điều kiện cần thiết nhất để xây dựng các biện chiến lược vắc-xin trong phòng và điều trị bệnh [13]

Trình tự hoàn chỉnh gene VP2 của 20 mẫu CPVs trong nghiên cứu này được xác định nhằm mục đích phân tích về sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các chủng CPV-2c của Việt Nam với các chủng CPVs khác trong cơ sở dữ liệu NCBI-GenBank Trình tự VP2 trong nghiên cứu này được xác định có độ dài là 1755 bp tạo

ra khung đọc mở để mã hóa cho 585 amino acids Vị trí amino acid 426Glu xác định các chủng CPVs trong nghiên cứu này thuộc vào genotype CPV-2c Đối với gene VP2, trình tự nucleotide giữa các chủng trong nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng

là từ 99,4%-100% Khi so sánh với các chủng CPV-2 khác, trình tự gene VP2 của các chủng nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng về trình tự nucleotide cao với chủng CPV-2c lưu hành có nguồn châu Á, bao gồm các chủng phân lập từ Trung Quốc (MF001435/CN-YZ1), Đài Loan (MN832850/Taiwan2018) và Thái Lan (MH711894/CU24) với các giá trị lần lược là 99,4-99,7%, 99,4-99,8% và 99,5-99,9% Ngược lại, trình tự gene VP2 của các chủng được nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng về trình tự nucleotides thấp hơn với chủng vắc-xin thương mại VanguardPlus CPV là từ 98,2-98,7%

Trình tự genome hoàn chỉnh của các mẫu trong nghiên cứu này thuộc genotype CPV-2c được xác định có độ dài 4599 bp chứa đầy đủ các gen mã hóa protein cấu trúc VP2/VP1 và gene mã hóa protein phi cấu trúc NS1/NS2 Đối với trình tự genome, trình tự nucleotide chia sẻ mức độ tương đồng giữa các chủng từ nghiên cứu này là 99,5-100% và có mức nhận dạng cao nhất với các chủng được phân lập từ Trung Quốc (MG013488/CPV-SH1516), Thái Lan (MH711902/CU24), Đài Loan (MN832850/Taiwan-2018) và Mông Cổ (MH660909/5MGL) với lần lượt là 99,7-99,8%, 99,6-99,8%, 99,6-99,7% và 99,6%

3.8 Kết quả phân tích và so sánh trình tự amino acid (aa) của VP2 protein

Phân tích trình tự amino acids của các chủng nghiên cứu với các chủng tham chiếu phân lập từ Trung Quốc (CN-YZ1, -2c), Đài Loan (Taiwan/2018, -2c), Thái Lan (CU24, -2c) Đặc biệt trong nghiên cứu này chúng tôi đồng thời giải trình tự và

so sánh với chủng CPV từ vắc-xin VanGuardPlus (CPV-2a) để đánh giá mức độ tương đồng và qua đó đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin này trong việc phòng và điều trị bệnh do CPVs lưu hành tại Việt Nam Kết quả cho thấy có 07 vị trí amino acids khác nhau giữa các chủng nghiên cứu với các chủng tham chiếu phân lập tại Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan, bao gồm: 5Ala-Gly, 294leu-Ser, 375Glu-Asp,447Iso-Met,

535Phe-Ser,và 582Lys-Arg Có 16 vị trí amino acids khác nhau giữa các chủng nghiên cứu với chủng vắc-xin VanGuardPlus, bao gồm 5Ala-Gly, 44Ala-Thr, 87Met-Leu, 101Iso-Thr,

267Phe-Tyr, 297Ser-Ala, 300Ala-Gly, 305Asp-Tyr, 324Tyr-Iso, 370Glu-Arg, 375Glu*-Asp*, 426Asp-Glu*,