Công ty TNHH Thông Thuận thành lập theo giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh số 004339/GP-TLDN sở kế hoạch đầu tư tỉnh Bình Thuận cấp ngày 11 tháng 08 năm 1999 Tiền thân Công ty TNHH Thông Thuận sở sản xuất tơm giống hình thành từ năm 1990, ơng Trương Hữu Thông gầy dựng nên xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận Trong tiến trình lịch sử đầy thăng trầm, công ty phát triển ngày lớn mạnh vững hôm khẳng định mạnh dẫn đầu nước ngành sản xuất tôm giống; nuôi tôm thương phẩm, chế biến thủy sản xuất khẩu, sản xuất gạch tuynel sản xuất muối công nghiệp Hoạt động sản xuất Công ty bao gồm: 1) 2) 3) 4) 5) Sản xuất tôm giống Thông Thuận Sản xuất tôm thương phẩm Sản xuất gạch Tuynel Chế biến thủy sản xuất Ni bị giống thịt, bị sữa cơng nghệ cao Cơng ty phát triển ngày hôm phần lớn nhờ nổ lực không ngừng người sáng lập đầu tiên, Ơng Trương Hữu Thơng - Chủ tịch Hội Đồng Quản Trị kiêm Tổng Giám đốc công ty 5.000 tập thể cán bộ, công nhân viên đơn vị Tổng công ty Thông Thuận, cộng với đồng thuận lãnh đạo địa phương, khách hàng nước quan tâm ủng hộ Sản xuất tơm giống chất lượng: Cơng ty có khu sản xuất tôm giống, với 100 trại giống đại (đạt chứng nhận GlobalGAP, ACC châu Âu Mỹ) Hàng năm, Công ty sản xuất cung ứng tỷ giống đạt chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Việt Nam, sau nhiều năm tìm tịi chọn lọc từ nguồn tôm bố mẹ tốt giới; Công tác sản xuất giống tuân thủ theo quy trình nghiêm ngặt thực đội ngũ công nhân lành nghề cán kỹ thuật trình độ cao, nhiều kinh nghiệm Ni tơm thương phẩm:
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHOA HÓA HỌC TÂY NGUYÊN
- -BÁO CÁO THỰC TẬP NGHỀ NGHIỆP
“THAM GIA TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT NƯỚC CỦA CỦ ĐINH LĂNG”
Trang 2Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo quý Công ty đã tiếp nhận em vào thực
tập tại Nhà máy chế biến số 2 – Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận Tại NinhThuận Cảm ơn tất cả các Chị trong phòng Kiểm nghiệm đã tận tình hướng dẫn và tạomọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập Với vốn kiến thức được tiếpthu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình viết bài báo cáo mà còn làhành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin để thực hiệncông việc sau này
Em kính chúc Ban lãnh đạo Công ty và các Chị trong phòng Kiểm nghiệm dồidào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc
Em xin chân thành cảm ơn!
Phan Rang, tháng 12 năm 2017
Người thực hiện
Nguyễn Nghiêm
Trang 3MỤC LỤC
Lời cảm ơn 1
I GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THÔNG THUẬN 2
II KHÁNG SINH 4
2.1.Khái niệm kháng sinh 4
2.2 Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân và tác hại 4
2.2.1 Dư lượng kháng sinh 4
2.2.2 Nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh 5
2.2.3 Tác hại dư lượng kháng sinh 5
2.3 PHƯƠNG PHÁP ELISA 6
2.3.1 Khái niệm: 6
2.3.2 Phân loại: 7
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA 7
2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 7
2.3.5 Ứng dụng: 8
2.4 KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA 8
2.4.1.Kiểm Enrofloxacin bằng phương pháp Elisa 8
2.4.2 Kiểm Doxycyline bằng phương pháp Elisa 11
2.4.3.Kiểm Chloramphenicol bằng phương pháp Elisa 13
2.4.4 Kiểm Sulfonamide bằng phương pháp Elisa 16
2.4.5 Kiểm Nitrofuran AOZ bằng phương pháp Elisa 19
Trang 4LỜI MỞ ĐẦU
Trang 5CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THÔNG THUẬN 1.1 Thông tin về đơn vị thực tập
Công ty TNHH Thông Thuận được thành lập theo giấy chứng nhận đăng ký kinhdoanh số 004339/GP-TLDN do sở kế hoạch và đầu tư tỉnh Bình Thuận cấp ngày 11tháng 08 năm 1999
Tiền thân của Công ty TNHH Thông Thuận là một cơ sở sản xuất tôm giống hìnhthành từ năm 1990, do ông Trương Hữu Thông gầy dựng nên tại xã Vĩnh Hảo, huyệnTuy Phong, tỉnh Bình Thuận Trong tiến trình lịch sử đầy thăng trầm, công ty đã pháttriển ngày càng lớn mạnh và vững chắc cho đến hôm nay và đã khẳng định thế mạnhdẫn đầu cả nước trong ngành sản xuất tôm giống; nuôi tôm thương phẩm, chế biếnthủy sản xuất khẩu, sản xuất gạch tuynel và sản xuất muối công nghiệp
Hoạt động sản xuất Công ty bao gồm:
1) Sản xuất tôm giống Thông Thuận
2) Sản xuất tôm thương phẩm
3) Sản xuất gạch Tuynel
4) Chế biến thủy sản xuất khẩu
5) Nuôi bò giống thịt, bò sữa công nghệ cao
Công ty phát triển như ngày hôm nay phần lớn nhờ sự nổ lực không ngừng củangười sáng lập đầu tiên, Ông Trương Hữu Thông - Chủ tịch Hội Đồng Quản Trị kiêmTổng Giám đốc công ty và hơn 5.000 tập thể cán bộ, công nhân viên của các đơn vịtrong Tổng công ty Thông Thuận, cộng với sự đồng thuận của lãnh đạo các địaphương, các khách hàng trong và ngoài nước đã quan tâm ủng hộ
Sản xuất tôm giống chất lượng:
Công ty có 7 khu sản xuất tôm giống, với trên 100 trại giống hiện đại (đạt các chứngnhận GlobalGAP, ACC của châu Âu và Mỹ) Hàng năm, Công ty sản xuất và cungứng hơn 5 tỷ con giống đạt chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu và thổnhưỡng tại Việt Nam, sau nhiều năm tìm tòi và chọn lọc từ các nguồn tôm bố mẹ tốtnhất trên thế giới; Công tác sản xuất giống đều tuân thủ theo các quy trình nghiêm ngặt
và được thực hiện bởi đội ngũ công nhân lành nghề và cán bộ kỹ thuật trình độ cao,nhiều kinh nghiệm
Nuôi tôm thương phẩm:
Ngoài ra, Thông Thuận còn có các xí nghiệp tôm thương phẩm với số lượng farmnuôi lớn, đặt tại 4 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và Kiên Giang Đạt đượccác chứng chỉ GlobalGAP, ACC với sản lượng 10.000 - 12.000 tấn/năm Tôm thương
Trang 6phẩm của Công ty TNHH Thông Thuận luôn được nuôi và cho ăn theo quy trình côngnghệ vi sinh hiện đại, tuân thủ nghiêm ngặt theo các tiêu chuẩn chất lượng thực phẩmkhắt khe Với số lượng farm nuôi lớn trải dài dọc khắp miền Trung và Tây Nam bộ,hằng năm, Công ty cung cấp nguyên liệu cho hệ thống nhà máy chế biến của Công ty
và thị trường cả nước
Tôm thương phẩm của Thông Thuận luôn được thị trường đánh giá tốt về chấtlượng và độ an toàn Với các xí nghiệp tôm được đầu tư hiện đại, sản xuất hiệu quả:
Xí nghiệp nuôi tôm Ninh Hòa: với 30 ha diện tích nuôi và 30 ao nuôi Sản lượng hơn
400 tấn/ năm; Xí nghiệp nuôi tôm Cam Ranh: với 75 ha diện tích nuôi và 106 ao nuôi.Sản lượng 1.400 tấn/năm; Xí ngiệp nuôi tôm Phan Rang: với 16 ha diện tích nuôi và
16 ao nuôi Sản lượng 260 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Núi Tào: với 160 ha diện tíchnuôi và 170 ao nuôi Sản lượng 2.500 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Phước Thể: với 31
ha diện tích và 50 ao nuôi Sản lượng 650 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Kiên Giang:hiện đang nuôi với 300 ha diện tích tại 3 xí nghiệp nuôi như sau :
Xí nghiệp nuôi tôm số 1: 75 ha với 80 ao Sản lượng 1.000 tấn/năm
Xí nghiệp nuôi tôm số 2: 90 ha với 137 ao Sản lượng 1.500 tấn/năm
Xí nghiệp nuôi tôm số 3: 135 ha với 244 ao Sản lượng 2.500 tấn/năm Thông Thuận - Kiên Giang sẽ có diện tích nuôi lên đến 1.200 ha với 1.000 hanuôi tôm và 200 ha nuôi cá rô phi Sản lượng tôm lúc đó tại Kiên Giang sẽ tăng lên13.000 tấn tôm thương phẩm/năm
Chế biến, xuất khẩu sản phẩm thủy sản:
Với thế mạnh trong lĩnh vực nuôi tôm giống, tôm thương phẩm và nguồn nguyênliệu chủ động, chất lượng, Thông Thuận đã mạnh dạn đầu tư vào lĩnh vực chế biếnxuất khẩu thủy sản Đến nay, Công ty đã có hai nhà máy đang hoạt động với sản phẩmđầu ra đạt các tiêu chuẩn quốc tế, đáp ứng những yêu cầu khắt khe của nhiều thịtrường khó tính trên thế giới như EU, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Đông
Chi nhánh Công ty TNHH MTV Thông Thuận - Kiên Giang: hoạt động mạnhtrong lĩnh vực nuôi tôm thương phẩm Đạt được các chứng chỉ GlobalGAP 3 sao,ACC với sản lượng hơn 4.500 tấn/năm Hiện, Công ty đang đầu tư mở rộng farm nuôi
và nhà máy chế biến thủy sản Gồm 2 phân xưởng: Phân xưởng chế biến tôm xuấtkhẩu với sản lượng tới 7.000 - 8.000 tấn thành phẩm/năm và đang hoạt động rất hiệuquả Phân xưởng cá với sản lượng 7.500 - 8.000 tấn/năm, sẽ đi vào hoạt động năm
2015 với năng lực chế biến tới 20 triệu USD/năm Khi đi vào hoạt động sẽ tạo việc
Trang 7làm ổn định cho 3.000 lao động địa phương, đảm bảo đầu ra cho sản phẩm tại các farmnuôi của Thông Thuận.
Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận - Ninh Thuận: hoạt động trên lĩnh vựcsản xuất, chế biến thủy sản xuất khẩu Đạt được các chứng chỉ GlobalGAP 3 sao, ACC
3 sao, HACCP, IFS, HALA… hằng năm cung cấp ra thị trường sản lượng hơn 3.000tấn thành phẩm Doanh số 20 triệu USD/năm, tạo việc làm ổn định cho hơn 2.000 laođộng địa phương
Công ty CP Thủy sản Thông Thuận - Cam Ranh: hoạt động trên lĩnh vực sảnxuất chế biến thủy sản xuất khẩu Nhờ thế mạnh chủ động nguồn nguyên liệu, quytrình chế biến tuân thủ theo các chứng chỉ GlobalGAP, ACC 3 sao, HACCP, IFS,HALA Doanh số trên 30 triệu USD/năm
II KHÁNG SINH:
2.1.Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi sinhvật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìmhãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp
độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quátrình phát triển của vi khuẩn
2.2 Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân và tác hại
2.2.1 Dư lượng kháng sinh
Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh vẫn còn trong thực phẩm như thịt,tôm, cá, trứng, sữa, v.v… ở dạng nguyên chất hay đã chuyển hóa, vì thế có thể gâytác hại đối với người sử dụng
2.2.2 Nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh
Mô ̣t là, do một số bô ̣ phâ ̣n nhỏ người dân chưa nắm được danh mục hóa chất,kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng hoặc vì lợi nhuận kinh tế đã lạm dụng hóachất, kháng sinh trong phòng chống dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh, bán thâmcanh và không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch tôm.Hai là, do một số cơ sở thu mua, sơ chế, chế biến thực hiện chưa tốt hệ thốngquản lý chất lượng, chưa kiểm soát các mối nguy tới hạn tại các công đoạn sản xuất,kiểm soát chưa đầy đủ các loại hóa chất, kháng sinh trong khâu tiếp nhâ ̣n nguyên liê ̣uhoặc vô ý gây nhiễm trong quá trình sơ chế, chế biến
Trang 82.2.3 Tác hại của dư lượng kháng sinh
Tác hại đối với môi trường nuôi trồng thủy sản
Do mô ̣t số người dân còn lạm dụng hóa chất trong xử lý nước, cải tạo ao nuôi đãtiêu diệt cả vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, gây mất cân bằng hệ sinh thái trong môitrường nuôi; sử dụng kháng sinh không đúng cách trong nuôi tôm thâm canh, bán thâmcanh, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, gây nên hiện tượng lờn thuốc, khitôm có bệnh xảy ra sẽ rất khó điều trị
Tác hại đối với người tiêu dùng
Khi người tiêu dùng ăn phải sản phẩm thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe,gây ngộ độc, suy tủy, suy gan, suy thận, nếu tích tụ lâu ngày có thể dẫn đến ung thư,đột biến gen
Tác hại đối với quá trình xuất khẩu
Nếu các thị trường trên thế giới không nhập khẩu tôm nuôi của Việt Nam donhiễm dư lượng kháng sinh, khi đó thị trường trong nước sẽ không thể tiêu thụ hết sảnphẩm tôm nuôi trong dân, dẫn đến giá thành tôm nguyên liệu giảm mạnh, ảnh hưởngnghiêm trọng đến nền kinh tế của nước ta, đặc biệt đối với lĩnh vực thủy
Ưu điểm:
Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp Elisa là độ nhạy cao có thể phát hiệnđược phức hợp nhỏ,cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khimầm bệnh mới xâm nhiễm
Nhanh, thao tác đơn giản Rẻ tiền
Nhược điểm:
Độ chính xác không cao
2.3.2 Phân loại
Trang 9ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase), gồmcác phương pháp:
ELISA trực tiếp (direct ELISA)
ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
ELISA sandwich
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp ELISA
Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng
Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA
Giếng không lên màu hoặc không xuất hiện chuẩn: Thao tác thiếu bước, khôngtheo thứ tự, sử dụng sai hộp của Conjugate HRP, TMB bị hỏng
Mật độ quang thấp: thuốc thử hết hạn hoặc sử dụng chung với một số lô khác,pha nước rữa không chính xác, rữa nhầm bộ Kit, rữa quá nhiều, thời gian ủ ngắn, nhiệt
Trang 10 Bộ kit và hóa chất tùy theo mỗi phương pháp
2.4 KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA
Nguyên lý của phương pháp
Dựa trên cơ chế cạnh tranh miễn dịch giữa chất kháng sinh (Enrofloxacin,
Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) và cộng hợp
Conjugate đánh dấu lên kháng thể đặc hiệu Nồng độ (Enrofloxacin, Chloramphenicol,
Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) sẽ được hiển thị dựa trên mức độ phát
quang của Conjugate Do đó, chỉ cần căn cứ vào cường độ hiện màu của giếng thử là
có thể xác định được mẫu thủy sản có nhiễm (Enrofloxacin, Chloramphenicol,
Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) hay không và nhiễm với nồng độ bao
nhiêu Tất cả các quy trình từ đưa mẫu vào phân tích đến cho ra kết quả chỉ mất
30-90 phút, nhanh hơn rất nhiều so với các phương pháp khác
2.4.1 Kiểm Enrofloxacin bằng phương pháp ELISA
Hóa chất và cách pha chế:
- Microtiter plate: (12 x 8 well) 96 giếng
- Enrofloxacin Antibody #1: (1 x 14ml)
- 100X HRP Conjugate: (1 x 0.15ml)
* 99 Enrofloxacin Antibody #1 : 1 100X HRP Conjugate
- 10X Sample Extraction Buffer: (1 x 25ml) ở dạng cô đặc trước khi dùng phải được pha với nước cất
- 1ml 10X Sample Extraction Buffer : 9 nước cất
Trang 11Cân 1g mẫu cho vào 4ml methanol 70% (CH3OH)
Vortex 5 phút
Ly tâm 15 phút 7000 vòng
Hút 500 µl dịch trong bên trên cho và 500 µl 1X sample Extration (tỉ lệ 1:9) vào các
ống eppendorf đã đánh dấu số thứ tự mẫu
Lên giếng 50µl chuẩn cho vào 5 giếng
Hút 50 µl mẫu cho vào các giếng
Cho 100µl Conjugate cho vào tất cả các giếng
Ủ trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 – 250C)
Thuyết minh qui trình:
Lấy lượng mẫu thích hợp khoảng 200g đem nghiền ( đồng nhất mẫu ) bằng máynghiền mẫu ( mẫu chỉ lấy phần thịt tôm, loại bỏ đầu, vỏ, chỉ tôm…)
Ý nghĩa của việc lấy mẫu: Là khâu đầu tiên trong phân tích kiểm nghiệm, nhưng
có vai trò rất quan trọng, nếu lấy mẫu đúng nguyên tắc, sẽ đại diện cho lô hàng cầnkiểm tra, làm cho kết quả phân tích và kết luận về lô hàng chính xác và ngược lại
Trang 12Cân 1g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, hút 4ml Methanol 70%, trộnmẫu bằng máy vortex trong 5 phút.
Ly tâm ở 7000 vòng/phút, ly tâm 15 phút ở nhiệt độ phòng 250C
Hút 500µl lớp dịch trong bên trên và 500 µl 1X Sample Extration vào các ốngeppendorf đã danhd dấu số thứ tự mẫu
Phân tích:
Mẫu sau khi được pha loãng sẽ cho lên giếng phân tích, tất cả hóa chất và giếng
có trong Kit phải được để ở nhiệt độ phòng khoảng 2 giờ trước khi sử dụng Ghi nhãncác hóa chất, thứ tự các chuẩn, mẫu tránh nhầm lẫn
Lấy đủ các giếng cần thiết để lên giếng
Cho 50µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) Enrofloxacin có các nồng độ … vào cácgiếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng bắt đầu từ nồng độ thấp đến nồng độ cao Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích cho vào giếng tiếp theo
Hút 100µl dung dịch Conjugate cho vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cáchxoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây
Ủ 30 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-250C)
Rửa sạch các giếng 3 lần với 250µl dung dịch đệm rửa đã pha loãng ( WashBuffer) Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm vàđập nhẹ, thực hiện bước tiếp theo ngay lập tức, tránh để các giếng khô giữa các bướcthực hiện
Thêm 100µl dung dịch One Shot Substrate vào tất cả các giếng, lắt nhẹ trong vàigiây
Ủ 20 phút trong bóng tối, ở nhiệt độ phòng
Thêm 100µl Stop solution vào lắt nhẹ vài giây
Đọc kết quả
2.4.2 Kiểm Doxycyline bằng phương pháp ELISA
Hóa chất và cách pha chế
- Oxytetracyline Microtiter plate: (12 x 8 well) 96 giếng
- 6 chai Oxytetracyline Standards (6 x 1.2ml): sẵn để dùng
- 1 chai Oxytetracyline Antibody (1 x 6ml): sẵn để dùng
- 1 chai 5X Oxytet Extraction Buffer (2 x 25ml): đậm đặc 5 lần
Trang 13* Pha 1 thể tích 5X Oxytet Extraction Buffer : 4 thể tích nước cất
- 1 chai 10X Tet Sample Diluent (1 x 28ml): đậm đặc 10 lần
* Pha 1 thể tích 10X Tet Sample Diluent : 9 thể tích nước cất
- 1 chai 20X Wash Solution (1 x 28ml): pha khoảng 20 lần
* Pha 1 thể tích 100 20X Wash Solution : 19 thể tích nước cất
- 1 chai Stop Buffer (1 x 20ml): sẵn để dùng
- 1 chai TMB Substrate (1 x 12ml): sẵn để dùng
Cách tiến hành:
Cân 1g mẫu cho vào 3ml 1X Oxy tet Extration
Vortex 10 phút , ly tâm 10 phút 5000 vòng
Hút 60µl mẫu và 820µl 1X Sample Diluent, 20 µl Balance vào các ống eppendorf đã
đánh dấu số thứ tự mẫu, vortex trong 1 phút
Hút 75 µl chất chuẩn cho vào 5 giếng, 75µl mẫu vào giếng các giếng còn lại
Cho 100 µl Antibody vào các giếng mẫu và chuẩn
Thuyết minh qui trình:
Cân 1g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 3ml 1X OXYTETExtraction Buffer bằng máy vortex trong 3 phút