Phân lập một số hợp chất từ dịch chiết Methanol của cành cây máu chó đá Knema Saxtilis de wilde và đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THANH HOA PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THANH HOA

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ

KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC

DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THANH HOA

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ

KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC

DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Lê Nguyễn Thành

2 TS Nguyễn Quỳnh Chi

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cho luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ

tận tình của rất nhiều tập thể và các cá nhân

Xin cảm ơn “Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia” và GS.TS Nguyễn

Văn Hùng chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

một số loài chi Knema và Horsfieldia (Myristicaceae)” mã số 104.01-2017.47, đã cung

cấp kinh phí để thực hiện đề tài này

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS

Lê Nguyễn Thành – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam và TS Nguyễn Quỳnh Chi – Bộ môn Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội đã giao

đề tài và quan tâm tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Nguyễn Thành, ThS Trần Hữu Giáp cùng

với các cán bộ Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển – Viện

hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo tôi

trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học

Dược Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại cho tôi những kiến thức và

kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn

ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thành luận

văn Do những hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn không tránh được

những thiếu sót nên rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô để tôi có thể bổ

sung, hoàn thiện kiến thức phục vụ cho các công việc sau này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Học viên Trần Thanh Hoa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về họ Myristicaceae (Nhục đậu khấu) 3

1.2 Tổng quan về chi Knema (Máu chó) 3

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Knema 3

1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Knema (Máu chó) 4

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Knema 5

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Knema 15

1.3 Giới thiệu về cây Máu chó đá (Knema saxatilis) 19

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Máu chó đá (Knema saxatilis) 19

1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Máu chó đá (Knema saxatilis) 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Phương tiện nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 22

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro 24

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập 26

3.1.1 Chiết xuất 26

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập 29

3.1.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập 32

3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập 42

Chương 4: BÀN LUẬN 44

4.1 Về thành phần hóa học 44

4.2 Về tác dụng sinh học 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CÁC TỪ

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

alveolar basal epithelial cell line Dòng tế bào ung thƣ phổi ATCC The American Type Culture

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit

DPPH Diphenyl picril hydrazilhydrate Diphenyl picril hydrazilhydrat

ED50 50% effective dose Liều có hiệu quả 50%

ESI-MS Electrospray Lonization- Mass

HT-29 Human colon cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ đại tràng HO-8910 Cellosaurus cell line Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng

KB Epidermoid carcinoma of cavity Dòng tế bào ung thƣ biểu mô

IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế ở 50%

MCF-7 Human breast carcinoma Dòng tế bào ung thƣ vú

MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom

MDA-MB-231 Breast cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ vú

NCI-H187 Small cell lung

carcinoma

Dòng tế bào ung thƣ phổi tế bào nhỏ

OVCAR-3 Ovarian cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hoạt tính các chất phân lập từ Knema glomerata

Bảng 1.2 Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của các hợp chất từ Knema

Bảng 3.4 Số liệu phổ của hợp chất CDM 10 và tài liệu tham khảo [10], [16]

Bảng 3.5 Số liệu phổ của hợp chất CDM 4 và tài liệu tham khảo [18]

Bảng 3.6 Số liệu phổ của hợp chất CDM 6 và tài liệu tham khảo [39]

Bảng 3.7 Số liệu phổ của hợp chất CDM 7 và tài liệu tham khảo

Bảng 3.8 Số liệu phổ của hợp chất CDM 13 và tài liệu tham khảo [34]

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro với hai dòng tế bào ung

thư người của năm hợp chất phân lập

Hình 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập được từ chi Knema

Hình 1.2 Các hợp chất alk(en)yl phenol phân lập được từ chi Knema

Hình 1.3 Các hợp chất acid anacardic phân lập được từ chi Knema

Hình 1.4 Các hợp chất lignan phân lập được từ chi Knema

Hình 1.5 Các hợp chất terpen phân lập được từ chi Knema

Hình 1.6 Các hợp chất phân lập từ loài Knema pachycarpa tại Việt Nam

Hình 1.7 Một số hình ảnh về cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

Hình 3.1 Sắc ký đồ của chất CDM 10, CDM 13 sau khi hiện màu bằng thuốc thử cerisulfat

Hình 3.2 Sắc ký đồ của chất CDM 4 sau khi hiện màu bằng thuốc thử cerisulfat

Hình 3.3 Sắc ký đồ của các chất CDM 6, CDM 7 sau khi hiện màu bằng thuốc thử cerisulfat

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cành cây Máu chó đá

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cắn chiết methanol

26

28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, nguồn tài nguyên cây cỏ là cơ sở quan trọng để sàng lọc và tìm ra thuốc mới Nhiều hoạt chất tách chiết từ dược liệu đã được nghiên cứu xác định cấu trúc và tác dụng dược lý Kết hợp với công nghệ bào chế hiện đại nhiều dược phẩm

mang giá trị cao đã được ra đời như viên nang cao Bạch quả (Ginkgo biloba), viên

chứa dịch chiết tỏi có hoạt chất chính là allicin (Allimax), viên nén cao Cúc gai dài

(Cardus marianus) chứa hoạt chất chính là silymarin (Cigenol) Bên cạnh đó, nhiều

hoạt chất từ dược liệu được tinh chế đạt đến độ tinh khiết có thể sử dụng làm nguyên

liệu bào chế thuốc tiêm như paclitaxel từ loài Taxus revifolia (Taxol, Mĩ); vinblastin từ loài Vinca rosea (Velban, Pháp), artemisinin từ loài Artemisia annua (tạo dẫn chất

artemether, dạng tiêm bắp) Tất cả những điều trên đã nói lên tiềm năng to lớn chưa được khai phá hết của nguồn tài nguyên dược liệu, đặc biệt với một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi cho thảm thực vật đa dạng phát triển như Việt Nam

Chi Máu chó (Knema) thuộc họ Nhục đầu khấu Myristicaceae là loài cây xanh

quanh năm có ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Việt Nam [53] Ở Việt Nam đã tìm thấy khoảng 13 loài thuộc chi Máu chó phân bố ở các tỉnh Bắc Trung

Bộ, Nam Bộ Tên gọi Máu chó xuất phát từ đặc điểm chung của các loài này là thân

cây có nhựa tiết ra màu đỏ Nhiều loài thuộc chi Knema được sử dụng trong y học cổ

truyền làm thuốc chữa ghẻ, mụn nhọt Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, chi

Knema có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng vi-rút, kháng lao, chống

ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, độc tế bào và tác dụng ức chế acetylcholinesterase [42]

Cây Máu chó đá có tên khoa học Knema saxatilis de Wilde là một loài đặc hữu

của Việt Nam phân bố ở các tỉnh miền Trung và vẫn chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học [53] Quá trình sàng lọc cho thấy dịch chiết của cây có tác dụng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thư tuyến thượng

dịch chiết methanol của cành cây Máu chó đá (Knema saxatilis de Wilde) và đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro” đƣợc thực hiện, với mục tiêu:

1 Phân lập 3-5 hợp chất từ dịch chiết methanol của cành cây Máu chó đá và xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập đƣợc

2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập đƣợc

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về họ Myristicaceae (Nhục đậu khấu)

Họ Myristicaceae (Nhục đậu khấu) là một họ thực vật có hoa nằm trong bộ Magnoliidae Họ này gồm 20 chi và gần 500 loài phân bố ở khắp các vùng nhiệt đới

[20] Trong đó các chi được biết đến nhiều nhất là Myristica, Horsfieldia,

Gymnacranthera, Knema Các loài thuộc họ Myristicaceae thường sống chủ yếu trong

các rừng mưa nhiệt đới

Về đặc điểm thực vật của họ Myristicaceae: Hầu hết những loài thuộc họ Myristicaceae là cây thân bụi hoặc thân gỗ Vỏ cây có màu nâu hoặc đỏ Lá mọc đơn

lẻ, không xẻ thùy, so le, có mùi thơm, màu xanh đen, gân hình lông chim, không có lá mầm Hoa nhỏ, đơn tính, mọc ở nách thành chùm, lá bắc rụng sớm và phát ra mùi hăng Thùy 3-5, nhị 2-40, bao phấn có 2 ngăn, nhụy hoa không cuống có 1 ngăn, 1 noãn ngược, vòi nhụy ngắn hoặc không có Quả có lông, vỏ dày nhiều nhựa và chứa một hạt Quả thường lớn, khi chín nứt theo chiều dọc một cách tự nhiên thành 2 mảnh [20]

Về ứng dụng của các cây thuộc họ Myristicaceae: Từ xa xưa, con người trên khắp thế giới đã biết sử dụng các loài cây thuộc họ Myristicaceae làm thức ăn, hương

liệu gia vị và đặc biệt là làm thuốc chữa bệnh Ví dụ như loài Myristica fragrans (Nhục

đậu khấu) là một vị thuốc dùng để kích thích tiêu hóa, dùng trong các trường hợp kém

ăn, sốt rét Loài Knema corticosa, Horsfieldia amygdalina có hạt được dùng làm thuốc

chữa bệnh ghẻ [1]

1.2 Tổng quan về chi Knema (Máu chó)

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Knema

Chi Knema thuộc họ Nhục đậu khấu (Myristicaceae), bộ Ngọc lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Theo khung phân loại ngành Ngọc Lan, vị trí phân loại của chi Knema được thể

Họ Nhục đậu khấu: Myristicaceae

Chi Máu chó: Knema

1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Knema (Máu chó)

Bên cạnh các chi Myristica, Horsfieldia, Gymnacranthera thì còn có chi Knema

(Máu chó) cũng là một trong bốn chi thuộc họ Myristicaceae ở Châu Á [53] Chi

Knema có khoảng 85 loài khác nhau [20] Ở Việt Nam chi Knema gồm 13 loài:

Knema erratica Sincl (Máu chó lưu linh)

Knema globularia Warb (Máu chó cầu)

Knema elegans Warb (Máu chó thanh)

Knema lenta Warb (Máu chó thấu kính)

Knema mixta de Wilde (Máu chó trộn)

Knema pachycarpa de Wilde (Máu chó trái dày)

Knema petelotii Merr (Máu chó Petelot)

Knema pierrei Warb (Máu chó Pierre)

Knema poilanei de Wilde (Máu chó Poilane)

Knema saxatilis de Wilde (Máu chó đá)

Knema sessiliflora de Wilde (Máu chó hoa không cọng)

Knema squamulosa de Wilde (Máu chó vảy nhỏ)

Knema tonkinensis de Wilde (Máu chó Bắc bộ) [4]

Mô tả thực vật: Cây to có thể cao tới hơn 10 m Cành non có lông tơ màu hung

đỏ Lá mọc so le, phiến lá mỏng, mặt lá thường có phấn và lông tơ, gân lông chim

Cụm hoa ngắn, không nhánh hoặc chia hai nhánh, hoa mọc thành chùm dày hoặc tán,

lá bắc rụng sớm Hoa khác gốc, hoa đực thường khá to, hình chuông, cuống dài Quả

có lớp lông măng dày, khi chín nứt thành hai mảnh, có một hạt, bao bởi lớp áo hạt còn nguyên hoặc bị rách [20]

Phân bố: Chi Knema được tìm thấy ở rừng nhiệt đới các nước Đông Nam Á

(Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Singapo), Trung Quốc, Ấn Độ [53] Ở nước ta, chi Máu chó mọc hoang ở khắp miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, miền Trung và miền Nam [4]

Thu hái và chế biến: Thời điểm thu hoạch hạt vào tháng 9-10 Người ta dùng nguyên cả hạt máu chó hay ép lấy dầu dùng [1]

Công dụng: Hạt máu chó được dùng làm thuốc chữa ghẻ Trước đây người làng Tiên Hội (Bắc Ninh) đã dùng hạt để sản xuất một loại thuốc chữa ghẻ nổi tiếng gọi là thuốc ghẻ Tiên Hội [1]

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Knema

1.2.3.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema trên thế giới

Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Knema cho thấy có sự đa dạng hợp chất

tự nhiên như acetophenon, các dẫn chất terpen, lignan, flavonoid, alkyl/acyl resorcinol

và các dẫn xuất phenylalkylphenol [42]

 Hợp chất flavonoid

Flavonoid là một loại hợp chất được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, có nhiều hoạt tính sinh học: chống vi-rút/vi khuẩn, chống viêm, tim mạch, chống đái tháo đường, chống ung thư, chống lão hóa, từ lâu đã nhận được rất nhiều sự chú ý nghiên cứu [23]

Năm 1993, từ thân cây của loài Knema austrosiamensis, Gonzalez và cộng sự đã

phân lập được hợp chất (±)-7,4’-dihydroxy-3’-methoxyflavan (1) [43] (Hình 1.1)

Năm 1994, các hợp chất nhóm flavonoid như formononetin (2),

8-O-methylretusin (3), biochanin A (6) từ vỏ thân cây Knema glomerata đã được phân lập

[38] (Hình 1.1)

Năm 2005, các nhà khoa học đã phân lập được hai flavan từ cây Knema elegans,

đó là (+)-myristinin A (4) và D (5) [11] (Hình 1.1)

Năm 2009, nhóm tác giả người Thái Lan và Nhật Bản đã công bố 10 hợp chất từ

loài Knema glauca, trong đó một hợp chất flavan myristinin D (5) Ngoài ra từ lá và vỏ

của cây, còn phân lập được hợp chất myristinin A (4) và methoxyflavan (1) [27] (Hình 1.1)

(±)-7,4'-dihydroxy-3'-Các nhà khoa học này cũng phân lập từ vỏ cây Knema furfuracea được một

isoflavon đó là biochanin A (6) [28] (Hình 1.1)

Năm 2000, từ loài Knema globularia, Wenly và cộng sự đã phân lập được hai

hợp chất kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid (7), quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid (8) [35] Hai năm sau đó, họ phân lập được (+)-taxifolin (9), luteolin (10), catechin (11), sulfuretin (12) [21] (Hình 1.1)

Năm 2015, từ loài Knema laurina, Ismail và cộng sự phân lập được năm hợp

chất flavonoid: (±)-7,4'-dihydroxy-3'-methoxyflavan (1), luteolin (10), catechin (11), (13), (14) [17] Mười năm trước, Gonzalez và cộng sự đã phân lập được 7-hydroxy- 3′,4′-methylenedioxyflavan (15) [15] (Hình 1.1)

 Hợp chất alk(en)yl phenol

Năm 1990, nhóm nghiên cứu của Gonzalez công bố thành phần hóa học có

trong vỏ thân ba loài Knema thu thập tại Thái Lan: Knema elegans, Knema furfuraceae

và Knema tunuinervia, trong đó có ba cardanol (16-18), một acetophenon (19) [41]

[47] (Hình 1.2)

Năm 1993, Zahir và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất phenylacylphenol

mới từ lá cây Máu chó lá to Knema furfuracea đó là knerachelin A (20) và B (21) [37]

(Hình 1.2)

Năm 1994, từ vỏ thân cây Knema glomerata đã phân lập được một hợp chất

phenylalkylphenol mới: kneglomeratanol (22), hai hợp chất acetophenon mới: kneglomeratanon A (23) và B (24), cùng với năm hợp chất đã biết: 5- pentadecylresorcinol (25); 3-(10'-phenyldecy1)-phenol (26); 5-(10'-phenyldecyl)

resorcinol (27); 5-(12'-phenyldodecyl)-resorcinol (28);

2,4-dihydroxy-6-(10'-phenyldecyl) acetophenon (19) [38] (Hình 1.2)

Năm 2000, hai hợp chất phenol từ Knema hookeriana đã được phân lập bởi

Alen và cộng sự: undecylphenol (29) và 3-(8z-tridecenyl)-phenol (30) [7] (Hình 1.2)

Năm 2009, nhóm tác giả người Thái Lan và Nhật Bản đã công bố các hợp chất

từ loài Knema glauca là malabaricon A (31), dodecanoylphloroglucinol (32) và (33)

[27] (Hình 1.2)

Năm 2011, từ vỏ cành của Knema laurina, một nhóm khoa học Malaysia đã

phân lập được dẫn xuất cardanol: 3-pentadec-10-(Z)-enylphenol (34) và (Z)-enylphenol (35) [6] (Hình 1.2)

Năm 2015, từ lá của cây Knema stellata, Ragasa và cộng sự đã phân lập được

các hợp chất: (heptadec-8-enyl) phenol (36), (pentadec-8-enyl) phenol (37) và pentadecyl phenol (38) [48] (Hình 1.2)

Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Sriphana đã công bố các hợp chất từ rễ của

Knema globularia, bao gồm hai diaryloctan mới, acid kneglobularic A (39) và B (40);

một dẫn xuất acetophenon mới, kneglobularon A (41) và các hợp chất đã biết: 3- phenyldodecyl)-phenol (16), 3-undecylphenol (29) và kneglomeratanon A (23) [49]

(12-(Hình 1.2)

 Hợp chất acid anacardic

Năm 1980, các nhà khoa học công bố hai dãy chất acid alk(en)yl anacardic (44,

45, 46-50) và acid phenylalkyl anacardic (42, 43) được phân lập từ hạt của cây máu

chó Knema elegans [32] (Hình 1.3)

Knema elegans, Knema furfuraceae và Knema tunuinervia là 3 loài Knema được

Gonzalez và cộng sự thu thập ở Thái Lan, qua quá trình nghiên cứu họ đã công bố thành phần hóa học có trong vỏ thân của ba loài này trong đó có một acid anacardic

(42) [49-50] (Hình 1.3)

Từ vỏ cây Knema furfuracea, nhóm tác giả người Thái Lan và Nhật Bản đã

phân lập được acid 2-hydroxy-6-(12-phenyldodecen-8′-Z-yl)-benzoic (51) [28] (Hình

1.3)

Năm 2011, một nhóm tác giả người Malaysia đã phân lập được các acid

anacardic từ vỏ cành của Knema laurina (49, 50, 52) [6] (Hình 1.3)

Ragasa và cộng sự đã phân lập được hai acid anacardic từ lá cây Knema stellata

là acid 2-[(Z)-heptadec-8-enyl]-6-hydroxybenzoic (53) và acid enyl]-6-hydroxybenzoic (54) [48] (Hình 1.3)

Năm 2016, từ loài cây Knema hookeriana, các nhà khoa học đã phân lập được

ba dẫn xuất của acid anacardic (55 - 57) [14] (Hình 1.3)

Hình 1.3 Các hợp chất acid anacardic phân lập đƣợc từ chi Knema

 Hợp chất lignan

Năm 1978, Joshi Viswanathan và cộng sự đã phân lập đƣợc một hợp chất lignan

mới từ cành cây Knema attenuata là attenuol (58) Hợp chất này có cấu hình tuyệt đối

là 2S, 3R-dimethyl-1S-(p-hydroxyphenyl)-6,7-methylenedioxytetralin [44] (Hình 1.4)

Vào năm 2009, Rangkaew và cộng sự đã công bố đƣợc hai hợp chất lignan từ

loài Knema glauca là sesamin (59) và asarinin (60) [27] (Hình 1.4)

Máu chó lá to (Knema furfuracea) là loài cây đƣợc tìm ở bán đảo Malaysia,

Singapo và Thái Lan Từ lá cây loài này, một nhóm tác giả Thái Lan và Nhật Bản đã

phân lập đƣợc furfuracin (61) và (+)-trans-1,2-dihydrodehydroguaiaretic (62) [28]

(Hình 1.4)

Hình 1.4 Các hợp chất lignan phân lập đƣợc từ chi Knema

 Hợp chất terpen

Từ quả của loài Knema glauca, Rangkaew và cộng sự đã phân lập đƣợc một

chất acid acyclic diterpen mới đƣợc đặt tên là acid glaucaic (63) [27] (Hình 1.5)

Gần đây, một hợp chất sesquiterpen mới là 3β, 6β, 8α,

10β-tetramethylwiddran-2(3)-en-10α-ol (64) đƣợc phân lập từ dịch chiết vỏ thân Knema patentinervia [50]

(Hình 1.5)

Hình 1.5 Các hợp chất terpen phân lập đƣợc từ chi Knema

1.2.3.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema tại Việt Nam

Năm 2017, nhóm nghiên cứu của TS Lê Nguyễn Thành đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học cây máu chó trái dày Từ quả của cây đã phân lập đƣợc các

hợp chất lignans gồm pinoresinol (65), epipinoresinol (66), piperitol (67), pluviatilol (68) [51] (Hình 1.6)

Từ vỏ cây máu chó trái dày (Knema pachycarpa de Wilde) đã phân lập và xác

định cấu trúc của ba hợp chất: 7-hydroxy-3',4'-methylendioxidflavan (69), 7,4'-dihydroxy-3'-methoxyflavan (1) và acid lignoceric (71) Đây là công bố đầu tiên

(2S)-về các hợp chất phân lập từ vỏ cây máu chó trái dày Hai hợp chất

(2S)-7-hydroxy-3',4'-methylendioxidflavan (69) và acid lignoceric (71) lần đầu tiên đƣợc phân lập từ

chi Máu chó (Knema) [5] (Hình 1.6)

Hình 1.6 Các hợp chất phân lập từ loài Knema pachycarpa tại Việt Nam

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Knema

Qua các nghiên cứu trên thế giới về chi Knema cho thấy các loài thuộc chi này

có nhiều hoạt tính sinh học phong phú như chống ung thư, kháng khuẩn, kháng lao, chống oxy hóa, ức chế enzym acetylcholinesterase, chống tiểu đường [42]

 Hoạt tính chống ung thư

Trong các hợp chất đã được nghiên cứu, hợp chất có hoạt tính chống ung thư chủ yếu là các hợp chất alkyl/alken phenol và flavonoid

Furfuracin (61) được phân lập từ lá cây của loài Knema furfuracea, thể hiện khả

năng gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư được thử nghiệm: tế bào ung thư biểu

mô KB, tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi tế bào nhỏ NCI-H187 Từ vỏ cây

Knema furfuracea, hợp chất acid (+)-trans-1,2-dihydrodehydroguaiaretic thể hiện hoạt

tính gây độc trên dòng tế bào KB (62) (IC50 17,7 μg/mL); hợp chất biochanin A (6) thể

hiện hoạt tính diệt tế bào trên dòng NCI-H187 (IC50 19,0 μg/mL) [28]

Các hợp chất có trong rễ của Knema globularia được công bố năm 2016: acid

kneglobularic A (39); acid kneglobularic B (40); kneglobularon A (41) và các hợp chất (16, 29, 23) có khả năng gây độc với tế bào NCI-H187 với IC50 từ 8,23 tới 13,07 μg/mL [49]

Kneglomeratanol (22), kneglomeratanon A (23) và B (24), cùng với các hợp chất: 5-pentadecylresorcinol (25); 3-(10'-phenyldecy1) phenol (26); 5-(10'- phenyldecyl) resorcinol (27); 5-(12'-phenyldodecyl) resorcinol (28); formononetin (2),

8-O-methylretusin (3); biochanin A (6), 2,4-dihydroxy-6-(10'-phenyldecyl)

acetophenon (19), đã được phân lập từ vỏ thân Knema glomerata, thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào trung bình đối với ba dòng tế bào ung thư trên người (A-549, MCF-7, HT-29) [38]

Bảng 1.1 Hoạt tính các chất phân lập từ Knema glomerata [38]

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết chloroform của áo hạt và dịch chiết hexan của

nhân hạt Knema attenuata có tác dụng kháng khuẩn cao nhất với dòng vi khuẩn

Staphylococus aureus với giá trị MIC (mg/ml) tương ứng là 12,563 và 12,541; có tác

dụng chống nấm trung bình với loài Candida albicans [52]

Knerachelin A (20) và B (21) từ lá của cây Knema furfuraceae có tác dụng

kháng khuẩn Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae với giá trị MIC

tương ứng là 8,0 và 4,0 μg/mL [37]

 Hoạt tính kháng lao

Các hợp chất acylphenol (31, 32, 33) phân lập từ loài Knema glauca thể hiện

hoạt tính kháng lao với dòng Mycobacterium tuberculosis với giá trị MIC lần lượt là

25, 50 và 100 µg/mL [27]

 Hoạt tính chống oxy hóa

Dịch chiết chloroform từ quả của loài Knema attenuata có khả năng quét gốc tự

do diphenyl picril hydrazilhydrat (DPPH) và H2O2 Ngoài ra dịch chiết này cũng cho thấy nồng độ tối đa của các phenolic và flavonoid lần lượt là 96,1 mg/g và 64,2 mg/g [52]

Dịch chiết methanol của Knema laurina cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa,

cho giá trị peroxit là 158,0 peroxid/1 kg mẫu

và tự điều chỉnh qua liên kết π-π, liên kết hydro và tương tác kỵ nước [6]

Bảng 1.2 Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của các hợp chất từ

Ở Việt Nam, qua quá trình sàng lọc hoạt tính sinh học của các loài thực vật, một

số loài bản địa chi Knema thể hiện hoạt tính chống ung thư và ức chế sự hoạt động của

enzym acetylcholinesterase liên quan đến bệnh alzheimer Các dịch chiết methanol

Wilde) có tác dụng ức chế 100% ở nồng độ 10 µg/mL sự hoạt động của enzym acetylcholinesterase Các dịch chiết này cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng

tế bào ung thư biểu mô KB với khả năng ức chế 40-60% ở nồng độ 1 µg/mL

 Hoạt tính khác

Hợp chất acylphenol (32) thể hiện hoạt tính kháng vi-rút mạnh trên vi-rút herpes

simplex loại 1 (HSV1) có giá trị IC50 là 3,5 µg/ml [28]

Hợp chất malabaricon A (31) cũng thể hiện khả năng chống sốt rét đối với ký

sinh trùng Plasmodium falciparum với giá trị IC50 là 2,78 µg/ml [27]

Dịch chiết dichlomethan từ lá của loài Knema glauca có tác dụng giảm đường

huyết sau ăn do ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase [45]

1.3 Giới thiệu về cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

Cây Máu chó đá có tên khoa học Knema saxatilis de Wilde thuộc họ Nhục đậu khấu (Myristicaceae), bộ Ngọc lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida),

ngành Ngọc lan (magnoliophyta), là một cây đặc hữu của Việt Nam [53]

Giới thực vật: Plantae

Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida

Bộ Ngọc lan: Magnoliales

Họ Nhục đậu khấu: Myristicaceae

Chi Máu chó: Knema Loài Máu chó đá: Knema saxatilis

1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

Hình 1.7 Một số hình ảnh về cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

Mô tả thực vật: Cây đại mộc 5-15 m, gỗ vàng vàng, nhiều nhánh có lông sát, dày, màu socola, vỏ nhăn dọc Lá tròn dài, to 10 – 22 x 2 – 4 cm, hai đầu tà, dai, mặt trên nâu lục, mặt dưới cà phê sữa mốc mốc, gân nâu, 15 -22 cặp, cuống 1,2-1,5 cm Hoa đực có cọng 5 – 8 mm, đĩa tiểu nhụy mang 9 – 10 bao phấn Trái màu nâu dợt, xoan, dài vào 3 cm, có lông mịn sát, trên cọng 1 – 4 mm [4]

Phân bố: Rừng nhiệt đới ở độ cao 900 – 1500 m: Hải Vân, Bà Nà, Quảng Nam

Hiện nay chƣa có một nghiên cứu nào công bố về thành phần hóa học của cành

cây Máu chó đá (Knema saxatilis)

Về hoạt tính sinh học, dịch chiết từ cây Máu chó đá (Knema saxatilis) có tác

dụng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ tuyến thƣợng thận SW13 ở nồng độ 5 µg/ml Kết quả này từ một sàng lọc trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của một số loài chi Knema và Horsfieldia (Myristicaceae)”

của Viện hóa sinh biển hợp tác với Pháp [3]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cành cây máu chó đá được thu hái tại Hướng Hóa - Quảng Trị vào tháng 7/2006 Mẫu cây đã được TS Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt nam)

giám định tên khoa học là Knema saxatilis de Wilde, họ Nhục đậu khấu

(Myristicaceae) Mẫu tiêu bản (VN-1672) được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Cành cây sau khi thu hái được chặt nhỏ, phơi khô và xay nhỏ

2.2 Phương tiện nghiên cứu

Trang thiết bị

Chiết xuất và phân lập:

- Dụng cụ thủy tinh: bình chiết, bình nón, cốc thủy tinh các loại, phễu, ống

nghiệm, pipet định mức, ống đong, bình cầu, cột sắc ký, ống mao quản, bình chạy sắc ký bản mỏng chuyên dụng

- Bản mỏng silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn

- Bột silica gel pha thường cỡ hạt 40 - 63μm

- Gel Sephadex LH-20

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

- Bơm hút chân không DIVAC1.21 (Mỹ)

- Máy cất quay Buchi R – 210 (Thụy Sỹ)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,13C-NMR, DEPT) được đo trên máy Bruker Avance 500 MHz hãng Sigma-Aldrich

- Phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên hệ thống sắc kí lỏng ghép khối phổ

LC/MS Agilent 1260, sử dụng phương pháp phun mù điện tử

Thử hoạt tính gây độc tế bào:

- Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc)

- Micropipet, pipet đa kênh, đầu tip pipet (Isolab, Đức)

- Buồng đếm tế bào (Fisher Hoa Kỳ)

- Tủ ủ CO2 (MMM Group, Germany)

- Kính hiển vi ngược (Zeizz), máy quang phổ (Genios, Tecan)

- Máy đọc ELISA (ELISA Bio-Rad machine, Mỹ)

Dung môi, hóa chất

Chiết xuất và phân lập:

Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập gồm: n-hexan, ethyl acetat, ethanol, methanol, dichloro methan đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Dung môi đo phổ: CDCl3, MeOD

Thuốc thử: Cerisulfat

Thử hoạt tính gây độc tế bào:

DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium) (Gibco, Mỹ)

RPMI 1640 (Roswell park memorial institute) (Gibco, Mỹ)

FBS (Fetal bovine serum) (Gibco, Mỹ)

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid)

(DUCHEFA biochemie, Hà Lan)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

 Phân lập các chất

- Sử dụng phương pháp sắc ký cột/sắc ký lớp mỏng điều chế Theo dõi quá trình phân lập bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt Hỗn dịch silica gel được đổ

từ từ lên cột, vừa đổ, vừa gõ nhẹ vào thành cột để silica gel được nén đều,

mở khóa cột tối đa

 Ổn định cột: Sau khi đưa hết silica gel lên cột, tiếp tục gõ nhẹ, đều và đối xứng xung quanh thân cột tới khi trong cột không còn bọt khí, mặt thoáng phẳng và lớp silica gel lắng xuống đã ổn định Tiếp tục cho dung môi chảy qua cột khoảng 2 giờ, thì khóa cột lại

 Nạp mẫu lên cột: Cắn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến tan hoàn toàn sau đó trộn đều với một lượng tối thiểu silica gel (0,5-1 lần lượng cắn), rồi cất quay chân không để thu được bột Sau đó đưa mẫu lên cột sắc ký, tiến hành rửa giải

 Dung môi rửa giải: Sử dụng hỗn hợp dung môi thích hợp, dung môi phân cực cao (nước, ethanol, methanol); dung môi phân cực trung bình (ethyl acetat, dichloromethan); dung môi kém phân cực hoặc không phân cực (n-hexan, ether dầu hỏa)

 Phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký

Dịch thu được trong quá trình rửa giải được hứng vào lọ thí nghiệm tương ứng Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng

dung môi Phát hiện vết bằng cách quan sát dưới đèn UV bước sóng 254

nm, hiện màu bằng thuốc thử CeSO4

- Tiến hành phân lập các phân đoạn nhỏ sử dụng các phương pháp sắc ký trên silica gel, sephadex, sắc ký bản mỏng điều chế

 Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập

Sử dụng sắc ký lớp mỏng (sử dụng các hệ dung môi khác nhau)

 Nhận dạng các hợp chất tinh khiết phân lập được

Sau khi phân lập được hoạt chất tinh khiết, cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro

Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT

(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) [46] Thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện hóa học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Nguyên lý: Phương pháp MTT là một phương pháp so màu MTT tham gia

phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào sống và tạo thành các formazan dạng tinh thể Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và vừa hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 540nm

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu các hợp chất tinh khiết được pha thành dung dịch gốc

với nồng độ 100 mM trong DMSO, pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml

Chuẩn bị các dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi

ATCC gồm: LU (Human lung carcinoma) – tế bào ung thư phổi, MCF-7 (Human

breast carcinoma) – tế bào ung thư vú Các dòng tế bào nuôi cấy trong môi trường phù

hợp, có bổ sung huyết thanh bò 10% (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối) Tùy vào từng đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Các bước tiến hành: 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM hoặc RPMI 1640 cho các dòng tế bào LU, MCF-7 Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml Ủ 37o, 5% CO2 3 ngày

Chứng trắng là 200 µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml

Chứng âm là dung dịch DMSO 0,1%

Chứng dương là Ellipticin (Sigma)

Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml ở 37oC trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót

Tính kết quả: Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính dựa trên số

liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập

3.1.1 Chiết xuất

Mẫu cành cây Máu chó đá xay nhỏ (1,12 kg) được ngâm chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, ethyl acetat và MeOH (mỗi dung môi 3 lít x 3 lần trong 24 h) Dịch chiết được gộp và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn chiết tương ứng n-hexan (5g), ethyl acetat (10 g) và MeOH (53 g)

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cành cây Máu chó đá

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ dịch chiết methanol

Chạy cột tổng silica gel cắn MeOH (53g): Cắn chiết MeOH được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (0-100% MeOH) Kiểm tra bằng SKLM, gộp các ống có cùng thành phần và cất loại dung môi thu được

12 phân đoạn được ký hiệu từ M1 đến M12

Phân đoạn M3 (0,8 g) được phân tách trên cột Sephadex, rửa giải với hệ dung

môi CH2Cl2 - MeOH (2:8) thu được bốn phân đoạn được ký hiệu từ M3.1 đến M3.4 Phân đoạn M3.4 (40 mg) được tinh chế bằng SKLM silica gel điều chế với hệ dung

1,12 kg thân cây máu chó đá

môi CH2Cl2 - MeOH (98:2) thu đƣợc chất CDM 10 (3,5 mg, chất rắn, màu trắng) và

CDM 13 (4 mg, chất rắn, màu vàng)

Phân đoạn M5 (1,3 g) đƣợc phân tách trên cột Sephadex, rửa giải với hệ dung

môi CH2Cl2 - MeOH (2:8) thu đƣợc năm phân đoạn đƣợc ký hiệu từ M5.1 đến M5.5 Phân đoạn M5.5 (40 mg) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex, rửa giải với hệ dung môi

CH2Cl2 - MeOH (2:8) thu đƣợc chất CDM 4 (5 mg, chất rắn, màu vàng)

Phân đoạn M6 (1,7 g) đƣợc phân tách trên cột Sephadex, rửa giải với hệ dung

môi CH2Cl2 - MeOH (2:8) thu đƣợc bốn phân đoạn đƣợc ký hiệu từ M6.1 đến M6.4 Phân đoạn M6.2 (110 mg) đƣợc tiếp tục phân tách trên cột cột Sephadex, rửa giải với

hệ dung môi CH2Cl2 -MeOH (1:9) để thu đƣợc năm phân đoạn nhỏ đƣợc ký hiệu từ

M.6.2.1 đến M.6.2.5 Phân đoạn nhỏ M.6.2.5 (13 mg) tinh chế bằng SKLM silica gel

điều chế với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (9:1) thu đƣợc hai chất CDM 6 (6 mg, chất rắn, màu vàng nâu) và CDM 7 (3 mg, chất rắn, màu vàng nâu)

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cắn chiết methanol

Cắn Methanol (53g)

M3 0,8g

M5 1,3g

….

M6 1,7g

M10

M3.4 40mg

M6.2.2

(13 mg)

CDM6 6mg

CDM7 3mg

CC, Silicagel,gradient MeOH-CH 2 Cl 2 (0-100)

Sephadex

CH 2 Cl 2 -MeOH (2:8)

Sephadex

CH 2 Cl 2 -MeOH (1:9)

FC, Silicagel

CH 2 Cl 2 -MeOH (9:1)

CDM13 4mg

CDM10

3,5mg

Sephadex,

CH2Cl2-MeOH (2:8)

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập

Các hợp chất sau khi được phân lập, kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (Merck 60 F254), với ba hệ dung môi khác nhau, tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, phun thuốc thử Cerisunfat

a Các hợp chất CDM 10, CDM 13

Các hợp chất CDM 10, CDM 13 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với ba

hệ dung môi sau:

Hệ I: CH2Cl2 - Aceton (95:5)

Hệ II: CH2Cl2 - EtOAc (95:5)

Hệ III: n-Hexan - Aceton (65:35)

Tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, phun thuốc thử Ceri sunfat Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của ba hệ, mỗi chất cho một vết, rõ, không có vệt phụ Sơ bộ kết luận 2 chất trên là các hợp chất tinh khiết

Hệ I Hệ II Hệ III

Hình 3.1 Sắc ký đồ của chất CDM 10, CDM 13 sau khi hiện màu bằng

thuốc thử cerisulfat

Bảng 3.1 Kết quả SKLM của các chất CDM 10 và CDM 13 sau khi hiện

màu bằng thuốc thử Cerisulfat

Hệ I Hệ II

Hình 3.2 Sắc ký đồ của chất CDM 4 sau khi hiện màu bằng thuốc thử

cerisulfat

Bảng 3.2 Kết quả SKLM của các chất CDM 4 sau khi hiện màu bằng thuốc

Hệ III: n-Hexan - Aceton (6:4)

Quan sát dưới đèn UV 254 nm, phun thuốc thử Ceri sunfat Kết quả trên sắc ký

đồ của cả ba hệ, mỗi chất cho một vết, rõ, không có vết phụ Sơ bộ kết luận CDM 6, CDM 7 là các hợp chất tinh khiết

Hình 3.3 Sắc ký đồ của các chất CDM 6, CDM 7 sau khi hiện màu bằng