Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm cercodemas anceps

Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tếbào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể cókhả năng chữa trị nhất định cho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến với:

TS Nguyễn Xuân Cường, người thầy hướng dẫn chính của tôi trong luận

văn tốt nghiệp của mình Đối với tôi, lĩnh vực hóa sinh còn rất mới mẻ nhưng thầy

đã giúp tôi tiếp cận được một cách dễ dàng nhất; hỗ trợ tôi rất đúng lúc, kịp thời đểtôi có cái nhìn sâu sắc về lĩnh vực mới.Tuy vẫn còn rất nhiều kiến thức cần phải họchỏi nhưng chắc chắn những gì thầy chỉ bảo sẽ là tiền đề vững chắc cho tôi có khảnăng tìm hiểu sâu hơn về các kỹ thuật hóa sinh

PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người thầy tôi vô cùng kính trọng và có

ảnh hưởng sâu sắc nhất đến tôi Cô không chỉ là người lãnh đạo nhóm Ung thư họcthực nghiệm mà còn là phó chủ nhiệm bộ môn Sinh học tế bào.Với bao bộn bề côngviệc, cô vẫn dành cho tôi những khoảng thời gian để giúp tôi giải quyết những khókhăn trong công việc Mỗi lần được cô chỉ dạy tận tình tôi lại thấy mình thật maymắn khi được cô nhận vào nhóm nghiên cứu Cô dạy tôi kiến thức và kỹ năng thựchành, truyền lại cho tôi kinh nghiệm và tinh thần làm việc, cho tôi nơi làm thínghiệm và hỗ trợ tôi cả về vật chất.Cùng với những lời động viên nho nhỏ, đó làđộng lực để tôi bước qua những rào cản lớn nhất trong công việc

ThS Bùi Thị Vân Khánh, người chị cả luôn gắn bó với các thế hệ sinh

viên, trong đó có cả thời sinh viên của tôi Tôi đã luôn được nghe nói về sự nhiệttình của chị đối với sinh viên, nhưng khi được làm việc cùng chị tôi mới thấy hếtđược sự năng nổ và nhiệt tình ấy của chị.Tôi muốn dành một lời cảm ơn đặc biệtnhất đến với chị vì có thể nói không có sự giúp đỡ của chị tôi khó mà hoàn thànhđược công việc của mình.Chị đã luôn động viên tôi mỗi khi nói chuyện và quan tâmđến tôi cho đến những ngày cuối cùng trước khi hoàn thành công việc

ThS Nguyễn Đắc Tú, CN.Lê Thị Kim Anh, ThS Nguyễn Thị Ngọc Ánh

như những người anh, người chị lớn trong một gia đình, gần gũi chăm lo cho nhómnghiên cứu.Các anh chị không chỉ quan tâm đến công việc và còn lo cả đời sốngtinh thần cho các em, luôn tạo không khí vui vẻ, môi trường làm việc thân thiện, tốtnhất cho các em

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PhòngDược liệu biển, Viện Hóa sinh

biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp tôi phân lập và xácđịnh cấu trúc các hợp chất saponin với sự tài trợ kinh phí từ Đề tài nghiên cứu khoa

học trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: “Nghiên cứu khai thác dược

liệu Da gai ở vùng biển Đông bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư và kháng sinh", mã số VAST.TĐ.ĐAB.03/13-15.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Sinh học nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Sinh học tế bào nói riêng Thầy cô đã giúp tôi

có được kiến thức vững vàng và kỹ năng để tìm hiểu các vấn đề quan tâm.Điều đógiúp tôi rất nhiều trong việc hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, cảm ơn từ những gì bé nhỏ nhất màgia đình đã dành cho tôi Tất cả đã luôn vui vẻ với những sự lựa chọn của tôi, ủngcon đường tôi đang đi, những gì tôi đang làm Cảm ơn các anh chị đồng nghiệp, bạn

bè đã hỗ trợ tôi để tôi có thời gian hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Khắc Sinh

1.5.2.

1.5.3.

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Loài hải sâm

2.1.2 Mẫu chế phẩm sinh học

2.1.3 Dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180

2.1.4 Dòng tế bào ung thư vú MCF7

2.1.5 Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116

2.1.6 Chuột nhắt trắng Swiss

2.2 Hoá chất, thiết bị

2.2.1 2.2.2 2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm

2.3.2 2.3.3 Phương pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp

2.3.4 Phương pháp xác định tế bào apoptosis dưới tác dụng của 2.3.5 Phương pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm

2.3.6 2.3.7 Các phương pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm Chương 3 – KẾT QUẢ

3.1 Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm 3.2 Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

3.3 Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập

3.4 Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình .

KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1.1: Các đặc trưng cơ bản của tế bào ung thư 13

Hình 1.2: Quá trình chết theo chương trình (apoptosis) 15

Hình 1.3: Sự biểu hiện sớm PS trên màng tế bào chết theo chương trình 16

Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thư và dạng sống của chúng 17

Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps trong nghiên cứu 20

Hình 2.2: Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 trong nghiên cứu 21

Hình 2.3: Tế bào ung thư vú MCF7 trong nghiên cứu 22

Hình 2.4: Tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 trong nghiên cứu 22

Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss ( Mus musculus ) trong nghiên cứu 23

Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS và sản phẩm màu Formazan 27

Hình 2.7: Tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lượng tế bào 27

Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS 28

Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50 30

Hình 2.10: Annexin V gắn trên màng tế bào đang chết theo chương trình 30

Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da 33

Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) 35

Hình 2.13: Thước kẹp caliper 36

Hình 3.1: Phổ 13 C-NMR của chất 1 39

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của chất 1 41

Hình 3.3: Phổ HSQC của chất 1 41

Hình 3.4: Phổ HMBC của chất 1 42

Hình 3.5: Phổ COSY của chất 1 43

Hình 3.6: Phổ ROESY của chất 1 44

Hình 3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 – hợp chất colochiroside A 44

Hình 3.8: Phổ 13 C-NMR của chất 2 45

Hình 3.9: Phổ 1 H-NMR của chất 2 45

Hình 3.10: Phổ HMBC của chất 2 47

Hình 3.11: Phổ HSQC của chất 2 47

Hình 3.12: Phổ COSY của chất 2 48

Hình 3.13: Phổ ROESY của chất 2 48

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 – hợp chất philinopside A 49

Hình 3.15: Đường cong đáp ứng liều của tế bào HCT116 với hai chất 50

Hình 3.16: Đường cong đáp ứng liều của tế bào Sar-180 với hai chất 51

Hình 3.17: Đường cong đáp ứng liều của tế bào MCF7 với hai chất 51

Hình 3.18: Đường cong đáp ứng liều của Sar.180 (A) và MCF7 (B) đối với CPSH 53

Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V 54

Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI 54

Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V 54

Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI 55

Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH 56

Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH 56

Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH 57

Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH 57

Hình 3.27: U thực nghiệm dưới da của một số chuột thí nghiệm 58

Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lượng các lô ung thư trong quá trình thí nghiệm 59

Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u 60

Hình 3.30: Đồ thị tăng trưởng kích thước trung bình của u rắn ở các lô thí nghiệm 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm 25

Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS 28

Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS 29

Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chương trình 31

Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang 31

Bảng 2.8: Lô và các thông số trong quá trình thí nghiệm 35

Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H Itokawa 37

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo

40 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đường của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo 46

Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lượng trung bình của chuột ở các lô thí nghiệm 59

Bảng 3.4: Theo dõi kích thước khối u trong quá trình thử nghiệm 61

Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột mang u rắn Sar.180 62

Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lô thí nghiệm và đối chứng 63

MỞ ĐẦU

Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loạibệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ungthư Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó

-đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên Như vậy, bệnh ung thư

đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất củabệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức tolớn cho tất cả chúng ta

Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học

về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý Theo báo cáo của Tổ chức

Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vonghàng đầu trên toàn thế giới Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%).Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư Tổ chức Y tế thếgiới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do cácbệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới Tại Việt Nam, theothông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm

2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngàycàng tăng cao Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đãtrở thành vấn nạn của xã hội ra sao

Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trênthế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau Trong đó, xu hướngsàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bậtnhất Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tếbào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể cókhả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phốihợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc củacác tế bào ung thư Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tácđộng đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới

và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quantrọng và được ưu tiên hàng đầu

Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềmnăng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất

có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chấtsaponin Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ NguyễnXuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệViệt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợpchất saponin Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinhhọc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiếnhành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính

kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích:

1 Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải

sâm Cercodemas anceps

2 Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập

được trên một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo.

Chương 1 – TỔNG QUAN1.1 Saponin

1.1.1 Saponin và khả năng kháng u

Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, cóđặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi Cái tên saponin có nguồn gốc tiếngLatin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòngkhi rung lắc mạnh với nước Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là dosaponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốcmonosaccharide Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cựctrong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước

Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá,hoa và hạt Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật

và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư cancer) [11] Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene(Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon,saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là dosteroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khitriterpenes có đủ 30 carbon Các thành phần glycone của chúng thường làoligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liênkết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]

(anti-Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ratriterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponinkhác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes,taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình1.1).Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khácnhau Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sựtương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơchế tác động hóa sinh học của saponin Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng

u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hìnhthành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu

và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u Dioscin là 1 thànhphần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông quangăn cản chu trình tế bào và apoptosis Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về

oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng vớitubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11].

Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trênnhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10] Vài loạisaponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình vàkích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10] Đối với độngvật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhau như polyphyllin Dthuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từCitrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24] Trong khi đó, saponin kếthợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều Hơnnữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin vớicác yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn

1.1.2 Cơ chế kháng u của một số saponin

Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớpcũng rất đa dạng Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đườngkhác nhau

Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém

nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u Chúng làmgiảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là α-fetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quátrình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộcERK (ERK-independent NF-kB) [11]

Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung

thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn

tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50

đối với tế bào ác tính Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh,saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của

cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyểnqua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chươngtrình thông qua canxi [11]

Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng

kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kíchthích miễn dịch Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở

samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ungthư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiềuprotein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF Avincin D và G gây ức chế

sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chươngtrình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside cóhiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạnhoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ứcchế trùng hợp tubulin Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống vàkhả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu

trình tế bào ở pha G1 Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào,

ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERTcủa telomere

Spirostanes cho thấy khả năng kháng u mạnh và kích thích hệ miễn dịch.

Trong đó, chất Polyphyllin D trong nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tiềm nănggây chết theo chương trình thông qua con đường ty thể và lưới nội chất như một sốchất khác Bên cạnh đó, chất Dioscin trong nghiên cứu tiền lâm sàng lại cho thấykhả năng ức chế hoạt động phân chia của hầu hết dòng tế bào ung thư máu và khối

u rắn Phân tích proteomic cho thấy chất này thúc đẩy apoptosis thông qua conđường ty thể và một số con đường khác Trong thực tế, chất Formosanin C trongnhóm này có tác động lên đáp ứng miễn dịch và được sử dụng hỗ trợ cho chất 5-fluorouracil (chất đã được sử dụng trong điều trị ung thư) Con đường ảnh hưởngcủa Formosanin C là do chất này hoạt hóa caspase-2, biến đổi hoạt động của ty thể(trong tế bào ung thư ruột kết HT29) [11]

Hình 1.1: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin

1.1.3 Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin

Sự khác nhau trong cấu trúc của saponin chính là khác nhau về loại, vị trí, và

số lượng gốc đường gắn trong liên kết glycoside tại các vị trí khác nhau trong vòng,qua đó có thể quyết định đặc tính tác dụng đáp ứng sinh học của saponin đó, đặcbiệt là khả năng kháng u Chúng ta có thể thấy một số mối liên quan giữa cấu trúc

và hoạt động như sau:

- Tác dụng của aglycone trong khả năng kháng u của saponin: so sánh sự khácnhau về vị trí và số lượng nhóm hydroxyl trong aglycone cho thấy khả năng khácnhau của các saponin TubeimosideII có C-16 nhóm hydroxyl đóng vai trò quantrọng trong việc điều chỉnh hoạt động sinh học của tubeimosideII và giảm khả nănggây độc của nó Nhưng C-17 nhóm hydroxyl có khả năng gây độc kém hơn và C-27hydroxyl có khả năng kháng u kém nhất [11]

- Tác dụng của chuỗi đường trong cấu trúc của saponin: các liên kết đường, sốlượng và thứ tự sắp xếp đường ảnh hưởng đến khả năng của saponin Ví dụ: vớicùng loại aglycone và độ dài chuỗi đường nhưng các cầu nối liên kết sẽ cho tiềmnăng kháng u khác nhau 4 disaccharide với 1-3 cầu nối cho tác dụng kém hơn 1-2hoặc 1-4 cầu nối Số lượng gốc đường ảnh hưởng đến khả năng kháng u củasaponin Hoạt động của các ginsenoside có tác động theo thứ tự: monosaccharideglycoside > disaccharide glycoside > trisaccharide glycoside > tetrasaccharideglycoside [11]

Tóm lại, sự phát hiện và phát triển của saponin đóng góp rất lớn vào các liệupháp ung thư và nhiều thành phần, trong số đó cho đến nay đã được ứng dụng trongcác thử nghiệm lâm sàng Hầu hết tất cả saponin đều gây cảm ứng chết theo chươngtrình cho tế bào khối u, chúng là thuốc được ưa dùng trong các liệu pháp chữa ungthư vì loại trừ các tế bào khối u bằng apoptosis là biện pháp hữu ích để tăng hiệuquả cho bệnh nhân, tránh việc bị hoại tử Mảng kiến thức quan trọng của cơ chếkháng u của saponin là cần thiết cho việc cải thiện trực tiếp các liệu pháp chốngkhối u dựa trên saponin trong tương lai.Mặt khác, các nghiên cứu và thử nghiệmnên được tập trung vào việc kết hợp giữa saponin và các thuốc kháng u khác

1.2 Saponin từ hải sâm

1.2.1 Hải sâm

Hải sâm hay còn được gọi là dưa biển, sâm biển, đỉa biển, là loài động vậtkhông xương sống Thân có dạng ống dài như quả dưa, phình ra ở giữa và thon nhỏ

ở hai đầu với những gai thịt nhỏ Phía trước có miệng với vành tua rõ rệt, phía sau

là hậu môn Dọc thân là các dãy chân ống Da mềm có các phiến xương nằm rải rácdưới da Hải sâm là động vật phân tính, trừ một số loài thuộc bộ Không chân

(Apoda) Trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ Chúng sống bò trên nền đáy,

ở độ sâu khác nhau, chỉ có một số loài thuộc họ Pelagothuridae là bơi lội Hải sâm

có khả năng tái sinh rất cao và sức chịu đựng bền bỉ (có thể sống dưới nước tới độsâu 6.000m)

Có nhiều loại hải sâm thuộc các chi Holothuria, Actinopyga, Stichopus.

Trong đó, hai loài hải sâm đen và trắng được sử dụng rộng rãi hơn:

Hải sâm đen (Holothuria vagabunda) có thân màu đen, bụng nhạt màu hơn,

Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã cho thấy hải sâm chứa rất nhiềuchất có các hoạt tính quý báu như hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, khángMAO Đặc biệt là sự có mặt của các hợp chất triterpenes saponin (holothurin) cóhoạt tính gây độc tế bào rất mạnh đối với nhiều dòng tế bào ung thư người, hứa hẹncho việc phát triển các dược phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh ung thư

1.2.2 Nguồn saponin từ hải sâm

Trước đây, Saponin đã được phân tách từ nhiều loài sinh vật biển như hảisâm (Nigrelli 1952; Yamanouchi 1955), sao biển (Mackie và Turner 1970), hải miên(Thompson 1985).Trong hải sâm, saponin là chất chuyển hóa thứ cấp Về mặt cấutrúc , chúng là các glycoside triterpene được tạo thành từ các chuỗi oligosaccharide

và aglycone là các holostane-3b-ol, đóng vai trò quan trọng trong

tác dụng dược lý của hải sâm Trên thế giới, các nhóm nghiên cứu đã tìm ra ít nhất

59 gylcoside tritecpen.Nhiều saponin xuất hiện trong nhiều loài hải sâm khác nhaunhưng cũng có nhiều saponin rất đặc hiệu cho loài

Trong cơ thể hải sâm, saponin phân bố khác nhau và nồng độ saponin cũngkhác nhau trong các khoang cơ thể Saponin được tìm thấy trong các cơ quan tiêuhóa, cơ, lớp biểu bì, buồng trứng và tinh hoàn (thay đổi theo chu kỳ sinh sản) vàống Cuvierian Saponin tách từ hải sâm thể hiện dược tính cao với khả năng kháng

u, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng nấm,

Ở Việt Nam, một vài nhóm nghiên cứu đã phân lập saponin từ hải sâm.Trong

đó có nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hải Đăng thuộc viện Hóa học các hợp chất

thiên nhiên đã phân tách được hai hợp chất mới từ loài hải sâm Holothuria scabravào năm 2007 Trong đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng khối phổ và cộng

hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của hai hợp chất Holothurin A3 vàHolothurin A4 với hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 với

IC50 lần lượt là 0,87 và 0,32 µg/ml (đối với chất Holothurin A3); 1,12 và 0,57 µg/ml(đối với chất Holothurin A4)

1.3 Một số phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học

1.3.1 Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ làphatĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và phađảoYMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷtinhhoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ rấtquantrọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Kích thướccủa chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năngtách càng cao, vàngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càngnhỏ thì tốc độ chảycàng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi khôngchảy được).Khi đóngười ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC)hoặc áp suất cao(HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quantrọng,

nó thể hiện khả năng tách của cột.Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,tức là phụthuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cầntách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rfkhác nhau Nhờvào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗnhợp.Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng Tuỳ theo yêu cầutách

mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinhthì tỉ lệ nàycao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rfcủa các chất), mà

hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô: Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vàocột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắpxếp chặt trongcột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trongsuốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cộttrước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cầnthiết Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khígây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt,gãy, dò Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độdòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quáthấp thì

sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và địnhhướngcho sắc kí cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica geltrên đếnhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chấttrực tiếp.Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica geldày hơn), cóthể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, ngườita có thể cạoriêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằngdung môi thích hợp

để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trênbản mỏng bằng đèn tửngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chấthoặc sử dụng dung dịch

1.3.3.2 Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon.Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộnghưởngởmột trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.Thangđo củaphổ 13C-NMR làppm, với dải thangđo rộng 0-230ppm.

1.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.TrênphổDEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất.Tín hiệu của CH và CH3

nằmvề một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350.Trên phổ DEPT

900chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.

1.3.3.4 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xácđịnh các tương tác củacác hạtnhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủyếuthườngđược sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trựctiếp H-Cđược xácđịnh nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục làphổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HSQC nằm trênđỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif CorrelationSpectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các protonđính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghéplại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểudiễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này màtừng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tửđược xácđịnh về cấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễncác tương tác xa trong không gian của các proton không kểđến các liên kết mà chỉtínhđến khoảng cách nhấtđịnh trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thểxácđịnh cấu trúc không gian của phân tử

Như trênđãđề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kếthợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phântích, sosánh, kết hợp khác.Đặc biệtđối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài,tín hiệu phổNMR bị chồng lấp nhiều, khó xácđịnh chính xácđược chiều dàicác mạch, cũngnhưđối với các phân tử có cácđơn vịđường thì việc xácđịnhchính xác loại đườngcũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụngphương pháp thuỷ phân rồi

xácđịnh bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặcGC-MS với cácđường chuẩn dựkiến.

1.4 Ung thƣ

Ung thư là một nhóm bệnh liên quan đến phân chia tế bào, trong đó một số tếbào thoát khỏi sự kiểm soát, sự biệt hoá sinh lý và tiếp tục nhân lên.Những tế bàonày có khả năng xâm lấn và phá huỷ các tổ chức xung quanh.Đồng thời chúng di trú

và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau để hình thành nên khối u mới Cuốicùng ung thư gây tử vong do các biến chứng và rối loạn chức năng cơ thể[22, 23]

Quần thể tế bào ung thư có sự thay đổi khá rõ nét về mặt hình thái và chứcnăng so với tế bào bình thường.Về mặt hình thái, tế bào ung thư có nhân lớn hơnbình thường, nhân chia thùy hoặc có nhân khổng lồ phân chia mạnh gọi là nhânquái Tế bào chất có nhiều tổn thương thoái hóa như nhiều hang, hốc, chất chế tiết,thể vùi Qua đó, tỷ lệ giữa nhân và tế bào chất bị phá vỡ Về mặt chức năng, tế bàoung thư biệt hóa kém nên không thực hiện được những chức năng bình thường vàchúng tiết ra các chất đặc trưng của các dòng tế bào như µFP, CA125 (ung thưbuồng trứng), CA25 (ung thư đại tràng), HCG (ung thư nhau thai, tinh hoàn)…

Khi quan sát các quần thể tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã đưa ra bahọc thuyết để giải thích nguồn gốc của quần thể này:

Thuyết đơn dòng: Là quan niệm kinh điển cho rằng khối u phát sinh từ một

tế bào mẹ nhân lên Ví dụ: Ở bệnh bạch cầu tủy trên phụ nữ da đen thấy đồngnhất loại tế bào thương tổn nhiễm sắc thể số 10 Các tế bào này đều tiết menGlucose-6-phosphate dehydroglubuline

Thuyết đa dòng: Dựa trên kết quả quan sát hình thái và chức năng cho thấy

tổ chức ung thư có nhiều loại tế bào nên khi chuẩn đoán tế bào học dễ nhầmlẫn và có nhiều dấu chuẩn sinh học (marker)

Thuyết về kém ổn định gen của TBUT: Có thể ban đầu là một dòng, do genung thư không ổn định nên có các tế bào biến dị sinh ra hàng loạt các tế bàohỗn hợp Ví dụ: u lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ hoặc các loại ung thưphổi thể hỗn hợp, ung thư mô liên kết thể hỗn hợp

Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thư thu nhận vàbiểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc tínhphức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh cácyếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần như bấttử; cảm ứng hình thành mạch máu; hoạt hóa quá trình xâm lấn và di

căn[7].Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn đánh giá tác động của chất đến quátrình gây chết tế bào ung thư nên chúng tôi quan tâm nhiều đến đặc điểm chống lại

sự chết của tế bào ung thư

Hình 1.2: Các đặc trƣng cơ bản của tế bào ung thƣ[7]

Có thể nói rằng, đặc điểm cơ bản nhất của tế bào ung thư liên quan đến khảnăng duy trì sự tăng sinh vô hạn của chúng Các mô bình thường sẽ điều khiển cácchu kỳ phân chia một cách hợp lý và chính xác Do đó, số lượng tế bàoluôn đượcđảm bảo cân bằng, qua đó, cấu trúc cũng như chức năng của mô được đảm bảo ổnđịnh Các tế bào ung thư có khả năng duy trì tín hiệu tăng sinh bằng một số conđường khác nhau Chúng có thể sản xuất các yếu tố tăng trưởng cho chính mình để

tự kích thích tăng sinh Ngoài ra, chúng có thể gửi các tín hiệu kích thích các tế bàothường để hỗ trợ hình thành chất nền khối u, cung cấp các yếu tố tăng trưởng cầnthiết khác cho khối u[27, 28]

Trong quá trình phát triển, các tế bào mới vẫn thường xuyên được sinh rathay thế cho các tế bào chết trong mô để đảm bảo về số lượng tế bào cho mô hoạtđộng bình thường.Các tế bào có thể bị chết vì đã già, vì sai hỏng ADN, vì tác động

cơ học hay vì mô cần giảm số lượng tế bào.Trong thực tế, tất cả các tế bào đều cósẵn chương trình để chết.Nhưng ở trạng thái hoạt động bình thường luôn có mộtloạt các tín hiệu ngăn cản chúng thực hiện quá trình chết Khi tín hiệu này mất đi,hoặc có một tín hiệu gây chết nào đó mạnh hơn được hoạt hóa, tế bào sẽ đi vào chu

trình chết của chúng Các tín hiệu này rất cần thiết để giữ tính cân bằng trong mô.Các con đường chết cơ bản của tế bào là: chết hoại tử (necrosis) và chết theochương trình (apoptosis).

Sự chết tế bào theo cơ thế hoại tử (necrosis) xảy ra khi tế bào chịu nhiều áp

lực quá mức gây nên tình trạng sinh hóa không tương thích với sự tồn tại bìnhthường của tế bào Trong trường hợp này, các tế bào sẽ dừng chuyển hóa, ADNnhân ngưng tụ, tập trung nhiều ở rìa nhân và các thành phần tế bào bắt đầu phân hủynhanh chóng không kiểm soát được.Nhiều chất nội bào phát tán ra khỏi tế bào, gâyảnh hưởng đến môi trường xung quanh tế bào, tạo nên các tín hiệu tiêu cực chonhững tế bào xung quanh Đối với khối u, chết theo cơ chết hoại tử có thể phát tínhiệu gây viêm vào môi trường xung quanh, thu hút sự tập trung của các tế bào miễndịch Bên cạnh việc tiêu diệt tế bào khối u, những tế bào này lại có tác động tích cựcđối với khối u như việc giúp hình thành mạch máu Ngoài ra, khi một tế bào bị chếthoại tử có thể giải phóng các yếu tố sinh học như IL-1a có khả năng kích thích các

tế bào lân cận phát triển, một lần nữa đã tạo điều kiện tốt cho tế bào ung thư pháttriển Do vậy, việc chết theo cơ chế hoại tử của tế bào dường như có lợi cho tế bàoung thư [29]

Sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) là một quá trình hoạt động

theo thứ tự được lập trình cho tế bào Quá trình xảy ra bằng cách tháo dỡ dần cáccấu trúc tế bào nhưng không lan truyền đến các tế bào xung quanh Tín hiệu ban đầu

có thể đến từ ngoại bào với sự tham gia của các thụ thể chết và các phối tử (ligand),hoặc đến từ nội bào thông qua sự giải phóng các yếu tố tiền apoptosis nhưcytochrome-c từ khoảng gian màng của ty thể Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặctrưng bởi sự phá vỡ mối liên hệ tế bào – tế bào.Những tế bào chết co tròn lại, màngnội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất.Trong nhân, chấtnhiễm sắc cô đặc tối đa, nằm sát vào màng nhân tạo các phần hình lưỡi liềm(Hình1.3).Đây là sự kiện rất đặc biệt của apoptosis mà không thấy trong bất kỳ trườnghợp nào khác

Hình 1.3: Quá trình chết theo chương trình (apoptosis)[4]

Các enzyme endonucleases cắt ADN thành những đoạn 180bp (có thể nhiềuhơn).Nhân bắt đầu chia thùy phân cắt thành những mảnh nhỏ.Đồng thời màng tếbào cũng bắt đầu chia cắt, bao lấy các phần tế bào chất tạo ra rất nhiều mảnh vỡkích thước khác nhau được gọi là thể apoptosis.Các thành phần tế bào nằm trongcác thể này, không bỉ rò rỉ ra ngoài môi trường nên không có đáp ứng viêm được tạora.Cuối cùng, toàn bộ các mảnh vỡ tế bào sẽ được thực bào bởi các đại thực bàohoặc các tế bào biểu mô khỏe mạnh xung quanh.Các đại thực bào có khả năng này

là nhờ sự nhận diện những bất thường của tế bào apoptosis như sự ngoại bào hóaphosphatidylserine (PS) từ lớp trong ra lớp ngoài trên màng tế bào của các tế bàoapoptosis.Hiện tượng trên xảy ra là do: từ giai đoạn sớm, bên trong những tế bàoapoptosis đã giải phóng các protein caspases-3 và7, làm hoạt hóa phức hợp proteinXRP8 – là một protein trượt trên màng kép photpholipid, có tác dụng sắp xếp cácphotpholipid giữa 2 lớp màng đơn của màng tế bào Vì vậy, PS được vận chuyển từlớp trong ngược ra lớp ngoài, biểu hiện trên bề mặt tiếp xúc với nền ngoại bào(Hình1.4) PS chính là tín hiệu sớm để nhận biết tế bào đang chết theo chương trình.Dựa vào đặc điểm này, các nhà khoa học đã phát triển các loại protein huỳnh quanggắn vào PS để phát hiện tế bào chết theo chương trình

Hình 1.4: Sự biểu hiện sớm PS trên màng tế bào chết theo chương trình[12]

(PC: phosphatidylcholine, SM: sphingomyelin, PE: phosphatidylethanolamine, PS:

phosphatidylserine)

Các tín hiệu về chết theo chương trình của tế bào như một rào cản tự nhiênchống lại ung thư đã được nghiên cứu nhiều trong hai thập kỷ gần đây.Nhiều nghiêncứu đã cho thấy tín hiệu này bị suy giảm trong những khối u ác tính[26, 30] Chính

vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng muốn đánh giá tác dụng của chế phẩmtách chiết được gây chết theo chương trình cho tế bào ung thư hay không

1.5 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư

1.5.1 Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào

Mô hình nuôi cấy đơn lớp sử dụng giá thể nuôi cấy là những chai, đĩa có bềmặt phẳng với những kích thước khác nhau.Tế bào nuôi cấy là một dòng tế bàophân lập được hoặc dòng tế bào thương mại tại các ngân hàng tế bào Trong môhình này, tế bào được nuôi có thể ở hai dạng: bám dính hoặc trôi nổi Một số dòng tếbào ung thư như tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, tế bào ung thư vú MCF7 sống ởdạng bám dính nên thường có dạng hình sao do phát triển nhiều điểm bám dính đểbám trên bề mặt nuôi cấy Các tế bào này xếp thành một lớp đơn trên các dụng cụnuôi cấy nên dụng cụ nuôi cấy thường phải được xử lý bề mặt để đảm bảo khả năngbám được trên bề mặt của các tế bào dạng này.Các dụng cụ không được xử lý bềmặt hoặc xử lý bề mặt kém sẽ làm chậm khả năng phát triển của cả quần thể tế bàonuôi cấy.Bên cạnh đó, các dòng tế bào ung thư mô liên kết như Sarcoma-180, ung

thư máu sẽ sống trôi nổi dạng huyền phù trong môi trường nên có dạng hìnhcầu.Dạng tế bào này có thể nuôi trong các đĩa thủy tinh vô trùng thôngthường.Ngoài ra, một số dòng tế bào ung thư sống ở cả 2 dạng trôi nổi và bám dínhtrong cùng một quần thể nuôi cấy như tế bào ung thư biểu mô phổi 3LL (Hình1.5).

Hình 1.5: Một số dòng tế bào ung thƣ và dạng sống của chúng

Tế bào ung thư vú MCF7 sống dạng bám dính (A), ung thư mô liên kết

Sarcoma-180 sống trôi nổi (B), ung thư biểu mô phổi 3LL (C) sống trôi nổi (a) và sống bám dính (b).

Mô hình thử nghiệm thuốc này được xem là dễ thực hiện nhất trong cácphòng nuôi cấy tế bào động vật Nhưng trên thực tế, phải đến năm 1950, sự pháttriển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn lớp phải nhờ vào sự phát triển của môi trườngvới các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào đơn lẻ Cùng với đó, các kỹthuật nhuộm hóa miễn dịch, miễn dịchhuỳnh quang giúp quá trình đánh giá tác độngcủa thuốc lên tế bào trở lên cụ thể và rõ ràng Vậy nên, mô hình nuôi cấy tế bào đơnlớp mới thực sự phát triển và nhanh chóng trở nên phổ biến trong các phòng thínghiệm

Mô hình này có ưu điểm rất lớn là có thể triển khai nhanh chóng, đơn giản ởhầu hết các phòng thí nghiệm về tế bào Qua đó, các nhà nghiên cứu có thể sàng lọcđược nhiều loại thuốc trong khoảng thời gian ngắn, dễ dàng phân tích tác động củathuốc lên các protein đích hay các quá trình trao đổi chất của từng dòng tế bào bằngcác biện pháp hóa nhuộm, biện pháp định lượng khác nhau Nhưng mô hình lại cónhược điểm là chỉ đánh giá được tác động một chiều từ thuốc tác động lên tế bàođơn lẻ, sự tương trợ của các tế bào trong mô và của hệ thống khác trong cơ thểkhông được thể hiện trong mô hình này [1] Vì vậy, mô hình nuôi cấy đơn lớp chỉthích hợp cho các sàng lọc ban đầu, phân loại tiềm năng của thuốc dựa trên các tiêuchí tác động cụ thể

1.5.2 Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào

Mô hình được phát triển bắt đầu từ những năm 80 bởi người tiên phong MinaBissell của phòng thí nghiệm Quốc gia Lawrence Berkeley Phương pháp nuôi cấymới này được cho là bước cải tiến đáng kể so với mô hình đơn lớp bởi nhiều lý do.Các tế bào mô sống tồn tại trong các vi môi trường 3 chiều với các tương tác giữa tếbào- tế bào và giữa chất nền-tế bào cùng với các phức hệ vận chuyển chất dinhdưỡng cho tế bào mà mô hình đơn lớp không có được, qua đó, các chất sàng lọc trên

mô hình này với kết quả đáng tin cậy hơn về hiệu quả và độc tính của thuốc

Khối cầu được tạo ra khi tiến hành treo ngược giọt nuôi cấy để sử dụng trọnglực, tập trung các tế bào tại điểm thấp nhất trong giọt treo.Các tế bào được tập trungthành cụm, liên kết với nhau tạo nên khối cầu nhỏ, bắt đầu hình thành tổ chức mô.Sau vài ngày nuôi cấy, khối cầu đạt được kích thước và cấu trúc thích hợp sẽ đượctiến hành thử thuốc[3]

Khối cầu nuôi cấy được mô tả rất giống với mô in vivo và được cải tiếnnhiều để nghiên cứu sự xâm lấn, biệt hóa, tồn tại và phát triển của tế bào ungthư.Sâu hơn nữa, kiểu nuôi cấy khối cầu giúp cho tế bào phân cực chính xác hơn,trong khi nuôi cấy đơn lớp tế bào chỉ phân cực một phần hoặc không chính xác.Vớinhiều ưu điểm, mô hình này đang được sử dụng nhiều hơn trong phòng thí nghiệmnhưng chưa được đưa ra để sàng lọc nhiều vì cần nhiều thao tác cao cấp, phức tạphơn Một khối cầu cần nhiều ngày nuôi cấy trước khi đưa vào sàng lọc và độ đồngđều giữa các khối cầu trong sàng lọc cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kếtquả sàng lọc nên mô hình này còn chưa được phổ biến trong sàng lọc thuốc

1.5.3 Mô hình động vật thí nghiệm

Mô hình này được sử dụng từ rất lâu do kỹ thuật nuôi động vật sống khôngphức tạp bằng nuôi cấy tế bào Thực nghiệm cho thấy rằng các tế bào ung thư củakhối u ác tính trên cá thể này có thể cấy truyền cho các cá thể khác cùng dòng vàcác tế bào ung thư này cũng có khả năng phát triển và giết chết vật chủ mới.Hơnnữa, khối u ác tính có cả ở các loài lưỡng cư, cá, bò sát, chim và động vật có vú nên

sử dụng các mô hình động vật trong nghiên cứu sàng lọc thuốc chống ung thư làhoàn toàn có cơ sở khoa học [2] Nhiều loài động vật được sử dụng như cá ngựavằn, gà, thỏ, và đặc biệt là chuột Chuột có sự tương đồng di truyền cao so với conngười và có ưu điểm nổi bật là sinh sản mạnh, điều kiện sinh trưởng không ngặtnghèo nên thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm và sàng lọc[9, 14]

Mô hình này sử dụng cơ thể trưởng thành hoàn thiện nên có đầy đủ sự tươngtác của nhiều yếu tố như thuốc, khối u, mô lành, hệ miễn dịch.Các tương tác nàycho kết quả hoàn toàn đáng tin cậy Nhược điểm lớn của phương pháp là chịu áp lực

về vấn đề thời gian khi bị chi phối bởi quá trình đáp ứng chậm của toàn bộ hệ thống

cơ thể so với nuôi cấy tế bào, cũng như khả năng sống tiềm tàng của động vật thínghiệm sẽ làm quá trình sàng lọc kéo dài nhiều ngày, thậm chí nhiều tuần lễ Hơnnữa, việc sử dụng động vật nhằm mục đích thí nghiệm còn liên quan đến vấn đề đạođức nên còn được sử dụng hạn chế.Như vậy, tùy theo mục đích và quy mô sàng lọc

mà chúng ta sử dụng các mô hình thích hợp hoặc kết hợp các mô hình sàng lọc đểthu được kết quả nhanh và đáng tin cậy nhất

Như vậy, có thể thấy dù sử dụng bất kì mô hình nào cũng sẽ có những ưunhược điểm riêng Nhưng dễ thấy rằng, mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp có khảnăng tự động hóa cao, có thể sử dụng nhiều máy móc thay thế cho người làm thínghiệm đồng thời rút ngắn được thời gian thao tác trên nhiều dòng tế bào với nhiềuhợp chất khác nhau Do vậy, mô hình này rất phù hợp để sử dụng cho sàng lọc thuốcquy mô lớn, nhất là với sự phát triển một lượng lớn các thuốc có độc tính như hiệnnay Sau đó, mô hình động vật thí nghiệm sẽ trở thành một mô hình sàng lọc thứ cấpcho phép ta đánh giá chính xác tác động của thuốc lên khối u trong cơ thể Việc sửdụng mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp như mô hình sàng lọc sơ cấp sẽ cho phépchúng ta tiết kiệm thời gian cũng như kinh phí khi sàng lọc một số lượng lớn, lựachọn ra những hợp chất tiêu biểu có tác dụng để tiến đánh giá tác động của thuốctrên cơ thể động vật một cách hiệu quả hơn.Xuất phát từ các cơ sở đã nêu chúng tôi

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính

kháng tế bào ung thƣ từ hải sâm Cercodemas anceps”

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Loài hải sâm Cercodemas anceps

Hệ thống phân loại:Ngành:

Loài: Cercodemas anceps Selenka, 1867

Tên đồng danh:Colochirus anceps Semper, 1867

Colochirus cucumis Semper, 1867

 Mô tả: Trong nghiên cứu này, loài hải sâm Cercodemas anceps được thu tại

Bắc Vàn, Cô Tô, Quảng Ninh vào tháng 4 năm 2014 và được PGS TS Đỗ CôngThung giám định Mẫu tiêu bản được lưu tại Viện Hóa sinh biển và Viện Tài nguyên

và Môi trường biển Loài này có kích cỡ nhỏ, khoảng 5-7 cm(chiều dài), thân hìnhtrụ, thuôn nhọn về phía hậu môn Cơ thể có màu hồng hoặc vàng-hồng với 4 đường

gờ chạy dọc thân, các gai mềm chạy dọc 4 đường gờ Loài này thường hay bị nhầm

lẫn với loài Colochirus quadrangularis nhưng có sự khác biệt cơ bản là các nốt sần

trên cơ thể loài này nhỏvà mịn hơn (Hình 2.1)

Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm

2.1.2 Mẫu chế phẩm sinh học

Chế phẩm được tạo ra theo Đề tài khoa học và công nghệ trọng điểm về tiềmnăng dược liệu da gai ở vùng biển Đông Bắc Việt Nam Thành phần chủ yếu là caochiết từ sinh vật biển trong đề tài, kết hợp tá dược và cao chiết nấm linh chi Mẫuchế phẩm được sử dụng trong thí nghiệm đánh giá độc tính trên tế bào đơn lớp vàtrên mô hình động vật nhằm đánh giá tác dụng hiệu quả kết hợp các chất trong chếphẩm

2.1.3 Dòng tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180

Dòng tế bào Sarcoma-180 có nguồn gốc từ chuột nhắt trắngMus musculus

chủng Swiss Webster bị ung thư mô liên kết, khối u dạng báng (lỏng).Trong thínghiệm, dòng tế bào được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection)

Tế bàocó dạng hình cầu do sống trôi nổi nhiều lớp trong môi trường nuôi cấy (Hình2.2) với thời gian nhân đôi là 15,5 giờ và môi trường nuôi cấy là DMEM 1,1%glucose + 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% P-S (Penicillin-Streptomicine),37°C, 5% CO2

Hình 2.2: Tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 trong nghiên

cứu 2.1.4 Dòng tế bào ung thƣ vú MCF7

Dòng tế bào này là tế bào ung thư biểu mô vú thu từ dịch màng phổi (vị trí dicăn) của một phụ nữ sáu mươi chín tuổi, có hình sao do sống bám dính (Hình 2.3)với thời gian nhân đôi là 29 giờ và nuôi trong môi trường DMEM + 10% FBS + 1%P-S

Hình 2.3: Tế bào ung thƣ vú MCF7 trong nghiên cứu 2.1.5 Dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116

Dòng tế bào này là tế bào ung thư biểu mô ruột kết người có dạng hình sao do tếbào bám dính trên bề mặt nuôi cấy (Hình 2.4) với thời gian nhân đôi là 29 giờ vànuôi cấy trong môi trườngRMPI + 10% FBS + 1% P-S

Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 trong nghiên

cứu 2.1.6 Chuột nhắt trắng Swiss

Chuột Swiss (Mus musculus) do cơ sở nuôi động vật của viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương cung cấp với đặc điểm nhưchuột có trọng lượng trung bình 18-20g,được nuôi dưỡng bằng thức ăn dạng viên nén, uống nước đun sôi để nguội Nướcuống và trấu lót chuồng được thay hằng ngày

Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) trong nghiên cứu

DMEM (Dulbecco’s Modified EagleMedium) 11885

RPMI (Roswell Park Memorial Institutemedium)1640

FBS (Fetal Bovine Serum)P-S (Penicillin-Streptomicine)L-glutamine

DMSO (Dimethyl sulfoxide)

Tủ hood

Tủ ấm 5% CO2

Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL

Kính hiển vi quang học

Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1

Máy votex WhirliMixer

Máy ly tâm Universal 320

Microplate Reader Model 680

Đĩa nuôi cấy đa giếng: 96 giếng, 24 giếng, 6 giếng

Đĩa, chai nuôi cấy tế bào

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở haibước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đượcphun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và phađảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gelpha đảo YMC RP-18 (30-50 mm, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ionDiaion HP- 20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

Sắc ký lỏng trung áp

Sắc ký lỏng trung áp được tiến hành trên máy Biotage - Isolera One system(SE-751 03 Uppsala, Thụy Điển) của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

2.3.2 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kếthợpxác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ cộng hưởng từhạtnhân (NMR)

Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học,ViệnHàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS(TetrametylSilan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, ROESY, HSQC, HMBC

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d 6, CD3OD-d 4,CDCl3, pyridine-d 5 Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất củatừng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử

2.3.3 Phương pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp

Nguyên lý:

Đây là phương pháp so màu để xác định chỉ số sống của tế bào trong mộtkhông gian nuôi cấy xác định Phương pháp sử dụng muối tetrazolium MTS (3 -(4,5-dimethylthiazol-2-yl) – 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) – 2 - (4-sulfophenyl) -2H - tetrazolium) và một chất truyền điện tử trung gian là PMS (Phenazinemethosulfate) MTS sẽ được các enzym dehydrogenase có trong các tế bào sốngchuyển đổi thành sản phẩm formazan có màu và có khả năng hoà tan trong môitrường nuôi cấy (Hình 2.6) Formazan hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 nm.Lượng sản phẩm formazan sinh ra sẽ được định lượng thông qua độ hấp thụ ánhsáng 490 nm, tỷ lệ thuận và phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu (Hình 2.7)

Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS và sản phẩm màu Formazan[31]

Hình 2.7: Tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lượng tế bào[31] 27

Bố trí thí nghiệm trên đĩa 96 giếng đối với mỗi dòng tế bào:

Sau khi thu được kết quả đánh giá độc tính của hai chất lên các dòng tế bào,tiếp tục đánh giá độc tính của chế phẩm sinh học trên các dòng tế bào đã bị ảnhhưởng bởi hai chất phân lập được Nồng độ thử nghiệm là dải gồm 6 nồng độ 1,5, 3,

6, 12, 24, 48 µg/ml và bố trí thí nghiệm giống với chất 1 (Hình 2.8)

Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS

Thuốc

Chất 1

Chất 2

CPSH