Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm cercodemas anceps

Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định ch

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trang 2

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 7

Chương 1 – TỔNG QUAN 9

1.1 Saponin 9

1.1.1 Saponin và khả năng kháng u 9 1.1.2 Cơ chế kháng u của một số saponin 10 1.1.3 Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin 13 1.2 Saponin từ hải sâm 13

1.2.1 Hải sâm 13 1.2.2 Nguồn saponin từ hải sâm 14 1.3 Một số phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học

15

1.3.1 Sắc ký cột 15 1.3.2 Sắc kí lớp mỏng 16 1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) 16 1.3.3.1 Phổ 1 H-NMR 16

1.3.3.2 Phổ 13 C-NMR 16

1.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 17

1.3.3.4 Phổ 2D-NMR 17

1.4 Ung thư 18

19 1.5 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư Error! Bookmark not defined.

1.5.1. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào Error! Bookmark not defined.

1.5.2. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào Error! Bookmark not defined.

1.5.3 Mô hình động vật thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error!

Bookmark not defined.

2.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.1.1. Loài hải sâm Cercodemas anceps Error! Bookmark not defined.

2.1.2. Mẫu chế phẩm sinh học Error! Bookmark not defined.

2.1.3 Dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 Error! Bookmark not defined.

2.1.4 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 Error! Bookmark not defined.

2.1.5 Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 Error! Bookmark not defined.

2.1.6 Chuột nhắt trắng Swiss Error! Bookmark not defined.

2.2 Hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined.

2.2.1 Hoá chất Error! Bookmark not defined.

2.2.2. Thiết bị Error! Bookmark not defined.

2.2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao Error! Bookmark not defined.

2.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

Trang 3

2.3.3 Phương pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp Error! Bookmark not defined.

2.3.4 Phương pháp xác định tế bào apoptosis dưới tác dụng của CPSH Error! Bookmark not defined.

2.3.5 Phương pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

2.3.6 Phương pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

2.3.7 Các phương pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm sinh học Error! Bookmark not defined.

Chương 3 – KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined.

3.1 Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps Error!

3.2 Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được Error! Bookmark not defined.

Error! Bookmark not defined.

3.3 Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập Error! Bookmark not defined.

3.4 Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình in vitro và in vivo

Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

Trang 4

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1.1: Các đặc trưng cơ bản của tế bào ung thư 19

Hình 1.2: Quá trình chết theo chương trình (apoptosis) Error! Bookmark not defined.

Hình 1.3: Sự biểu hiện sớm PS trên màng tế bào chết theo chương trình Error! Bookmark not defined.

Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thư và dạng sống của chúng Error!

Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin Error! Bookmark not defined

Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps trong nghiên cứu Error! Bookmark

not defined.

Hình 2.2: Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 trong nghiên cứu Error!

Hình 2.3: Tế bào ung thư vú MCF7 trong nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

Hình 2.4: Tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 trong nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) trong nghiên cứu Error!

Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS và sản phẩm màu Formazan Error!

Hình 2.7: Tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lượng tế bào Error! Bookmark not defined.

Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined.

Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50 Error! Bookmark not defined.

Hình 2.10: Annexin V gắn trên màng tế bào đang chết theo chương trình Error! Bookmark not defined.

Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da Error! Bookmark not defined.

Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) Error! Bookmark not defined.

Hình 2.13: Thước kẹp caliper

Trang 5

Hình 3.3: Phổ HSQC của chất 1 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4: Phổ HMBC của chất 1 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5: Phổ COSY của chất 1 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6: Phổ ROESY của chất 1 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 – hợp chất colochiroside A Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.9: Phổ 1

H-NMR của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10: Phổ HMBC của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Phổ HSQC của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Phổ COSY của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.13: Phổ ROESY của chất 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 – hợp chất philinopside A Error! Bookmark not defined.

Hình 3.15: Đường cong đáp ứng liều của tế bào HCT116 với hai chất Error! Bookmark not defined.

Hình 3.16: Đường cong đáp ứng liều của tế bào Sar-180 với hai chất Error!

Hình 3.17: Đường cong đáp ứng liều của tế bào MCF7 với hai chất Error!

Hình 3.18: Đường cong đáp ứng liều của Sar.180 (A) và MCF7 (B) đối với CPSH

Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V Error! Bookmark not defined.

Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI Error! Bookmark not defined.

Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V Error! Bookmark not defined.

Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI Error! Bookmark not defined.

Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH Error!

Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH Error!

Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH Error!

Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH Error! Bookmark not defined.

Hình 3.27: U thực nghiệm dưới da của một số chuột thí nghiệm Error!

Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lượng các lô ung thư trong quá trình thí

nghiệm Error! Bookmark not defined.

Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u Error! Bookmark not defined.

Hình 3.30: Đồ thị tăng trưởng kích thước trung bình của u rắn ở các lô thí nghiệm

Trang 6

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chương trình Error!

Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang Error!

Bảng 2.8: Lô và các thông số trong quá trình thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H Itokawa Error! Bookmark not defined

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đường của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo

Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lượng trung bình của chuột ở các lô thí nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.4: Theo dõi kích thước khối u trong quá trình thử nghiệm Error!

Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột mang u rắn Sar.180 Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lô thí nghiệm và đối chứng Error! Bookmark not defined.

Trang 7

BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ đầy đủ

ADN (DNA) Deoxyribonucleic acid

TBUT Tế bào ung thƣ

EGF Epidermal growth factor

HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

Trang 8

MỞ ĐẦU

Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook - Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung thư Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên Như vậy, bệnh ung thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức to lớn cho tất cả chúng ta

Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%) Riêng ở Hoa Kỳ năm

2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư Tổ chức Y tế thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới Tại Việt Nam, theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K

sẽ thấy rõ ung thư đã trở thành vấn nạn của xã hội ra sao

Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau Trong đó, xu hướng sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật nhất Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của các tế bào ung thư Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác động đến hầu khắp các cơ quan trong

cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan trọng và được ưu tiên hàng đầu

Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất có cấu

Trang 9

9

trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chất saponin Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợp chất saponin Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân

lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas

anceps” với mục đích:

1 Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm

Cercodemas anceps

2 Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên một số

dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo

Trang 10

Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá, hoa

và hạt Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anti-cancer) [11] Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trưng bởi

30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon, saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi triterpenes có đủ 30 carbon Các thành phần glycone của chúng thường là oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]

Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình 1.1).Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác nhau Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ chế tác động hóa sinh học của saponin Một

số saponin đặc biệt với khả năng kháng u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane

đã cho thấy khả năng ức chế hình thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u Dioscin là 1 thành phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis Nhiều phân tử quan trọng

Trang 11

có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24] Trong khi đó, saponin kết hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều Hơn nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn

1.1.2 Cơ chế kháng u của một số saponin

Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp cũng rất

đa dạng Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường khác nhau

Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém nhưng

chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u Chúng làm giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là α-fetoprotein và ngăn cản

sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11]

Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư.Những

saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50 đối với tế bào ác tính Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh, saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương trình thông qua canxi [11]

Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng kháng

ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích thích miễn dịch Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở samạc Australia có

Trang 12

khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF Avincin D và G gây ức chế sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức chế trùng hợp tubulin Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu trình tế bào ở pha G1 Hay chất saponin được tách chiết từ cây

Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia

tế bào, ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERT của telomere

Spirostanes cho thấy khả năng kháng u mạnh và kích thích hệ miễn dịch Trong

đó, chất Polyphyllin D trong nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tiềm năng gây chết theo chương trình thông qua con đường ty thể và lưới nội chất như một số chất khác Bên cạnh

đó, chất Dioscin trong nghiên cứu tiền lâm sàng lại cho thấy khả năng ức chế hoạt động phân chia của hầu hết dòng tế bào ung thư máu và khối u rắn Phân tích proteomic cho thấy chất này thúc đẩy apoptosis thông qua con đường ty thể và một số con đường khác Trong thực tế, chất Formosanin C trong nhóm này có tác động lên đáp ứng miễn dịch và được sử dụng hỗ trợ cho chất 5-fluorouracil (chất đã được sử dụng trong điều trị ung thư) Con đường ảnh hưởng của Formosanin C là do chất này hoạt hóa caspase-2, biến đổi hoạt động của ty thể (trong tế bào ung thư ruột kết HT29) [11]

Định dạng
Số trang	24
Dung lượng	913,44 KB