Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa học từ thân rễ loài thực vật tri mẫu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THÚY QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ THÂN RỄ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU Anemarrhena asphodeloides Bunge LUẬN VĂN TH

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC

TỪ THÂN RỄ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides Bunge)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Thái Nguyên - Năm 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC

TỪ THÂN RỄ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides Bunge)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60 44 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM VĂN KHANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Học viên

Nguyễn Thúy Quỳnh

NHẬN XÉT CỦA

KHOA CHUYÊN MÔN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

HƯỚNG DẪN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới TS Phạm Văn

Khang - người thầy đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Kho H học, các học viên cao học K23 và các em sinh viên trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu Đ c iệt tôi xin chân th nh cảm ơn học vi n Đ o M i Phương (K24), Roãn Th hinh K48 Đinh Th Ho i K49 đã h trợ v giúp đỡ tôi quá tr nh thực hiện đ t i

Tôi cũng xin chân th nh cảm ơn B n giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Hóa, Phòng Đ o tạo (bộ phận S u đại học) trường Đại học Sư phạm Thái Nguy n đã tạo mọi đi u kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn n y

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Thúy Quỳnh

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời c m đo n i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Danh mục các từ viết tắt vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đ tài 1

2 Mục tiêu củ đ tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghi n cứu 2

5 Dự kiến kết quả đ tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Khái quát v thực vật họ Thùa (Agavaceae) 4

1.2 Tổng quan v loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 4

1.2.1 Tên khoa học 4

1.2.2 Đ c điểm thực vật 4

1.2.3 Phân bố trong tự nhiên 6

1.2.4 Công dụng của loài Tri mẫu 6

1.3 T nh h nh nghi n cứu th nh phần h học o i Tri mẫu 7

1.3.1 ác hợp ch t g ycoside 7

1.3.2 Các hợp ch t aglycon 22

1.3.3 Các hợp ch t phenolic 25

1.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu 27

1.4.1 Hoạt tính sinh học của các saponin 27

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các aglycon 29

Chương 2 THỰC NGHIỆM 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.2 Hóa ch t và thiết b 33

2.2.1 Hóa ch t 33

2.2.2 Thiết b 33

2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách v xác đ nh c u trúc các ch t phân lập được 34

2.3.1 Xử lý mẫu thực vật 34

2.3.2 Chiết tách các ch t 34

2.3.3 Xác đ nh c u trúc các ch t 34

2.4 Phương pháp xác đ nh khả năng ức chế tế o ung thư 34

2.4.1 Mẫu thử 34

2.4.2 Vật liệu v phương pháp nghi n cứu 34

2.5 Thực nghiệm 36

2.5.1 Quá trình phân lập các ch t từ phần rễ của loài Tri mẫu 36

2.5.2 Một số đ c điểm vật củ các ch t phân lập được 39

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả phân lập các hợp ch t 40

3.2 Kết quả xác đ nh c u trúc của hợp ch t 40

3.2.1 Hợp ch t 1 40

3.2.2 Hợp ch t 2 44

3.2.3 Hợp ch t AA3 50

3.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế o ung thư HeLa (cổ tử cung v A549 tế o ung thư g n 57

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

BÀI BÁO ĐƯỢC ĐĂNG TRONG THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 65 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Sự tương qu n giữa HC của ch t AA2 49 Bảng 3.2: Sự tương qu n giữa HC của ch t AA3 55 Bảng 3.3: Tác động gây độc tế o ung thư của các mẫu nghiên cứu 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu 5

Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu 6

Hình 1.3: Cây Tri mẫu 6

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của ch t AA1 41

Hình 3.2 Phổ 13C-NMR của ch t AA1 42

Hình 3.3 Phổ DEPT-135 của ch t AA1 42

Hình 3.4 Phổ HSQC của ch t AA1 43

Hình 3.5 Sự tương qu n giữa HC của ch t AA1 (HMBC) 43

Hình 3.6 Công thức c u tạo của AA1 44

Hình 3.7 Phổ hối ượng củ AA1 44

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của ch t AA2 45

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR của ch t AA2 46

Hình 3.10 Phổ DEPT-135 của ch t AA2 47

Hình 3.11 Phổ HSQC của ch t AA2 48

Hình 3.12 Sự tương qu n giữa HC của ch t AA2 (HMBC) 49

Hình 3.13 Phổ hối ượng củ AA2 50

Hình 3.14 Công thức c u tạo của AA2 50

Hình 3.15 Phổ 1H-NMR của ch t AA3 51

Hình 3.16 Phổ 13C-NMR của ch t AA3 52

Hình 3.17 Phổ DEPT-135 của ch t AA3 53

Hình 3.18 Phổ HSQC của ch t AA3 54

Hình 3.19 Sự tương qu n giữa HC của ch t AA3 (HMBC) 55

Hình 3.20 Phổ hối ượng củ AA3 56

Hình 3.21 Công thức c u tạo của AA3 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

1 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

2 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

3 TOF-MS Time-of-Flight Mass spectroscopy

4 HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy

5 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

6 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

8 CH2Cl2 Diclometan

9 CCl4 Cacbon tetraclorua

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Thế giới thực vật r t phong phú v đ dạng, nó cung c p cho con người nguồn tài nguyên vô cùng quý giá v nhi u ĩnh vực đ c biệt là ứng dụng trong Y–Sinh học Theo tổ chức y tế thế giới hiện nay khoảng 80% dân số thế giới sử dụng nguồn dược liệu để tr bệnh v chăm s c sức khỏe Xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp ch t thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật m dược phẩm chữa bệnh ngày c ng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học Từ thực tế nhận th y các hợp ch t thi n nhi n thường có hoạt tính mạnh độ ổn đ nh c o v c độc tính th p so với các hợp ch t nguồn gốc tổng hợp

Hóa học các hợp ch t thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành Hóa hữu cơ

đ ng c xu hướng phát triển mạnh mẽ Bởi vì, theo các công trình nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam nhi u hợp ch t thi n nhi n c dược tính chữa bệnh r t lớn như hoạt tính kháng khuẩn háng oxi h háng ung thư… hẳng hạn như hợp ch t

P c it xe T xo c trong cây Thông đỏ dùng làm thuốc hóa tr chữa bệnh ung thư

ho c hợp ch t aglycon có trong loài cây Tri mẫu có khả năng ảo vệ tế o não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế o ung thư Do vậy, việc nghiên cứu các

ch t mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là v n đ quan tâm của toàn xã hội

Tri mẫu là một trong những loài thực vật thuộc họ Thù g v ce e đã được

sử dụng từ âu để chữa một số bệnh như: vi m nhiễm, th p khớp, bệnh thần kinh Gần đây nhi u nghiên cứu đã chứng minh d ch chiết cao và hợp ch t hóa học được phân lập từ loài thực vật này có khả năng ức chế nhi u dòng tế o ung thư v ảo vệ

tế o não dưới các tác động gây tổn thương của glutamat, hyperglycemia, amyloid nhằm đ nh hướng chữa bệnh Alzheimer và Parkinson

beta-Ở Việt Nam, Tri mẫu thường được dùng trong các bài thuốc tr đ u hớp đ u

dạ d y v vi m đại tr ng Nhưng đến nay chỉ có ít các công trình nghiên cứu v thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này, các nghiên cứu này tương đối đơn giản v chư c tính hệ thống cao, đồng thời dựa trên kết quả của nhóm nghiên cứu v loài thực vật này chúng tôi nhận th y Tri mẫu có thành phần hóa

học đ dạng, có một số nhóm hợp ch t có hoạt tính tốt nên việc tiếp tục tiến hành nghiên cứu v thành phân hóa học v đánh giá hoạt tính sinh học của loài thực vật

n y để m cơ sở cho việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh là r t cần thiết c nghĩ khoa học và thực tiễn

D đ chúng tôi đ xu t đ tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất hóa

học từ thân rễ loài thực vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)” để

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập một số hợp ch t hóa học từ thân rễ loài thực vật Tri mẫu

(Anemarrhena asphodeloides Bunge)

- Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp ch t đã phân ập được

3 Nội dung nghiên cứu

- Tổng quan các nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố v loài Tri mẫu

- Tiến hành chiết xu t các hợp ch t từ loài thực vật này

- Phân lập v xác đ nh c u trúc của nó bằng các phương pháp phổ

- Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp ch t phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

- Thu thập mẫu nguyên liệu thực vật

Mẫu thực vật là phần rễ loài Tri mẫu được thu mua ở Hà Giang vào tháng 6/2016

- Xây dựng phương pháp chiết xu t các ch t có trong mẫu

+ Xác đ nh phương pháp phân tích chính xác thuận tiện nh t cho quá trình thực hiện

+ Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu và chiết xu t các hợp ch t từ loài thực vật trên

+ Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi khảo sát để lựa chọn dung môi an toàn, phù hợp

- Xây dựng và dự kiến phương pháp để thu được các hợp ch t từ nguyên liệu

đã chọn

+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột bằng các dung môi thích hợp để phân lập một số hợp ch t h học

+ Xác đ nh c u trúc hóa học của các hợp ch t bằng phương pháp vật

- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Dự đoán hoạt tính sinh học điển hình của các ch t đã phân ập được dựa vào

c u trúc của chúng và tiến hành thử hoạt tính sinh học

5 Dự kiến kết quả đề tài

- Phân lập một số hợp ch t hóa học từ thân rễ loài Tri mẫu

- Xác đ nh c u trúc hóa học của các hợp ch t phân lập được

- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp ch t

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về thực vật họ Thùa (Agavaceae)

Họ Thùa bao gồm khoảng 550-640 loài với khoảng 18-23 chi, phân bố rộng khắp trong khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới

Các loài trong họ Thùa có thể là cây mọng nước ho c không mọng nước Lá

củ chúng c các gân á song song á thường dài và nhọn mũi thường có gai cứng ở đỉnh đôi hi c các g i phụ mọc dọc theo mép lá [1]

Các loài thực vật họ Thù thường được sử dụng để sản xu t các dạng đồ uống chứa cồn ở khu vực Trung Mỹ như i pu que v rượu mezcal trong khi các loài khác

có giá tr để l y sợi Chúng r t phổ biến trong khu vực khô cằn, nhi u loài có hoa s c

- Tên Khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge

- Tên tiếng Việt: Tri mẫu

- Tên khác: Rhizoma Anemarrhena, zhimu

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Tri mẫu là cây thảo, sống âu năm Thân rễ dày, dẹt, mọc ngang bao bọc bởi những phần còn sót lại của gốc á m u đỏ h y v ng đỏ, m t trong màu vàng Lá mọc

tụ tập ở gốc thành cụm dày, hình dài, dài 20 - 70 cm, rộng 3 - 6mm, gốc có bẹ to mọc

ốp v o nh u đầu thuôn nhọn, hai m t nhẵn [2]

Rễ cây tri mẫu hình khúc dẹt ho c trụ hơi cong queo c hi phân nhánh d i 3

- 15 cm đường kính 0,8 - 1,5 cm Một đầu còn sót lại gốc thân và vết cuống lá màu vàng nhạt M t ngo i c m u v ng nâu đến nâu M t trên của thân rễ có một rãnh lớn

và có nhi u đốt vòng xếp sít nh u tr n đốt có nhi u gốc lá còn sót lại màu nâu vàng mọc ra 2 bên, m t dưới có nếp nhăn v nhi u vết rễ nhỏ hình ch m tròn lồi lõm Ch t cứng, dễ bẻ gẫy M t gẫy màu vàng nhạt Mùi nhẹ V hơi ngọt đắng, nhai có ch t nhớt [2]

Thân củ cây Tri mẫu được thu hái vào mùa thu ho c mùa xuân Sau khi loại bỏ

rễ xơ rửa sạch phơi hô v ngâm ngập nước, lột vỏ, thái thành lát mỏng v nướng với muối

Cụm hoa mọc từ giữ túm á h nh ông hơi cong cán thẳng và dài 0,5 - 1m; hoa nhỏ thơm nở vào buổi chi u, bao hoa màu trắng hay tía nhạt, chia 6 thùy dính nhau ở gốc; nh 3, chỉ nh r t ngắn; bầu 3 ô, vòi nhụy hình chỉ[2]

Quả nang, hình trứng, nhọn đầu, có cạnh; hạt 1 - 2 h nh t m giác m u đen[2]

Mùa hoa: tháng 7 – 8 [2]

D: Tràng hoa với bao ph n gắn li n với bên ngoài lọn cánh đ i

E: Nhụy hoa F: Quả nang nẻ ra G: Hạt hình thoi

Hình 1.1: Các bộ phận cây Tri mẫu

Hình 1.2: Rễ cây Tri mẫu

Hình 1.3: Cây Tri mẫu

1.2.3 Phân bố trong tự nhiên

Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) là loại thảo dược âu năm được

trồng ho c mọc ho ng tr n sườn núi ở Mãn Châu, Mông Cổ, và mi n Bắc của Trung Quốc [7] Ở Việt Nam, loài thực vật này chủ yếu phân bố ở các tỉnh phía bắc như Thái Nguyên, Bắc Kạn, Tuyên Quang,

1.2.4 Công dụng của loài Tri mẫu

Tri mẫu được dùng tr sốt đái tháo đường ho ho đờm thở dốc, ngực nóng khó

ch u ho o …

Một số bài thuốc có Tri mẫu [1]:

- Đi u tr các triệu chứng sốt cao, co giật, hôn mê trong viêm não Nhật Bản B:

Tri mẫu 16g, thạch cao 40g; kim ngân, huy n sâm sinh đ a, m i v 16g; hoàng liên, liên ki u, m i v 12g; cam thảo 4g Sắc uống

- Chữa viêm phổi trẻ em thể phong nhiệt, sốt cao: Tri mẫu 6g, thạch cao 20g, kim ngân hoa 16g, tang bạch bì 8g; hoàng liên, liên ki u, hoàng cầm, m i v 6g; cam thảo 4g Sắc uống ngày một thang

- Chữa sốt cao, li bì, mê sảng trong bệnh sởi trẻ em: Tri mẫu 8g; huy n sâm, gạo tẻ, m i v 12g; sừng trâu 8g, cam thảo 4g Sắc uống ngày một thang

- Chữa huyết áp cao, nhức đầu, hoa mắt, khó ngủ: Dùng bài Tri bá bát v hoàn gia giảm nêu trên, thêm thảo quyết minh sao 20g, chi tử 12g

- Chữa nóng âm, háo khát, mồ hôi trộm ho h n đái tháo đường: Dùng bài Tri bá bát v hoàn gia giảm nêu trên, thêm huy n sâm, thiên môn, thiên hoa ph n, m i

Hợp ch t được phân lập sớm nh t từ loài thực vật này là Timosaponin A-III

(1) Khi thủy phân ch t này với xit H 2N trong et no 50% thu được

sarsasapogenin, D-galactose và D-glucose Đây ch t có nhi u ứng dụng và thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhi u nhóm tác giả

O O

OH OH

O OH OH

O

OH

O H

OH

O

C

H3C

H3

C

H3 O CH3

(1)

Từ d ch chiết etanol của loài Tri mẫu, Dong và các cộng sự [8] đã t m r một

saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với h i s ponin đã iết là Anemarsaponin A1 (3) và Anemarsaponin A2 (4)

O

O OH O H

O OH H OH

O

O H

O H

OH

O

C

H3C

O H

OH C

H3

O H

(2)

O O

OH OH

O OH OH

(3)

O O

OH OH

O OH OH

O

(4)

Nhóm nghiên cứu ở nhật Bản do Nakashima phụ trách đã phân lập được

glycoside mới là pseudoprototimosaponin AIII (5) và prototimosaponin AIII (6).

O H

CH3

O Glc O

H

(6)

Các saponin steroid mới có tên: anemarrhena saponin I-IV (7-10) cùng với các

s ponin đã iết là timosaponin A-III (1), marcogenin diglycoside (11), timosaponin B-II (12) và mangiferin (13) đãđược Setsuo và cộng sự phân lập từ rễ của loài tri mẫu

v o năm 1994 C u trúc củ chúng đã được xác đ nh bằng các phương pháp phổ [33]

O OH OH

OH OH

O OH OH

O OH OH

O H

OH

CH3

O O

OH OH

O OH OH

O

O H

O H

OH

CH3O C

H3

(10)

CH3H

O H

OH

CH3O

O O

OH OH

O OH OH

O

O H

O H

OH

(12)

OH O

O H

OH OH

OH

(13) Bằng phương pháp sắc ký cột và v phương pháp sắc ký HPLC, Setsuo và cộng sự tiếp tục phân lập từ phần rễ của loài tri mẫu được 4 saponine mới là timosaponin H1 (22), timosaponin H2 (23), timosaponin I1 (24), timosaponin I2(25), vào năm 1999

O

O

CH3

O Glc

CH3

CH3

R

glc Xyl Glc

gal 4 3 2

CH3

CH3

R

glc Xyl

Glc

gal 4 3

2

(24) R=OH, (25) R=OCH3

Xi ings ponin B 26 được Hong và các cộng sự phân lập được hợp ch t saponin steroit từ phần rễ của loài Tri mẫu v o năm 1999[11]

Hợp ch t (26) là một ch t rắn dạng màu trắng, r t dễ t n trong nước, nhiệt độ sôi 178 - 180 oC Công thức được xác đ nh như s u.

O

CH2OH OH

O H

O O

CH2OH O O H O H

O

CH2OH OH O H OH

O

O

CH3C

H3

C

H3O

CH3

(26) Sáu saponin steroid là timosaponin N (27),timosaponin E1 (16), timosaponin

O (28), timosaponin E2 (17), purpureagitosid (29) và glucopyranosyl- 1→2 -β-D-galactopyranoside (30) được Kang và các cộng sự[19]

marcogenin-3-O-β-D-đã phân lập từ thân rễ của Tri mẫu vào năm 2006

Trong đ hợp ch t (28) và (29) là hợp ch t mới và hợp ch t 30 được phân lập lần đầu tiên từ loài Tri mẫu

Sáu hợp ch t thu được đ u ở dạng bột màu trắng, phản ứng Molisch và phản ứng Liebermann-Burchard cho kết quả dương tính Phản ứng thuốc thử Ehrlich hiển

th m u đỏ chỉ ra các hợp ch t này là saponin furostanol Qua phân tích phổ FAB

-MS, 1H NMR và13C NMR, c u trúc hóa học của các ch t được xác đ nh như dưới đây [19]

CH3H

O OH

O H

O

OH

O H

O H OH OH O H

OH

OH

O H

R2O

O OH

OH

CH3

O OH

O OH O H

O H

O O OH O H

O H

OH

(29)

O O

OH O

O OH OH

O

OH

O H

OH

O

CH3C

H3

C

H3O

CH3

O H

(30) Hai saponin mới : timos ponin IV 31 v timos ponin B IV 32 được Peng và các cộng sự[39] đã t m r từ phần rễ khô của loài Tri mẫu v o năm 2007 bằng phương pháp đun hồi ưu mẫu khô (5,0 kg) với EtOH 70% Phần c n thu được tiếp tục được chiết trong ete dầu, EAvà BuOH

O OH O H

O OH O

OH

O H

OH

O CH3

(31)

O OH O

O OH OH

O O

CH3

O OH

O OH O O

(32)Timosaponin B V (33) đã được Zhang và các cộng sự[41] nghiên cứu thành phần d ch chiết của phần rễ loài Tri Mẫu v o năm 2008

O

O O

O

OH OH

C

H3OCH3

O OH O

O

OH OH

CH3

(33)

Timosaponin X (38), timosaponin Y (39), một pregnane glycoside là timopregnane

B (40), 25S-timosaponin BII (41), protodesgalactotigonin (42) và timosaponin BII-a (43) đãđược Yuan và cộng sự[13] phân lập từ rễ của loài Tri mẫu v o năm 2014

O

R1O

H

OR2OH

H

OHH

OOHOH

H

HOH

OH

OHH

OOHOH

H

HOH

OH

OHH

HOHOH

OHOH

H

H

OH

OHH

OH

S3=

OHOH

H

OH

H

OHH

OH

S4=

OHO

H

OH

O

O

OHOH

H

OHO

OH

H

HOH

OH

OH

OHOH

H

HOH

O O

OH OH

O OH OH

O

OH

O H

OH

O

C

H3C

H3

C

H3O

CH3

(1) Một saponin mới là Anemarsaponin B (2) cùng với h i s ponin đã iết là nem rs ponin 1 3 v nem rs ponin 2 4 được Dong và các cộng sự[8] tìm

ra từ d ch chiết etanol của loài Tri mẫu v o năm 1991

O

O OH O

O OH H OH

OH C

H3O

(2)

O O

OH OH

O OH OH

O

O H

O H

O O

(3)

O O

OH OH

O OH OH

O

O H

O H

OH

O O

O H

(4) Pseudoprototimos ponin III 5 được Nakashima và cộng sự[25]đã phân lập

từ loài Tri mẫu v được so sánh với ch t đã iết prototimos ponin III 6 v o năm

1993

O H

CH3

O Glc O

H

(6) Hai saponin spirostanol mới có tên là anemarsaponin F (14) và G (15) được

Ma B và các cộng sự[5] t m r năm 1997 Tr n cơ sở phân tích quang phổ, c u trúc

của (14) và 15 được xác đ nh tương ứng là 1→2 [β-xylopyranosyl- 1→3 ]-β-glucopyranosyl 1→4 -β-galactopyranoside)

neogitogenin3-O-β-glucopyranosyl-(14) và lilagenin 3-O-β-glucopyranosyl- 1→2 - [β-xylopyranosyl- 1→3 glucopyranosyl- 1→4 -β-galactopyranoside (15)

]-β-O OH

OH

OH

O OH OH

O O OH

O

O H

O H

OH

O OH O

O H

O CH3

O O H

(14)

O OH OH OH

O OH OH

O O OH O

O

O

OH

O OH O

O

CH3

O O

(15) Hai saponin steroid mới có tên anemarnoside A (34) và anemarnoside B (35), cùng với ba hợp ch t đã iết là timosaponin J (36), timosaponin B II (12), và timosaponin B (37) được Liu và các cộng sự[31] phân lập từ loài Tri Mẫu v o năm

2013

H O

H

O H H

O

O Glc

Gal Glc

(34)

O

O

H Gal

CH3O

OH

OH OH OH

Glc

glc

(35)

HO

H

OH

H

O

OO

GalGlc

glc

(36)

CH3Oglc

O

CH3H

CH3H

C

H3 HO

gal glc

(12)

H O

H

H H

O Gal Glc

O

O Glc OH

OH H

CH3

(16)

O Gal Glc

O

O Glc OCH3

OH H

CH3

(17)

Năm 1998, nhóm nghiên cứu này tìm ra bốn hợp ch t saponin mới là timosaponin B-IV (18), timosaponin B-V(19), timosaponin B-VI(20), timosaponin D (21) ( tos= 186-190oC) Cả bốn ch t n y đ u ở dạng bột, màu trắng[23].

gal glc glc

H3C

H3 O Glc

O gal glc glc glc

CH3

CH34

3 2

(19) R=H (20) R=CH3

O O

H

O gal glc

(21)

1.3.2 Các hợp chất aglycon

1.3.2.1 Nghiên cứu th nh phần aglycon

Năm 1999 Liu v các cộng sự đã đư r một nghiên cứu v việc xác đ nh thành phần sarsasapogenin (44) từ loài Tri mẫu bằng phương pháp hệ thống sắc ký khí (GC)[36] Ngo i r cũng c một số tài liệu đ cập đến việc phân lập aglycon này

từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt tính bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ, ức chế tế o ung thư v hạ đường huyết…[14],[22],[43]

(44) Năm 2017 nh m nghi n cứu củ chúng tôi đã th nh công trong việc phân ập h i hợp ch t g ycon 44 v 44 các dẫn xu t củ s rs s pogenin[17]

1.3.2.2 Tổng hợp dẫn xuất của sarasasapogenin

Năm 2012 Peng v cộng sự [30] đã tổng hợp 8 hợp ch t dạng este ở v trí cacbon số 3 bằng các phản ứng este h Đồng thời nhóm nghiên cứu n y cũng thử

khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó với enzym β-gal Nhận th y ch t

(56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão hóa tốt

O O

Gần đây một số nghiên cứu đã đ cập đến việc tối ưu h c u trúc của sarsasapogenin nhằm nâng cao hoạt tính của aglycon này

Trong báo cáo gần đây nh t v o năm 2016 heng và các cộng sự[20] đã phân lập được sarsasapogenin từ loài Tri mẫu và tiến hành bán tổng hợp được 9 dẫn xu t

trong đ dẫn xu t (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin

Năm 2017 nh m nghi n cứu đã tiến h nh án tổng hợp được một số hợp

ch t c hoạt tính ảo vệ tế o v tăng cường hả năng trí nhớ củ chuột thực nghiệm [27]

Như vậy từ thành phần aglycon trong loài Tri mẫu có thể bán tổng hợp ra nhi u dẫn xu t mới có hoạt tính sinh học tốt hơn v c giá tr thức tiễn

Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglycon s rs s pogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học và bán tổng hợp khung cacbon này Còn các khung aglycon khác hiện

n y chư c áo cáo n o v việc phân lập chúng dưới dạng tinh khiết v xác đ nh c u trúc hóa học, bán tổng hợp và thử hoạt tính sinh học

1.3.3 Các hợp chất phenolic

Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin thì còn có các hợp ch t pheno ic cũng c há nhi u công trình nghiên cứu v hợp ch t này

1.3.3.1 Phân lập từ rễ loài tri mẫu

Các hợp ch tphenolic: 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70); dihydroxy-5-methoxyflavaone (71); 4,4'-dihydroxychalcon (72), 2'-O- methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'-

(2S)-7,4'-dihydroxy-4-metoxy enzophenon 75 đãđượcYoun và các cộng sự[15] phân lập từ rễ Tri mẫu v o năm 2009.Trong đ hợp ch t (70)- 73 được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này

O O

1.3.3.2 Phân lập từ lá loài Tri mẫu

Hai hợp ch t m giferin 68 v neom giferin 69 đãđượcnhóm nghiên cứu của Qin[21] phân lập từ lá loài Tri mẫu v o năm 2008 M giferin v neom giferin ở dạng bột màu vàng

O OH

R2

O H

R1O

(68): R1=H, R2=Glu (69):R1=Glu, R2=Glu

Bốn hợp ch t phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone (64), hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và nyasol (cis-hinokiresinol) (67) đã được Tsukamoto và các cộng sự[32] phân tách từ loài Tri mẫu

7-ở Nhật Bản v o năm 2005 Các hợp ch t đã được khảo sát khả năng ảo vệ tế bào thần kinh và khả năng ức chế proteasom

OH

OH O

OCH3

O H

O OH

1.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu

1.4.1 Hoạt tính sinh học của các saponin

Saponin là thành phần hóa học chủ yếu trong loài thực vật Tri mẫu, có nhi u lợi ích cho sức khỏe con người Các nghiên cứu v hoạt tính sinh học của loài Tri mẫu đã chứng minh các tác dụng có lợi trên mức cho estero trong máu ung thư sức khỏe củ xương v ích thích hệ miễn d ch Trong đ đáng chú hơn cả là tác dụng ức chế tế o ung thư tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệmvà tác dụng hạ đường huyết

1.4.1.1 Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ

Khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết của tế bào tự hủy từ loại thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày là một nghiên cứu quan trọng đượcYoshio Takeda và các cộng sự [40] đư ra vào năm 2001 Sau khi kết thúc quá trình nghiên cứu, Yoshio Takeda và các cộng sự kết luận rằng Tri mẫu có khả

năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây ra quá

trình tự chết của tế bào này

Hợp ch t Timosaponin A-III (1)một saponin phân lập từ thân rễ của Tri mẫu

có ti m năng được phát triển như là một tác nhân chống ung thư với dòng tế bào HeLa đượcChi-Ming Che và các cộng sự[18] chỉ ra Bên cạnh đ ch t n y cũng thể hiện khả năng ức chế nhi u tế o ung thư như: ung thư iểu bì (SUNE-1 ung thư g n HepG2 ung thư vú M F-7) vớicác giá tr IC50 dao động từ 8.5 - 10.1 (μmol/l)

1.4.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ

OU Yang Shi và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của timosaponin đến khả năng cải thiện trí nhớ trên chuột được OUYang Shi và các cộng sự nghiên cứu vào

năm 2005 thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương β-amyloid peptide (Aβ) Aβ

có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm trọng, nó làm hạ th p hoạt động superoxide dismutase (SOD) và khả năng chống oxy h cũng như tăng mức độ malonaldehyde (MDA) trong tế bào So sánh giữa những con chuột nh thường với những con chuột được tác động bởi timosaponin thì th y những con chuột sau khi được xử lí bởi các hợp ch t timosaponin(12), Timosaponin E1(16), timosaponin J(36) thì hoạt động SOD và khả năng oxy h được nâng c o đồng thời mức độ MDA

giảm Từ đ cho th y các timosaponin có thể nâng c o đáng ể năng ực trí nhớ ở chuột thí nghiệm

Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t saponin được chỉ ra trong các nghiên cứu gần đây của Cheng và các cộng sự[20] v o năm

2016 Các giá tr IC50 (μM được ghi nhận như s u: hợp ch t Timosaponin A-III (1):

IC50 = 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1: IC50>

100, hợp ch t timosaponin (12) > 100 Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42

trên tế bào N2A-APPswe củ các s ponin tương đối tốt, nh t là hợp ch t Timosaponin A-III (1)

Hợp ch t (1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân gây bệnh zheimer để cải thiện trí nhớ được Dong và các cộng sự (2009) chỉ ra ơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của ch t này có thể được giải thích bằng sự chống

viêm củ n N cũng thể hiện khả năng ức chế sự truy n dẫn tín hiệu NF-kB trong tế

bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm đây một trong những thành tố có ảnh hưởng lớn đến sự m t trí nhớ

Ngoài ra, d ch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng sự

đư r ết quả nghiên cứu v khả năng ảo vệ tế o não v o năm 2007

Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi b tắc ở động mạch não phải D ch chiết tổng

số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng ể sự xâm nhập bạch cầu của các mô não thiếu máu cục bộ đi u n y được xác đ nh dựa trên hoạt động của enzym MPO MPO

đã giảm đáng ể khi dùng d ch chiết từ loài Tri mẫu trong vùng thể vân và vỏ não Những phát hiện n y đ ng một vai trò r t quan trọng trong việc đi u tr ch n thương não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán o i Tri mẫu có thể là một loại thảo dược chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não sau khi b tổn thương do thiếu máu cục bộ

1.4.1.3 Tác dụng hạ đường huyết

Một chế phẩm cổ truy n được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử nghiệm trên chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ thuộc insulin) Chế phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt KK-Ay từ 557 ± 17 xuống

383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho uống một li u thuốc (P < 0,001) Thuốc cũng m giảm đường máu v m tăng sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần sau khi cho uống những li u l p lại trên chuột nhắt KK - Ay

D ch chiết etanol của Tri mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin củ đảo tụy ở chuột nh thường và chuột đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) đã được Hoa và các cộng sự chứng minh v o năm 2004

1.4.1.4 Một số hoạt tính sinh học khác

Các hợp ch t s ponin được phân lập từ các d ch chiết etanol và d ch chiết nước

từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây bệnh tay chân miệng đi u n y được đư r trong nghi n cứu của Liu và cộng sự v o năm 2014 Trong số các saponin, hợp ch t timosaponin B-II (12) có chỉ số IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI

ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17) ức chế đáng ể

N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide Ngoài ra, protein tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng ể trong bạch cầu củ con người khi dùng hợp ch t timosaponin E1 (16) và timosaponin E2 (17)

Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm ti m tàng Kết quả nghiên cứu cho th y tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại thực bào RAW

264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB thông qu con đường kích hoạt p38 MAP.[12]

Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu đi u tr hiệu quả sự oãng xương ở chuột thông qua sự hình thành xương nhưng hông ức chế sự tái h p thu xương[8] và còn có tác dụng chống oxi hóa.[28]

1.4.2 Hoạt tính sinh học của các aglycon

Aglyconsarsasapogenin (44) hung cơ ản nh t của loài Tri mẫu Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglyconsarsasapogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học Khả năng ảo vệ tế o não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế o ung thư hoạt tính sinh học điển hình nh t của khung aglycon này

1.4.2.1 Tác dụng bảo vệ tế bào

Khả năng nâng c o trí nhớ của khung aglycon sarsasapogenin được Hu và các

cộng sự[37] thử trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương my oid

β-peptide, kết quả cho th y nhóm thực nghiệm với ch t này có thể cải thiện khả năng nhớ và học tập với nh m đối chứng t crin v o năm 2005

Sự ảnh hưởng củ g ycon n y đến vai trò của phần kết nối vòng AMP REB đối với độ dầy đ c của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình

gi đi n c hả năng nâng c o độ dầy đ c của thụ thể M1 tốt cho các CREB và phosphor- REB để chống lại quá trình lão hóa[10] được Hu và các cộng sự chứng minh v o năm 2010

Năm 2011 W ng v các cộng sự [14] đã chứng minh Sự ảnh hưởng của

s rs s pogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết quả cho th y ch t này có khả năng m tăng sự phát triển của các tế bào thần kinh hình cây trên vỏ não với các nồng độ hác nh u thông qu con đường kích thích PI3K/Akt/mTOR được Wang và các cộng sự[14] chứng minh v o năm 2011 Đi u này r t tốt cho việc bảo vệ tế bào và kích thích sự ghi nhớ

Yue [43] cùng cộng sự đã nghi n cứu thực nghiệm và chứng minh rằng Sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động gây tổn thương của axit glutamic, kết quả cũng cho th y ch t này có khả năng ảo vệ tế bào này thông

qu con đường kích hoạt sự truy n dẫn thông tin của PI3K/Akt/mTOR v m tăng

hoạt tính của protein caspase-3 và μ-c p in đượcYue [43] và cộng sự nghiên cứu thực

nghiệm và chứng minh v o năm 2012

Khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp ch t aglycon được Cheng và các cộng sự[20] cũng chỉ r v o năm 2016 ác giá tr IC50 (μM được ghi nhận như s u: hợp ch t sarsasapogenin (44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp ch t được bán tổng hợp từ (44) là (48), (49), (53), (54), (55) có giá tr IC50 lần ượt là: 6.5±2.1, 27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5, 7.3±4.0 Còn các hợp ch t g ycon hác như: tigogenin, smi genin… c giá tr IC50 > 100 Kết quả trên cho th y khả năng ức chế Aβ42 trên

tế bào N2A-APPswe củ các g ycon tương đối tốt, nh t là các dẫn xu t được bán tổng hợp từ ch t sarsasapogenin

1.4.2.2 Tác dụng ức chế tế b o ung thƣ

Khả năng ức chế tế o ung thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin thông qua việc gây ra sự chết của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào trong ph G2/M được Trouillas và cộng sự chứng minh v o năm 2005[29]

Vai trò cần cho sự sống trong việc gây chết tế o ung thư HepG2 v HeL đượcNi và cộng sự [42] chứng minh v o năm 2008 Kết quả cho th y rằng, sarsasapogenin thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích hoạt quá trình tự chết của tế o v cytochrome được giải phóng nhi u hơn từ đ ước đầu kết luận sarsasapogenin có khả năng gây r quá tr nh tự chết tế bào HepG2 Bao và cộng sự[35] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và thời gian vào khả năng sống được của tế bào HepG2

Sarsasapogenin có thể ức chế khối u trong các thực nghiệm in vitro v cũng c

thể ức chế tế o ung thư HeL gây r ởi các quá tr nh oxi h stress được Shen và cộng sự [34] chứng minh v o năm 2013

1.4.2.3 Một số hoạt tính sinh học khác

Những ảnh hưởng củ s rs s pogenin được phân lập từ loài Tri mẫu đến hoạt động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tr c t n mô h nh ơi cưỡng bức the forced swimming được tìm ra từ mục đích nghi n cứu của Wu và các cộng sự[38] đư r v o năm 2006 Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm bằng

po yc r on te c o 25cm đường ính 10 cm nước (24o được cho v o nh đến mức 15cm Chuột thí nghiệm được cho uống s rs s pogenin 60 phút trước khi làm thí nghiệm Chuột được đ t vào bình và thử nghiệm trong 6 phút Cho chuột ơi tự

do trong 2 phút đầu và từ phút thứ 3, thời gian b t động của chuột được ghi nhận

Kết quả cho th y khi dùng sarsasapogenin với li u 12.5, 25 và 50 mg/ kg thì giảm thời gian b t động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7% (p< 0,05)

và 48,7% (p<0,01) Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm ti m năng của sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng v tâm í dược lý, hóa học và các tài liệu v thần kinh

Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt Phân đoạn saponin từ thân rễ tri mẫu và sản phẩm thủy phân s rs s pogenin cũng như dẫn ch t hemisuciny đ u có