Công nghệ nuôi cấy tế bào và ứng dụng trong y tế

Các dòng tế bào- Tế bào sơ cấp - Tế bào bất tử Tế bào sơ cấp • Được phân lập trực tiếp từ cơ quan hay mô • Phân chia giới hạn trong môi trường nuôi cấy • Trong môi trường nuôi cấy phù hợ

Trang 1

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH Y TẾ

Trang 2

Mục tiêu

1 Trình bày được mục tiêu của nuôi cấy tế bào

2 Nêu được các yêu cầu kỹ thuật chính của công

nghệ nuôi cấy tế bào

3 Trình bày được ứng dụng của công nghệ nuôi cấy

tế bào trong ngành y tế

Trang 3

Công nghệ nuôi cấy tế bào

Trang 4

Khái niệm tế bào

Trang 5

Biệt hóa mô ở người

Trang 6

Embryonic Germ Layer Differentiated Tissue

Endoderm

Thymus Thyroid, parathyroid glands Larynx, trachea, lung

Urinary bladder, vagina, urethra Gastrointestinal (GI) organs (liver, pancreas) Lining of the GI tract

Lining of the respiratory tract

Mesoderm

Bone marrow (blood) Adrenal cortex

Lymphatic tissue Skeletal, smooth, and cardiac muscle Connective tissues (including bone, cartilage) Urogenital system

Heart and blood vessels (vascular system)

Ectoderm

Skin Neural tissue (neuroectoderm) Adrenal medulla

Pituitary gland Connective tissue of the head and face Eyes, ears

Trang 7

Khái niệm

Trang 8

Khái niệm

Là quá trình nuôi cấy tế bào của tế bào nhân thật đa

bào, đặc biệt là tế bào động vật

- Vaccin bại liệt là vaccin đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ nuôi cấy tế bào

Trang 9

Nhu cầu tế bào nuôi cấy

Cell culture and upstream processing( Michael Butler )

Trang 10

Mục tiêu nuôi cấy tế bào

- Sử dụng tế bào để sản xuất các protein ứng dụng

trong trị liệu, các vaccin tiểu đơn vị và các kháng thể

- Dùng làm tế bào vật chủ để nuôi cấy virus dùng trong liệu pháp gen và vaccin virus

Trang 11

- Các tế bào bình thường, tế bào ung thư hay tế bào

gốc được nuôi cấy cho mục đích nghiên cứu khoa học, nghiên cứu dược phẩm:

• Nghiên cứu tế bào trong các điều kiện nuôi cấy xác định  xác định sự ảnh hưởng của các điều kiện đến chức năng tế bào

• Nghiên cứu chức năng sinh lý và các quá trình sinh hóa của tế bào  hiểu được chuyển hóa tế bào và chu kỳ tế bào

Trang 12

Trang 13

Một số khó khăn trong nuôi cấy tế bào

- Môi trường nuôi cấy thường bị nhiễm vi khuẩn hay

nấm

- Tế bào phải được cấy chuyển thường xuyên để kiểm soát mật độ tế bào

- Môi trường luôn cần được thay đổi để tránh nhiễm, tích

tụ chất độc và cung cấp chất dinh dưỡng

Trang 14

Các dòng tế bào

- Tế bào sơ cấp

- Tế bào bất tử

Tế bào sơ cấp

• Được phân lập trực tiếp từ cơ quan hay mô

• Phân chia giới hạn trong môi trường nuôi cấy

• Trong môi trường nuôi cấy phù hợp, có thể tồn tại một thời gian nhưng không thể tăng trưởng  già và chết

• Chỉ có thể được cấy chuyển một số lần hạn chế

Trang 15

Tế bào sơ cấp

- Mục đích nuôi cấy tế bào sơ cấp:

• Có đặc điểm sinh lý giống tế bào in vivo, không

quan sát được ở các dòng tế bào nuôi cấy

• Các dòng tế bào sau thời gian nuôi cấy có thể thay đổi kiểu hình và kiểu gen  kết quả thí nghiệm thay đổi

Trang 16

Tế bào bất tử (tế bào liên tục)

- Có thể tăng trưởng và phân chia không ngừng khi

được cung cấp môi trường phù hợp

- Có thể có / hoặc không có nguồn gốc từ mô ung thư

- Có thể có do ngẫu nhiên hay do quá trình bất tử hóa nhờ:

• Các chất gây ung thư

• Nhiễm virus

• Đưa gen của virus hay gen ung thư vào bộ gen tế bào

Trang 17

Ưu thế của dòng tế bào bất tử

- Phát triển nhanh hơn  đạt được mật độ tế bào cao hơn

- Có thể nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, không

chứa huyết thanh hay protein

- Cho kết quả thí nghiệm ổn định hơn so với tế bào thứ cấp

- Có thể nuôi cấy trong nồi lên men qui mô lớn

Trang 18

Nhược điểm của dòng tế bào bất tử

- Bộ gen thay đổi

- Có nhiều biến dị kiểu hình so với tế bào ban đầu

- Một số đặc điểm đặc trưng có thể bị biến mất

Trang 19

Tạo dòng tế bào bất tử

Một số phương pháp bất tử hóa để thu dòng tế bào liên tục:

- Nhiễm các gen virus

• Gen kháng nguyên T của virus Simian 40 (SV40)

• Gen E6 và E7 của virus human papilloma (HPV)

- Nhiễm virus: virus Epstein-Barr (EBV), retrovirus

một số kiểu hình của tế bào ban đầu bị mất

Trang 21

Tạo dòng tế bào bất tử

Tế bào bình thường

TERT không biểu hiện

Thu ngắn chiều dài

Trang 22

Môi trường nuôi cấy tế bào

Trang 23

Môi trường nuôi cấy tế bào đảm bảo các điều kiện

Trang 24

Môi trường nuôi cấy gồm hai phần chính:

• Chứa yếu tố khác cần cho sự tăng trưởng tế bào

- Kháng sinh và kháng nấm để ngăn ngoại nhiễm

Trang 25

Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được chọn dựa trên:

- Loại tế bào

- Mục đích nuôi cấy:

• Tăng trưởng tế bào

• Biệt hóa tế bào

• Thu hoạch sản phẩm: protein, enzym

Trang 26

Phân loại môi trường nuôi cấy theo mục đích

- Môi trường duy trì:

• Đảm bảo tế bào còn nguyên vẹn về cấu trúc và chuyển hóa

• Không kích thích tế bào phân chia

- Môi trường phát triển:

• Chứa các yếu tố cần thiết để tế bào phân chia và gia tăng số lượng

Trang 27

Phân loại môi trường nuôi cấy theo thành phần

Môi trường nuôi cấy gồm 2 loại cơ bản:

- Môi trường tự nhiên

• Dịch sinh học: huyết tương, huyết thanh, bạch huyết hoặc nước ối

• Mô chiết tách: mô gan, lách, tủy xương nhưng phổ biến nhất là mô chiết tách từ phôi gà

• Huyết tương đông vón

• Mô bò chiết tách từ phôi bò 10 ngày tuổi

 Có thành phần không xác định  khó đảm bảo sự

đồng nhất giữa các lô

Trang 28

Các loại môi trường nuôi cấy

- Môi trường nhân tạo bổ sung một số chất tự nhiên

• Chứa một phần hay toàn bộ các thành phần xác

Trang 29

Ưu nhược điểm của các loại môi trường nuôi cấy

- Ưu nhược điểm của môi trường có huyết thanh

Ưu điểm:

• Phù hợp và tiện lợi đối với nhiều loại tế bào

• Chứa nhiều hormon, yếu tố tăng trưởng  thúc đẩy

tế bào tăng trưởng và có chức năng

• Có khả năng vận chuyển hormon, vitamin, chất

khoáng, chất béo và các chất sinh học khác

• Giảm thiểu sự hư hại cơ học cho tế bào

• Có vai trò là hệ đệm tự nhiên giúp duy trì pH ~ 7

Trang 30

Ưu nhược điểm của môi trường có huyết thanh

Trang 31

Ưu nhược điểm của môi trường có huyết thanh

Trang 32

Ưu nhược điểm của môi trường không có huyết thanh

Nhược điểm:

• Tế bào tăng trưởng chậm

• Tế bào cần hơn một loại môi trường để thu được sản phẩm

• Các yếu tố môi trường sử dụng phải tinh khiết

• Không có sẵn

Trang 33

Các thành phần chính của môi trường nuôi cấy

- Nước

• Cần đạt tiêu chuẩn nước pha tiêm

• Không chứa các yếu tố ức chế sự phát triển của tế bào như kim loại nặng, calci, chloro, sắt, độc tố, chất gây sốt, các phần tử rắn không tan

Trang 34

- Carbon

• Glucose là nguồn cung cấp carbon và năng lượng (5-25 mM)

• Có thể dùng mannose, fructose, galactose, maltose

• Glucose chuyển hóa không hoàn toàn  sinh

lactate  ức chế sự tăng trưởng tế bào

 dùng nguồn carbon khác: mannose, fructose,

galactose, maltose  giảm lượng lactate

Trang 35

- Acid amin

• Các acid amin phải được cung cấp đầy đủ (0,1- 1 mM):

 Hỗn hợp dạng tinh khiết

 Dịch thủy phân protein

 Cao chiết nấm men

• Các acid amin quan trọng: glutamine (1-5 mM), methionine, serine

- Vitamin

• Nhiều tế bào cần bổ sung các vitamin nhóm B,

biotin, acid folic, niacin, acid panthotenic, thiamine, acid ascorbic, vitamin A, D, E, K

• Nguồn cung cấp: huyết thanh, cao nấm men

Trang 36

-• Đối với kiểu nuôi cấy dịch treo, nồng độ Mg2+, Ca2+

cần thấp để ngăn tế bào kết tập hay dính lại

Trang 37

- Huyết thanh

• Nguồn cung cấp: bê hay phôi bò

• Thành phần: acid amin, yếu tố tăng trưởng, vitamin, protein, hormon, chất béo, chất khoáng

• Nồng độ sử dụng: 2 - 20%

- Các thành phần quan trọng khác

• Yếu tố tăng trưởng

- FGF (Fibroblast Growth Factor)

- EGF (Epidermal Growth Factor)

- NGF (Nerve Growth Factor)

- Các đồng đẳng của isulin IGF-1, IGF-2

• Các yếu tố kích thích sự dính bề mặt: fibronectin,

laminin

Trang 38

- Kháng sinh

• Mục đích: ngăn chặn nhiễm vi sinh vật

• Các kháng sinh thường dùng: penicillin,

streptomycin, amphotericin B

• Nồng độ sử dụng giới hạn để tránh gây độc tính tế bào

Trang 39

Thiết bị nuôi cấy tế bào

Yêu cầu chung của nồi lên men tế bào:

- Kiểm soát được pH môi trường nuôi cấy

- Kiểm soát được nhiệt độ

- Đảm bảo cung cấp oxy và loại bỏ carbon dioxid

- Cung cấp chất dinh dưỡng trong suốt quá trình nuôi cấy

- Cung cấp đủ bề mặt cần thiết để tế bào bám trong

trường hợp nuôi cấy dòng tế bào phụ thuộc bề mặt

- Đảm bảo vô trùng, tránh nhiễm vi sinh vật, virus và tế bào khác

Trang 40

Buồng cấy vô trùng

Trang 41

Bình nuôi cấy tế bào qui mô nhỏ

Túi nuôi cấy

50 ml

10 8 tế bào/ml

Trang 42

Bình nuôi cấy tế bào qui mô nhỏ

Bình nuôi cấy kiểu sóng

Bình quay

Trang 43

Kiểu nồi sợi rỗng

http://www.fibercellsystems.com/advantage.htm

http://www.bb.ustc.edu.cn

Trang 44

Trang 45

Nhược điểm của kiểu nồi sợi rỗng:

- Do bản chất của thành sợi  có khả năng bám dính tốt đối với tế bào dạng treo, nhưng không tốt đối với tế bào bám dính

- Do khả năng bắt giữ tế bào  trong quá trình nuôi cấy không thể kiểm tra các chỉ số như mật độ tế bào sống  dựa vào thông số thay thế (VD: chỉ số lactate)  bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: dòng tế bào, nhiệt độ, pH, pha tăng trưởng,…

- Thích hợp với sản xuất các sản phẩm chuyển hóa,

không phù hợp với sản xuất sinh khối do khó tách tế bào

Trang 46

Một số khó khăn trong nuôi cấy tế bào qui mô lớn

1 Nhu cầu oxy

2 Cung cấp chất dinh dưỡng

3 Xử lý sản phẩm phụ

4 Một số khó khăn khác liên quan: quá trình làm lạnh, tiệt trùng, cung cấp môi trường

Trang 47

nóng-Một số kiểu bình và nồi nuôi cấy tế bào

• Nuôi cấy có khuấy trộn

 Kiểu nuôi cấy

• Đồng nhất

• Không đồng nhất

Trang 48

Một số kiểu bình và nồi nuôi cấy tế bào

• Dùng để nhân giống cho bình nuôi cấy lớn

• Không được trang bị đầu dò, thiết bị thông khí

 chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn

Trang 49

- Bình quay qui mô nhỏ:

• Thể tích ~ 2,5 l

• Có thể bằng thủy tinh sử dụng nhiều lần hoặc nhựa dùng 1 lần

• Cách vận hành:

 Đặt bình vào trục quay và điều chỉnh tốc độ quay (0,2-0,4 rpm)  tế bào bám vào bề mặt trong của bình

 Bổ sung môi trường 8-15% thể tích bình, vận tốc quay 0,16 rpm

0,08- Độ thông khí của hệ thống hiệu quả, khuyến cáo tỉ lệ thể tích khí / môi trường  1/5

Trang 50

• Có thể vận hành gián đoạn hay liên tục

• Cấu tạo bằng thủy tinh, nhựa hoặc thép không rỉ

Trang 51

- Nuôi cấy tĩnh:

• Không khuấy trộn  thông khí nhờ khuếch tán oxi qua bề mặt thoáng  qui mô nuôi cấy giới hạn

- Kiểu thùng khuấy:

• Khuấy nhờ chân vịt hoặc cánh khuấy

• Thông khí nhờ đầu phun khí đặt ở đáy nồi

• Qui mô có thể đạt 20.000 l

Trang 52

-Kiểu thùng khuấy

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Bioreactor_principle.svg

Trang 53

- Kiểu trộn bằng dòng khí:

• Nồi được thiết kế thành 2 vùng

• Khí phun từ dưới lên ở vùng giữa

 khuấy trộn môi trường giữa 2 vùng

Trang 55

-Một số kiểu bình và nồi nuôi cấy tế bào

- Nuôi cấy đồng nhất:

• Tế bào tự do trong môi trường  các điều kiện lý hóa được kiểm soát dễ dàng và giống nhau tại các vị trí khác nhau trong nồi

• Áp dụng nuôi cấy tế bào không phụ thuộc bề mặt

Trang 56

- Nuôi cấy không đồng nhất:

• Gia tăng diện tích bề mặt  áp dụng nuôi cấy tế bào phụ thuộc bề mặt

VD: 1 g chất mang đường kính 0.2 mm có tổng diện tích bề mặt > 6.000 cm2

• Giá mang vi thể có thể bằng dextran, polyacrylide, polystyren

Trang 57

Tế bào phụ thuộc bề mặt

Tế bào bám vào polymer

http://mix.msfc.nasa.gov/abstracts.php?p=149

Trang 58

Tế bào phụ thuộc bề mặt

http://www.percell.se/principles40.gif

Trang 59

 Bề mặt gồ ghề: dùng nuôi cấy tế bào dạng treo

• Tế bào được bơm vào ống sứ trước khi cung cấp môi trường  tế bào bám dính bề mặt

• Thường áp dụng để sản xuất protein trong 1 quá

trình dài

Trang 60

Một số phương pháp cố định tế bào

- Lưu giữ tế bào:

• Tế bào được lưu giữ trong các polymer  bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân cơ học

• Tế bào được trộn với natri alginat  dung dịch

CaCl2  hình thành hạt canxi alginat  bắt giữ tế

bào

• Có thể sử dụng agarose, alginat nuôi cấy tế bào

dạng treo

Trang 61

- Lưu giữ tế bào

Bắt giữ tế bào bằng alginate

Trang 62

- Lưu giữ tế bào:

• Có thể sử dụng hạt collagen: tế bào xuyên qua các

lỗ và cư trú tại các hạt

 Collagen gia tăng tính bám dính của tế bào không cần giá mang

• Có thể sử dụng hạt fibrin:

Fibrinogen + thrombin  hạt fribin

 Áp dụng nuôi cấy tế bào không cần giá mang và

tế bào dạng treo

Trang 63

- Lưu giữ tế bào

Hạt collagen

Trang 64

- Bao tế bào:

• Tế bào bao bởi màng được tạo bởi phức hợp

polyacrylate có bề mặt điện tích âm và polyacrylate

có bề mặt điện tích dương

• Tế bào bao bởi màng sulfat cellulose

Trang 65

Một số phương pháp nuôi cấy tế bào

Trang 66

Ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào

Trang 67

Ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào

Trang 68

Trang 69

- Sản xuất protein:

• Các cytokine (interferon, interleukine)

• Các yếu tố tạo máu: VD erythropoietin (EPO)

• Hormon tăng trưởng

Trang 70

- Liệu pháp tế bào

• Dùng để sửa chữa hay thay thế mô hư hỏng

• Tế bào gốc được quan tâm:

 Khả năng biệt hóa thành các tế bào khác nhau

 được nuôi cấy và biệt hóa thành tế bào đích  dùng để cấy ghép hoặc thay thế mà không bị đào thải

Trang 71

Liệu pháp tế bào và bệnh parkinson

Trang 72

Trang 73

Trang 74

- Liệu pháp gen và vaccin ADN

• Đưa gen vào tế bào sinh dưỡng  biểu hiện trong

cơ thể

- Công cụ sàng lọc và phát triển dược phẩm mới

• Tế bào nuôi cấy dùng cho các thử nghiệm sàng lọc,

đánh giá độc tính in-vitro  thử nghiệm thuốc không

dùng súc vật

Trang 75

Bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào

1.Khu vực làm việc vô khuẩn

- Phòng thí nghiệm riêng, nếu không thì bố trí ở khu vực

ít qua lại  hạn chế nhiễm các phần tử bụi và vi sinh

Trang 76

- Khu vực cất giữ dụng cụ thí nghiệm

- Tủ lạnh để bảo quản môi trường, huyết thanh

- Nitơ lỏng để bảo quản tế bào

Trang 77

4 Tủ ấp

- Nên đặt cạnh tủ cấy vô trùng hoặc khu vực làm việc

vô trùng

5 Tủ cấy vô trùng

6 Vệ sinh và vô khuẩn

Máy rửa dụng cụ, lò hấp, lò tiệt khuẩn

Định dạng
Số trang	77
Dung lượng	4,2 MB