Công nghệ enzym và protein

Công nghệ enzym hiện đại Hóa học protein  Lý sinh phân tử  Sinh học phân tử  Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym  Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym... Nhu cầu sử dụng en

Công nghệ Enzym

- Protein

 Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩm sữa

 Tẩy rửa: protease, lipase

 Xử lý tinh bột: các amylase, isomerase

 Dệt-da: amylase, lipase, cellulase

 Y Dược

 Trợ tiêu hóa: amylase, protease

 Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase, Glucose oxidase, Uricase

 Điều trị: Asparaginase, Lactamase, Urease, Uricase, Streptokinase

 Hóa dược: Steroid, Ibuprofen, Salbutamol, Propanolol

 Nghiên cứu: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase,

Ligase

Khái niệm xúc tác sinh học

 Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học,

ứng khác có sự thay đổi năng lượng tự do

thuận lợi hơn

 Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều

kiện bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH

Công nghệ enzym hiện đại

 Hóa học protein

 Lý sinh phân tử

 Sinh học phân tử

 Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym

 Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym

Nhu cầu sử dụng enzym

Chỉ tiêu Công nghiệp Phân tích Dược phẩm

Tinh thể tinh khiết

Tinh thể tinh khiết

Nguồn

gốc Vi sinh vật, thường ngoại

bào

Vi sinh vật, động vật, thực vật, thường nội bào

Vi sinh vật, động vật, thực vật, thường nội bào

Giá sản

xuất Thấp Trung bình Cao

Xúc tác sinh học

 Tính chọn lọc cao

 Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học

 Chọn lọc không gian

 Hoạt động trên cơ chất đa dạng

 Hoạt động được trong môi trường không phải

là nước

 Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao

 Có độ bền đủ cao

 Tính kinh tế

Tính chọn lọc theo vị trí

Tính chọn lọc không gian

Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

 Chiết tách từ mô: lysozym, papain, bromelin, …

 Lên men bề mặt: amylase, protease nấm mốc

 Lên men chìm: các enzym dùng trong phân tích

và y học

 Chủng được chọn lọc thông qua biến đổi di truyền

 Tăng hoạt tính

 Tính ổn định

 Nhiệt độ, pH tối ưu

 Chuyển gen sản xuất enzym vào các ký chủ dễ nuôi cấy

Phương pháp sản xuất - Tổng quát

Chuẩn bị nguyên liệu

Chiết tách

Cô đặc Tinh chế Hoàn chỉnh sản phẩm

Chuẩn bị nguyên liệu sinh học

 Cơ quan động vật

 Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh

 Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý

 Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với

dung dịch đệm

 Enzym để phá vỡ tế bào

 Nguyên liệu thực vật

 Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm

 Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với

enzym.

 Vi sinh vật

 Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men

 Nội bào: phá vỡ tế bào

Hóa học: chất tẩy, kháng sinh     

Enzym: lysozyme, kháng sinh

French-press

Sản xuất enzym - Chiết tách

 lọc áp suất, lọc chân không

 lọc chảy qua (cross-flow filtration)

 Phương pháp kết bông

Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực

Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích

Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử

Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử

Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử

Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực

Đánh bắt ion kim Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử

Nguyên lý Sắc ký

Nguyên lý Sắc ký

Chọn Phương pháp sắc ký

GF = Lọc gel

AC = Sắc ký Ái lực IEX = Sắc ký Trao đổi Ion HIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước RPC = Sắc ký Pha đảo

Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ

Dịch Enzym thô

Phức Enzym Alginat natri

Tủa Enzym Alginat Calci

Alginat Calci

Sản phẩm amylase

• Cô đặc

• Thẩm tích

Ví dụ sản xuất Taq polymerase

Thermus aquaticus

hay E.coli tái tổ hợp

Môi trường

Lên men Thu tế bào Phá tế bào Tủa (NH4)2SO4Thẩm phân

Cột DEAE Cột Hydroxyapatide

Cột DEAE Cột phosphocellulose Taq polymerase tinh khiết

Môi trường thừa

Xác tế bào

Dịch nổi

chức sản xuất ở mức độ tự động hóa cao.

phẩm cuối

cùng loại

 Nhược điểm

 Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.

 Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.

Vật liệu cố định

 Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp

 Chất mang phải có tính cơ lý ổn định

 Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không hòa tan trong môi trường phản ứng

 Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn

 Có khả năng trương nở trong môi trường

Cố định thuận nghịch

Cố định không thuận nghịch

Ứng dụng enzym trong ngành dược

 Liệu pháp enzym

 Enzym trong sản xuất thuốc

 Dùng trong điều trị hỗ trợ khi

phối hợp với các liệu pháp khác, hay để giải độc máu hay mô.

Liệu pháp enzym - Yêu cầu của

tiêm bắp hay dưới da.

enzym được dùng Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh

Các vấn đề của thuốc protein

 Thời gian phát triển ngắn

Tỷ lệ thành công khi xin cấp phép cao

Nguồn enzym

 Chiết xuất - Tinh chế:

 Không phải người: nấm, vi khuẩn, động vật, thực vật

 Gây miễn dịch

 Dùng ngoài

 Yêu cầu thấp

 Người

 Giới hạn công suất, nguyên liệu hạn chế

 Nhiễm virus và các yếu tố gây bệnh khác

 Tái tổ hợp

 Sử dụng gen người tái tổ hợp trong tế bào khác

 Cải thiện hoạt tính, đặc điểm thông qua cải tiến trình tự

 Năng suất cao

 Không thực hiện được biến đổi hậu dịch mã

 Sinh vật chuyển gen

 Liệu pháp gen

Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym

cnshduoc@gmail.com`

Thuốc đối quang

 Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể

 Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính,

 Các đồng phân có hoạt tính khác nhau

 Dược động học và chuyển hóa khác nhau

 Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure

 Bản quyền đồng phân

Thuốc đối quang

Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân

Thuốc chẹn β:

propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol,

betaxolol, carvedilol, meto prolol, labetalol, pindolol,

sotalol, …

l > d (d = không có hoạt tính)

Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol

Thuốc chẹn kênh calci:

verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine,

felodipine, mandipine …

l > d

Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil

Thuốc giãn phế quản:

albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline l > d (d = không có hoạt tính) Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol

An thần:

hexobarbital, secobarbital, mephobarbital,

pentobarbital, thiopental, thiohexital

l > d

Ví dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital

Thuốc gây mê:

ketamine, isoflurane d > l (l = không có hoạt tính) Ví dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamine

S(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone Kháng viêm không steroid:

ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen d > l Ví dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofen

An thần: nhóm 3-hydroxy-benzodiazepines: d > l (l = không có hoạt tính)

Thuốc đối quang - racemic

Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym

Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác

Một số vấn đề công nghệ

định hoặc hoạt tính

thuận nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và

có biện pháp thích hợp

cần được tính toán khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng

cao hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất khó có thể thực hiện được.

hưởng của dung môi đến hoạt tính cần được xem xét.

Lựa chọn nồi phản ứng

A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có tuần hoàn; C: thùng khuấy có siêu lọc;

 Enzym thô từ dịch chiết tế bào

 Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C

Lipase

Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần)

Thuốc chống trầm cảm

Thuốc kháng viêm không steroid

Amidase

Deaminase

Thuốc kháng virus (HBV, HIV)

Lyase

Vitamin B3