Xây dựng hệ thống nuôi cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây thanh hao (artemisia annua linn)

Nuôi cấy rễ chuyển gen và ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp .... Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp..

PHẠM THẾ ANH

XÂY DỰNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TÓC VÀ ỨNG

DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT

ARTEMISININ Ở CÂY THANH HAO (ARTEMISIA

ANNUA LINN)

Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật

Mã số: 6042302

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS TRẦN VĂN MINH

2 TS NGUYỄN THỊ THANH

TP Hồ Chí Minh – 2010

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ba, má – Người đã sinh thành, dạy dỗ, yêu thương, chăm sóc và lo lắng cho tôi; cùng mọi thành viên trong gia đình đã chia sẽ, động viên tôi trong học tập

và trong cuộc sống

Thầy PGS.TS Trần Văn Minh, Cô TS Nguyễn Thị Thanh đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến cố GS TS Mai Trần Ngọc Tiếng, PGS TS Bùi Trang Việt, PGS.TS Võ Thị Bạch Mai, TS Nguyễn Du Sanh Các quý Thầy, Cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian học tại trường

Cảm ơn các quý thầy cô, các anh chị, các bạn, các em ở Bộ môn sinh lý thực vật - trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận văn tại Bộ môn

Cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này

Cảm ơn tập thể lớp cao học SLTVK17, cảm ơn các anh, chị, các bạn đã giúp đỡ tôi trong ba năm học vừa qua

Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, bạn Lê Thị Hiền, bạn Trần Trọng Tuấn, cùng các anh chị, các bạn Phòng Công nghệ phôi soma - Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

Cảm ơn các đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẽ và động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong công việc và cuộc sống

Phạm Thế Anh

MỤC LỤC

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục biểu đồ viii

Danh mục hình ix

Danh mục ảnh x

Lời mở đầu 1

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét 3

1.1.1 Cây Thanh hao Artemisia annua 3

1.1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.1.2 Đặc điểm phân bố 3

1.1.1.3 Đặc điểm sinh thái 4

1.1.1.3.1 Điều kiện sống 4

1.1.1.3.2 Vòng đời 4

1.1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.2 Tổng quan về bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị 6

1.1.2.1 Sơ lược về bệnh sốt rét 6

1.1.2.2 Artemisinin công cụ chữa bệnh sốt rét hiện nay 7

1.2 Sinh tổng hợp artemisinin 8

1.3 Tổng quan về chuyển gen tạo rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp 11

1.3.1 Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc 11

1.3.1.1 Giới thiệu 11

1.3.1.2 Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ 12

1.3.1.3 Dùng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen vào thực vật 17

1.3.2 Nuôi cấy rễ chuyển gen và ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp 19

1.3.3 Các nguyên lý cơ bản nhằm làm gia tăng quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen 19

1.3.3.1 Chọn lọc dòng rễ có năng suất cao 20

1.3.3.2 Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy 21

1.3.3.3 Elicitor 21

1.3.3.4 Nuôi cấy hai giai đoạn 22

1.3.3.5 Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp 23

1.3.3.5.1 Khái niệm bioreactor 23

1.3.3.5.2 Khó khăn và thuận lợi của nuôi cấy bằng hệ thống bioreactor 24

1.3.3.5.3 Phân loại bioreactor 25

1.3.3.5.4 Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp 26

1.4 Sắc ký lỏng cao áp HPLC 27

1.4.1 Nguyên tắc 27

1.4.2 Thiết bị 28

2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU 29

2.1.1 Nguồn mẫu ban đầu 29

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 29

2.1.3 Dụng cụ thiết bị 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP 29

2.2.1 Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 29

2.2.1.1 Gieo hạt in vitro 29

2.2.1.2 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 29

2.2.1.3 Kiểm tra kết quả chuyển gen 31

2.2.1.3.1 Tách chiết DNA thực vật 31

2.2.1.3.2 Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325 31

2.2.1.3.3 Phân tích PCR kiểm tra quá trình chuyển gen 32

2.2.1.4 Phân tích CĐHSTTV của rễ chuyển gen bằng phương pháp sinh trắc nghiệm 33

2.2.1.5 Định tính artemisinin trong rễ tóc bằng phương pháp TLC 36

2.2.1.5.1 Nguyên tắc 36

2.2.1.5.2 Cách tiến hành 37

2.2.2 Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng lắc 38

2.2.2.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng và tích lũy artemisinin của rễ tóc 39

2.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ đạm nitrat đến khả năng tích tụ artemisinin 39

2.2.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3 đến tích tụ artemisinin 40

2.2.2.4 Ảnh hưởng của photphat vô cơ đến khả năng tích tụ

artemisinin 40

2.2.2.5 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tích tụ artemisinin 40

2.2.2.6 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tích tụ artemisinin 41

2.2.2.7 Môi trường cải tiến 41

2.2.3 Nuôi cấy rễ tóc Thanh hao trong bioreactor ngập chìm tạm thời 41

2.2.3.1 Động thái tăng trưởng của rễ trong bioreactor ngập chìm tạm thời 42

2.2.3.2 Biến động pH của môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 42

2.2.3.3 Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 42

2.2.3.4 Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 42

2.2.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 43

2.2.3.5.1 Chu kỳ ngập chìm trong nuôi cấy bioreactor 43

2.2.3.5.2 Ảnh hưởng của YE và chitosan đến sự tích tụ artemisinin 43

2.2.4 Định lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với bộ phản ứng sau cột và đầu dò UV 43

2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu 43

2.2.4.2 Định lượng artemisinin 44

2.3 XỬ LÝ THỐNG KÊ 45

3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 46

3.1.1 Gieo hạt in vitro 46

3.1.2 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 47

3.1.3 Kiểm tra kết quả chuyển gen 50

3.1.4 Đo hoạt tính CĐHSTTV 52

3.1.5 Định tính artemisinin 54

3.2 Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng 55

3.3 Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 71

4.2 ĐỀ NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

ABA : Abscisic acid

B5 : Môi trường Gamborg và Eveleigh (1968)

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

GA3 : Gibberellic acid

HPLC : High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng

cao áp)

LB : Môi trường Luria Bertani

LV : Môi trường Litvay (1985)

NAA : a-naphthaleneacetic acid

MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962)

PCR : Polymerase Chain Reaction

TLC : Thin layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)

YE : Yeast extract (Dịch chiết nấm men)

WHO : World Health Organization

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46

Biểu đồ 3.2 Hoạt tính Auxin, ABA, Cytokinin và Giberelin tổng ở rễ đối chứng và rễ tóc chuyển gen 52

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của môi trường đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 56

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của đạm nitrate đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 57

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3 đến khả năng tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 58

Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 59

Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 60

Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của GA3 đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 61

Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của môi trường cải tiếnđến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 62

Biểu đồ 3.10 Động thái tăng trưởng của rễ tóc nuôi trong bioreactor ngập chìm tạm thời 63

Biểu đồ 3.11 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 65

Biểu đồ 3.12 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 66

Biểu đồ 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 67

Biểu đồ 3.14 Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 68

Biểu đồ 3.15 Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 69

Biểu đồ 3.16 Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến tích tụ artemisinin 71

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 32

Bảng 2.2 Bảng bố trí các loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm 38

Bảng 2.3 Bảng bố trí các hàm lượng đạm nitrat nuôi cấy thí nghiệm 39

Bảng 2.4 Bảng bố trí các tỷ lệ NH4+/NO3 nuôi cấy thí nghiệm 39

Bảng 2.5 Bảng bố trí các hàm lượng KH2PO4 nuôi cấy thí nghiệm 40

Bảng 2.6 Bảng bố trí các hàm lượng BA nuôi cấy thí nghiệm 40

Bảng 2.7 Bảng bố trí các hàm lượng GA3 nuôi cấy thí nghiệm 41

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46

Bảng 3.2 Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tổng cộng ở rễ tóc chuyển gen và rễ đối chứng 52

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến tích tụ artemisinin 55

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của đạm nitrat đến tích tụ artemisinin 56

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3 đến tích tụ artemisinin 57

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin 58

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin 59

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của GA3 đến tích tụ artemisinin 60

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin 61

Bảng 3.10 Động thái sinh trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62

Bảng 3.11 Biến động của pH môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 64

Bảng 3.12 Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 65

Bảng 3.13 Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 66

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 67

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin 68

Bảng 3 16 Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến khả năng tích tụ artemisinin trong bioreactor 70

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Artemisia annua và cấu trúc hóa học của artemisin 3

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp artemisinin 9

Hình 1.3 Quá trình xâm nhiễm của Agrobacterium 13

Hình 1.4 Cấu trúc Ri-plasmid của A Rhizogenes 15

Hình 1.5 Sơ đồ cảm ứng ra rễ của Agrobacterium 16

Hình 1.6 Quá trình PCR 17

Hình 1.7 Các bước ứng dụng trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tóc chuyển gen 20

DANH MỤC ẢNH

Trang

Ảnh 1 Hệ thống máy HPLC (Waters, Mỹ) 28

Ảnh 3.1 Gieo hạt in vitro 47

Ảnh 3.2 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 48

Ảnh 3.3 Hình thành rễ thứ cấp từ rễ bất định ban đầu 48

Ảnh 3.4 Quá trình hình thành rễ tóc từ mẫu mô lá được chuyển gen 49

Ảnh 3.5 Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolA trên rễ tóc chuyển gen 50

Ảnh 3.6 Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolB trên rễ tóc chuyển gen 51

Ảnh 3.7 Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rol trên rễ tóc chuyển gen 51

Ảnh 3.8 Rễ tóc tăng trưởng trên môi trường thạch MS không bổ sung CĐHSTTV 53

Ảnh 3.9 Phát hiện artemisinin bằng TLC 54

Ảnh 3.10 Tăng trưởng rễ tóc trên môi trường B5, MS và LV 55

Ảnh 3.11 Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường MS và môi trường cải tiến MSI 61

Ảnh 3.12 Động thái tăng trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 63

Ảnh 3.13 Sinh trưởng của rễ tóc trên môi trường MS, MSI và MSII 67

Ảnh 3.14 Chu kỳ nổi và ngập môi trường 69

LỜI MỞ ĐẦU

Sốt rét, một trong những căn bệnh phổ biến nhất ở các nước nhiệt đới, gây ảnh hưởng đến 500 triệu người hàng năm và làm chết hơn một triệu người (WHO, 2004) Chính việc kháng lại thuốc quinoline của ký sinh trùng

Plasmodium falciparum đã làm cho căn bệnh sốt rét ngày càng trở nên khó

kiểm soát (Balint, 2001) Tuy nhiên, ngay nay artemisinin – được chiết xuất từ

Artemisia annua L – đã trở nên phổ biến được xem như phương thức chữa sốt

rét hữu hiệu và an toàn Những nghiên cứu về cấu trúc phân tử cho thấy artemisinin là một sesquiterpene lactone, bên trong có cầu nối endoperoxide

Artemisinin và các dẫn xuất có khả năng chống lại các dòng Plasmodium

falciparum kháng đa thuốc, chủ yếu là ở vùng Đông Nam Châu Á và gần đây là

ở Châu Phi (Meshnick và cs., 1996)

Nguồn artemisinin hiện nay có được là từ việc thu nhận cây Thanh hao ngoài tự nhiên Sản lượng artemisinin tùy thuộc từng mùa và tùy vào từng loại

cá thể Ngoài ra, côn trùng, nấm mốc, vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính của artemisinin Sự tổng hợp artemisinin ngoài cơ thể cũng

đã được xem xét nhưng không hiệu quả do quá phức tạp, hàm lượng lại thấp do

đó không đem lại hiệu quả kinh tế cao Để giải quyết các vấn đề này, việc thu nhận artemisinin thông qua nuôi cấy mô thực vật đã được xem như giải pháp

thay thế đầy hứa hẹn Sự tổng hợp artemisinin in vitro đã được tìm thấy trong

mô sẹo, tế bào dịch huyền phù và nuôi cấy rễ chuyển gen

Nuôi cấy rễ tóc chuyển gen là một hướng mới trong hệ thống nuôi cấy mô

tế bào thực vật, chúng thể hiện nhiều ứng dụng hứa hẹn trong tương lai hơn phương pháp nuôi cây tế bào và mô sẹo truyền thống Điều này được thể hiện qua tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng tổng hợp các chất thứ cấp và có tính

bền vững cao về mặt di truyền và sinh hoá Agrobacterium chuyển gen tạo rễ tóc ở A anua sản xuất artemisinin và gia tăng sinh khối hơn không chuyển gen

nhiều, điều này đã làm cho chúng trở thành một hệ thống tốt để ngiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp

Nhằm mục tiêu giải quyết phần nào tình trạng thiếu thuốc chữa trị sốt rét

hiện nay,chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng hệ thống nuôi

cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh

hao (Artemisia annua Linn)”

Đề tài gồm những nội dung chính sau:

ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh hao

ü Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng

ü Nuôi cấy rễ tóc trên bioreactor ngập chìm tạm thời

1.1 Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét

1.1.1 Cây Thanh hao Artemisia annua

Tên khoa học: Artemisia annua Linn

Tên tiếng Anh: (Sweet/annual) Wormwood, sweet Annie (E)

Tên thông thường: Thanh hao hoa vàng, Thanh cao, Thảo cao, Ngải si, Ngải hôi, Ngải đắng

Hình 1.1 Artemisia annua và cấu trúc hóa học của artemisinin

1.1.1.2 Đặc điểm phân bố

Cây Thanh hao hoa vàng (Artemisisa annua) bắt nguồn từ châu Á (Trung

Quốc, Việt Nam), mọc tốt ở khí hậu ôn đới hay cao nguyên Có thể tìm thấy

chúng ở các cánh đồng, nông trại, bờ rừng, dọc đường, trên bùn gần bờ sông, rạch Hiện nay, Thanh hao là một loại cây rất phổ thông, phân bố ở vùng ôn đới ẩm, cận nhiệt đới và nhiệt đới Bắc bán cầu, gồm một số nước Đông Âu, Bắc Mỹ, Tây Nam Á và Đông Á Ở châu Á, thường gặp cây ở phía nam Liên

Xô cũ, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam…

Ở Việt Nam, theo kết quả điều tra của Viện dược liệu từ năm 1986 – 1990,

đã phát hiện Thanh hao hoa vàng mọc tự nhiên ở 4 tỉnh Trong 15 loài thuộc

chi Artemisia ở Việt Nam, có 4 loài rất giống nhau về hình thái là: Artemisia

apiaceae, A capillaris, A campetris và A annua; trong đó chỉ có A annua có

Ø Ánh sáng: Thanh hao hoa vàng là loại cây ưa sáng và ẩm Trong tự nhiên, có thể thấy cây hơi chịu bóng khi mọc lẫn với một số cây cỏ và cây bụi ở vùng đồi và chân núi đá vôi Theo “Trung dược thông báo” tập 11, số 7, 1986 chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng artemisinin trong lá; độ che bóng càng cao thì hàm lượng hoạt chất này càng giảm

Ø Yêu cầu đất: phạm vi thích ứng rộng, đất giàu dinh dưỡng, thoát nước, tưới tiêu thuận tiện, pH đất = 5,0 – 6,5

1.1.1.3.2 Vòng đời

Hàng năm, từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3, khi nhiệt độ không khí ấm dần lên (16 – 18oC), hạt Thanh hao trong tự nhiên bắt đầu nẩy mầm Trong thời gian từ khoảng 2 – 2,5 tháng đầu, cây con sinh trưởng chậm; trung bình chỉ cao

8 – 10,2 cm/tháng Lúc này, cây chưa có hoạt chất

Khi cây được 3,5 – 4 tháng tuổi là thời kỳ sinh trưởng mạnh, bắt đầu phân cành và có chiều cao đạt trên 1 m, tăng trung bình 15,3 – 17,7 cm/tháng; hàm

lượng hoạt chất trong lá tăng rất nhanh, cho đến khi bắt đầu có hoa được xem là cực điểm

Đến cuối tháng 7 hoặc đầu tháng 8 cây sinh trưởng chậm lại; số lá xanh trên cây giảm đi, do các lá phía gốc già và rụng

Hoa Thanh hao hoa vàng nở từ dưới lên trên và từ ngoài vào trong Quả già

và chín từ giữa tháng 10 đến tháng 11

Vào giữa tháng 11, cây vàng úa và tàn lụi, hạt giống được phát tán ra xung quanh Hạt Thanh hao hoa vàng tồn tại trên mặt đất qua mùa đông lạnh từ 3 – 3,5 tháng Tuy nhiên, khả năng nẩy mầm của hạt giảm nhanh theo thời gian bảo quản

1.1.1.4 Thành phần hoá học

Phần trên mặt đất của Thanh hao hoa vàng chứa artemisinin (thành phần chính), acid artemisinic, quinghaosu I (artennuin A), quinghaosu II (artennuin B), quinghaosu III (desoxyartemisinin ), quinghaosu IV, quinghaosu V (artennuin E), artemisininlacton (artennuin F), artemisiten (dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester, artennuin C, artemisinin G, artemisino, 11 R – (-) – dihydroartenuin epoxyartemisinic, dihydroepideoxyartennuin B, epideoxyartennuin B Ngoài ra, còn có 1,1% tinh dầu gồm 47 thành phần, trong đó artemisiaceton (52,5%), 1 – 8 cineol (11,66%) và camphor (10,9%)

Cây còn chứa lipid, flavonoid, coumarin, polyacetylen, tinh dầu serol

Ø Các lipid gồm : nonacosanol, 2 – methyltricosan – 8 – on – 23 – ol, hentriacontanyl – tricontanoat và 2, 29 – dimethyltriacontan

Ø Các hợp chất flavonoid gồm quercetagetin – 3 – methylether; quercetagetin –6,7 – tetramethylether; quercetagetin –6,7 – 4’ – trimethyl ether; 3,5 – dihydroxy –3’,4’ – 6,7 – tetramethoxyflavon; 3,3’,5’ – dioxyflavon; kaempferol; quercetin; 6 - methoxy kaempferol, artemetin; casticin; chrysopletin

Ø Các dẫn chất polyacetylen là anuadiepoxyd và ponticaepoxyd

Ø Tinh dầu cây Thanh hao hoa vàng Việt Nam chứa a - pinen, camphen, sabinen, b - pinen, b - myrcen 4,38%, p cymen, 1 – 8 cineol 15,44%,

artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 – terpineol, 2 – methylen – 5 – isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat, b - cubeben, a - cubebon - b - caryophylen 6,29%, b - farnesen, D - cadinen (Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1990)

Theo Harman J Woerdenbag và cộng sự (1994), lá thanh hao hoa vàng cho các hàm lượng cao nhất về artemisinin (0,86%), acid artemisinic (0,16%) và artennuin B (0,08%) vào thời điểm cây được 5 tháng tuổi Sau đó, hàm lượng các chất này đều giảm đi Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước khi cây ra hoa Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquiterpen 45%

1.1.2 Tổng quan Bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị

Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (thống kê năm 2003), nghĩa là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này Hai loại

muỗi A gambiae và A funesus được xem là “vô địch” trong lĩnh vực truyền

bệnh cho người tại đây Bệnh gây thiệt hại khoảng 12 tỷ USD / năm cho châu Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng

Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới Khoảng 60 năm trước, mỗi năm nước ta có gần 1 triệu người mắc bệnh, chiếm 5% dân số (Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20% Chương trình thanh toán sốt rét được tiến hành từ năm 1960 nhưng hiện vẫn có khoảng 45 triệu dân ta sống trong vùng lưu hành sốt rét Các vùng này chiếm 3/4 diện tích cả nước gồm vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải

Liệu pháp chữa trị và sự kiểm soát sốt rét đang trở nên khó khăn hơn do chiều hướng kháng thuốc của ký sinh trùng và chiều hướng kháng thuốc diệt côn trùng của muỗi đang gia tăng Mặc dù vậy, chỉ có 4 trong số khoảng 1.400 loại thuốc mới, được phát triển trong giai đoạn từ 1975 đến 1999 là để chống sốt rét Vì thế, hiện nay sốt rét vẫn là một căn bệnh khó tiêu diệt Các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra một loại thuốc mới điều trị sốt rét hiệu quả hơn

Theo báo cáo của Viện Y học IOM, bệnh sốt rét đang tái phát ở mức độ cao, từ đó nhấn mạnh đến việc cần thiết phải bổ sung nguồn thuốc cấp bách với giá thành rẻ hơn nhưng có thể thay thế các thuốc trị sốt rét cũ đã bị đề kháng

1.1.2.2 Artemisinin công cụ chữa trị sốt rét hiện nay

Thuốc trị ký sinh trùng sốt rét tốt và hiệu nghiệm nhất hiện nay là artemisinin lấy từ cây Thanh hao (quinghao) mà Trung Quốc đã tìm ra đầu thập niên 1970, áp dụng thành công trong các thử nghiệm lâm sàng và hiện được dùng rộng rãi Artemisinin có tác dụng diệt nhanh chóng các ký sinh trùng lưu thông trong máu và khi dùng chung với các thuốc chống sốt rét khác cho kết quả rất tốt, làm giảm nhiều xác suất tái xuất hiện của các ký sinh trùng kháng thuốc

Tại Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng đã dùng Thanh hao hoa vàng trị được bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm Từ năm 1984, Việt Nam cũng đã dùng Thanh hao để trích ra các hợp chất arthemeter, artemisinin

và artesunate, nghiên cứu trị sốt rét thành công trong thử nghiệm và thực tiễn trên bệnh nhân sốt rét Trong chiến tranh, dù không phổ biến, Thanh hao cũng

đã được dùng để trị sốt rét

Năm 1979, Trung Quốc đã tiến hành một cuộc thử nghiệm lâm sàng dùng artemisinin trên 2.099 bệnh nhân sốt rét Một kết quả không tưởng là tất cả đều hết bệnh Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét với ký sinh trùng đã nhờn thuốc chloroquine và 141 bệnh sốt rét màng não cũng cho kết quả khả quan Nhiều thử nghiệm lâm sàng tiếp theo ở Trung Quốc, Đông Nam

Á đều cho các kết quả tương tự

Ở Việt Nam, trong một thử nghiệm năm 1993 trên 638 bệnh nhân, dùng

thuốc uống artemisinin cho thấy: trong vòng 24 tiếng, 98% ký sinh trùng sốt rét biến mất Nhóm bệnh nhân dùng thuốc trong 5 ngày chỉ có 10% là ký sinh

trùng xuất hiện lại Artemisinin chống được cả P.falciparum và P.vivax Trong

một thử nghiệm khác năm 1999, kết quả tốt nhất là dùng artemisinin và sau đó dùng quinine trong 3 - 5 ngày sau

Artemisinin là hoạt chất chính của cây Thanh hao hoa vàng Khi cây ra nụ,

lá Thanh hao được thu hoạch có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn dễ vụn nát, mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng Đây là lúc lá có hàm lượng artemisinin cao nhất, 1,6% trong lá khô ( lá xanh chỉ có 0,6% artemisinin) Lá Thanh hao được tán nhuyễn, xay thành bột để chiết xuất hoạt chất artemisinin

Ngày nay, artemisinin được coi là phòng tuyến hữu hiệu cuối cùng trong kho vũ khí chống ký sinh trùng sốt rét

1.2 Sinh tổng hợp artemisinin

Wang và cộng sự (2004) nghiên cứu về sự ảnh hưởng của gen fpf1 (flowering promoting factor1) ở thời điểm Thanh hao ra hoa, mối liên hệ giữa việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin nhận thấy sự ra hoa không là yếu

tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm thu hoạch tốt nhất

là lúc cây ở cuối giai đoạn sinh trưởng và có sự tạo chồi

Artemisinin là một endoperoxide sesquiterpene lactone thuộc nhóm isoprenoid Một trong những con đường sinh tổng hợp quan trọng nhất ở thực vật là con đường isoprenoid Terpenoid được tạo nên bởi isopentenyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) Ở thực vật cấp cao hơn có hai con đường sinh tổng hợp độc lập nhau dẫn đến việc hình thành IPP: con đường mevalonate trong cytosol và con đường mevalonate trong thể hạt (Liu và cs., 2005)

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp artemisinin (Liu và cs., 2005; Bertea và

cs., 2005)

CMK: 4-(Cytidine 5’-diphospho)-2-Cmethyl- D-erythritol kinase

CMS: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase

DXR: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase

DXS: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase

FPPS: farnesyl diphosphate synthetase

GPPS: geranyl diphosphate synthase

HMGR: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMGCoA) reductase

HMGS: HMG-CoA synthase; IDS isopentenyl diphosphate synthase MCS: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase

MDD: mevalonate diphosphate decarboxylase

MK: mevalonate kinase

MPK: mevalonate-5-phosphate kinase

SES: sesquiterpene synthase

Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy–D-xylulose-5-phosphate synthase (DXPS) và deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPR) được tách từ rễ cây Thanh hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường sinh tổng hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và cs 2003; Souret và cs 2002) Do đó, con đường mevalonate không phải là con đường duy nhất để tổng hợp artemisinin trong cây Thanh hao Akhila và cộng sự (1987) đề nghị con đường sinh tổng hợp artemisinin hoàn chỉnh bắt đầu từ mevalonic acid và IPP Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP), germacrane skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B, và artemisinin Hàm lượng của artemisinic acid gấp 8 – 10 lần so với artemisinin ở cây Thanh hao

Vì thế, có giả thuyết cho rằng acid artemisinic là tiền chất cho sự sinh tổng hợp artemisinin B và artemisinin Sangwan và cộng sự (1993) cho rằng có sự biến đổi acid artemisinic thành artemisinin B và artemisinin cả ở cây tự nhiên và trong tế bào nuôi cấy

Bertea và cộng sự (2005) đã nhận biết được chất trung gian và các enzyme liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh hao Một số enzyme liên quan đến sự tổng hợp artemisinin như 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS), and sesquiterpene synthase (SES)

1.3 Tổng quan về chuyển gen tạo rễ và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp

1.3.1 Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc

1.3.1.1 Giới thiệu

Từ ngàn xưa, loài người đã phụ thuộc rất nhiều vào thực vật như nguồn cung cấp các protein, carbohydrat và chất béo (Rao và Ravishankar, 2002) Ngày nay số lượng và chủng loại các hóa chất do thực vật sản xuất (sử dụng trong dược phẩm, thực phẩm, phụ gia, mỹ phẩm và thuốc trừ sâu sinh học) không ngừng được mở rộng Hơn 25% các thuốc uống sử dụng trong các nước công nghiệp hoá có nguồn gốc trực tiếp hay gián tiếp từ thực vật, chỉ riêng việc bán các sản phẩm này hàng năm nước Mỹ đã thu hơn 30 tỷ USD vào năm

2002 Chính nhu cầu cao này đã dẫn tới những nỗ lực để tìm ra các con đường mới để sản xuất hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật mà trong đó các tế bào, mô, cơ quan thực

vật được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, hoàn toàn không phụ thuộc vào yếu

tố khí hậu và địa lý, đòi hỏi có nhiều điều chỉnh trong quá trình nuôi cấy cho sản xuất các hợp chất biến dưỡng quan trọng Kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi và đạt được nhiều thành tựu Khai thác rễ tóc chuyển gen (còn gọi lông

rễ, giống với bệnh ra rễ ở thực vật trong tự nhiên do vi khuẩn gây ra, nguyên nhân của sự sản xuất ồ ạt rễ bất định với phần lớn là rễ tóc) có mối quan hệ với cách tiếp cận mới trong công nghệ sinh học thực vật, nhận được nhiều quan tâm trong những năm gần đây Tuy cơ chế di truyền chuyển gen gián tiếp của

Agrobacterium đã được biết tới hơn 30 năm nay, song tiềm năng của kỹ thuật

nuôi cấy rễ chuyển gen hầu như không được chú trọng Tuy nhiên, giữa những năm 1980, tín hiệu về tiềm năng sinh tổng hợp của lông rễ đã được theo dõi thông qua một số ít các nhà nghiên cứu, điển hình là sự sản xuất các alkaloid (Mano và cs., 1986; Payne và cs., 1987) Trong suốt những năm 1990, những nghiên cứu về vấn đề này gia tăng đáng kể, và hơn 400 bài báo về rễ tóc chuyển gen đã được công bố Các nghiên cứu đã nêu rõ một số thuận lợi trong việc nuôi cấy rễ tóc chuyển gen, bao gồm mối liên quan giữ tốc độ phát triển nhanh (trong môi trường không có CĐHSTTV), sự bền vững về mặt di truyền

và sinh hoá học, khả năng sinh tổng hợp chất chuyển hoá tới sự phát sinh cơ quan (Shanks và Morgan, 1999; Sevon và Okman-Caldentey, 2002) Thêm vào

đó, gần đây sự phát triển hệ thống bioreactor mở ra nhiều triển vọng trong việc nuôi cấy rễ chuyển gen ở qui mô công nghiệp (Guillon và cs., 2006) Hơn nữa, những quan tâm về hệ thống nuôi trồng rễ chuyển gen đến từ các công ty tư nhân (ROOTec bioactives GmbH, Basel, Thụy Sĩ), có thể dễ dàng chuyển giao kiến thức từ các phòng thí nghiệm nghiên cứu sang công nghiệp dược phẩm Các báo cáo tổng kết gần đây phát triển các nghiên cứu về rễ chuyển gen, bao gồm các phương pháp chuyển gen từ thực vật, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học và gia tăng hàm lượng các chất thứ cấp mong muốn Ngoài

ra còn đề cập đến các kiểu bioreactor cho nuôi cấy rễ tóc chuyển gen và quy trình nuôi cấy qui mô lớn

1.3.1.2 Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ tóc

Agrobacterium rhizogenes là một loài rất gần với Agrobacterium tumefaciens Chúng gây ra bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử diệp A rhizogenes cũng có một plasmid có khả năng tạo rễ, được gọi là “Ri plasmid”

Phần T-DNA của Ri plasmid sẽ được chuyển vào nhân tế bào thực vật, khi sự chuyển nạp gen xảy ra, giống như sự chuyển nạp gen của Ti plasmid T-DNA

Rễ nhánh bất định, có khối u sần sùi được tạo ra ở vùng bị nhiễm Người ta

hiện biết tương đối ít về T-DNA của Ri plasmid Trong nhiều dòng A

rhizogenes, sản xuất opine agropine, T-DNA được tách ra thành 2 phần: TL và

TR Các gen tổng hợp agropine và auxin định vị trên đoạn sau cùng Điều này khác với octopine Ti plasmid, chúng có gen tổng hợp auxin trên đoạn TL Điều khá thú vị là, các T-DNA của Ri sản xuất những opine như: cucumopine và mannopine đều không có gen auxin, nhưng lại cho ra kiểu hình “hairy root” giống như trường hợp Ti plasmid Trong trường hợp Ri plasmid, dường như auxin được sản xuất bởi thực vật, và các gen tổng hợp auxin có vai trò tổng hợp auxin phụ trợ khi cần Tính chất đặc biệt của Ri plasmid được khai thác nhiều trong công nghệ di truyền (Bùi Chí bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Cuối thế kỷ trước, hai bệnh thực vật, bệnh ghẻ khối u (crown gall) và bệnh

rễ tóc hay lông rễ (hairy root) là nguyên nhân chính gây ra nạn mất mùa ở các vườn nho, mận, táo và đào Một số nhà nghiên cứu bắt đầu làm sáng tỏ bản chất tự nhiên cơ chế xâm nhiễm của chúng Một vài năm sau đó, cơ chế phân tử

cơ bản của những bệnh này được giải thích dựa trên khả năng kỹ thuật di

truyền tự nhiên của vi khuẩn đất gây bệnh thực vật thuộc giống Agrobaterium (họ Rhizobiaceae) (Chilton và cs., 1977, 1980) Khi nhiều loài thực vật khác

nhau (chủ yếu là loài hạt kín và loài hai lá mầm) bị tổn thương, chúng sản xuất

ra các loại phenolic đơn, như là acetosyringone cảm ứng định vị plasmid vir gene (virulence) của Agrobacterium, chịu trách nhiệm cho việc chuyển đoạn T- DNA của Ti-plasmid (Ti: cảm ứng khối u) đối với Agrobacterium tumefaciens

và Ri-plasmid (Ri: cảm ứng ra rễ) trong trường hợp Agrobaterium rhizogenes ở

tế bào thực vật (Nilsson và Olsson, 1997) Các gen của đoạn DNA chuyển vào làm trung gian hình thành những kiểu hình mới như khối u và lông rễ, tiết ra

Hình 1.3 Quá trình xâm nhiễm của Agrobacterium Các bước cần thiết xuất

hiện bên trong vi khuẩn (truyền tín hiệu hóa học, cảm ứng gen vir, và chế

biến T-DNA) và trong tế bào thực vật (vi khuẩn xâm nhiễm, chuyển T-DNA, xâm nhập nhân tế bào, và gắn chèn T-DNA) được in đậm, cùng với các gen

và protein làm trung gian giữa các bước (theo Gelvin, 2000)

đất một chất gọi là các opine (các amino acid bất thường), hơn nữa được

Agrobacterium làm nguồn dinh dưỡng (Weising và Kahl, 1996) Phần lớn loài Agrobacterium chỉ chứa một T-DNA, trong khi vài loài khác (như kiểu Ri-

plasmid mang agropine) lại mang hai T-DNA độc lập, được biểu diễn là TLDNA và TR-DNA TR-DNA có tính tương đồng cao đối với T-DNA của Ti-

-plasmid ở A tumefaciens, trong khi TL-DNA khác biệt đáng kể và tương đồng

với T-DNA mang bởi Ri-plasmid của chủng manopine A rhizogenes (Nilsson

và Olsson, 1997) Cả TL-DNA và TR-DNA được chuyển vào độc lập với bộ gen của tế bào chủ thực vật, trong khi quá trình chuyển TL-DNA lại cần thiết cho sự cảm ứng hiện tương tạo lông rễ, quá trình chuyển TR-DNA không gây ra sự hình thành rễ từ mẫu nuôi cấy chuyển gen (Nilsson và Olsson, 1997; Sevon và Oskman-Caldentey, 2002) TR-DNA chứa hai gen, iaaM và iaaH , chịu trách

nhiệm sinh tổng hợp auxin và các gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp các

opine manopine (mas1’ và mas2’) và agropine (ags) TL-DNA mang 18 khung đọc mở (ORF), bốn trong số đó cần thiết cho sự hình thành lông rễ; ORF10,

ORF11, ORF12 và ORF15 lần lượt tương ứng với các gen rolA, rolB, rolC, và

rolD Gen rolB cần thiết cho sự cảm ứng tạo rễ Thậm chí khi biểu hiện một

mình, gen rolB cũng có khả năng cảm ứng hình thành lông rễ (Nilsson và

Olsson, 1997) Cơ chế của quá trình chuyển gen được nghiên cứu bởi Gelvin (2000), Tzfira và cộng sự (2004)

Hình 1.4 Cấu trúc Ri-plasmid của A rhizogenes

Hiện tượng tự nhiên này được khai thác trong lĩnh vực công nghệ sinh học

để phát triển phương pháp nuôi cấy rễ chuyển gen Tiến trình được sử dụng để cảm ứng tạo rễ tóc, bao bồm nuôi cấy các mẫu thực vật bị tổn thương (gọi là

mẫu cấy) với dịch huyền phù A rhizogenes trong điều kiện vô trùng (Sevon và

Oskman-Caldentey, 2002) Mẫu cấy có thể bị xâm nhiễm với chủng

Agrobacterium bằng cách bổ sung trực tiếp dịch huyền phù vi khuẩn và ủ trên

môi trường rắn hoặc lỏng Trong trường hợp khác, mẫu cấy bị xâm nhiễm, sau

đó chuyển sang môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh (claforan hoặc dẫn xuất penicillin), thường sau 72 h vi khuẩn được loại ra (Pavlov và cs., 2002; Rahman và cs., 2004) Kiểu hình mới, rễ chuyển gen, thường xuất hiện sau 1-4 tuần, phát triển theo kiểu đẻ nhánh vô số, với các nhánh bên phong phú, trên các môi trường Murashige và Skoog hoặc Gamborg’s B5 không có CĐHSTTV (Pavlov và cs., 2002; Sevon và Oskman-Caldentey, 2002) Quá trình chuyển gen thành công được kiểm chứng bằng hai cách, trực tiếp hoặc gián tiếp, thông qua sự phát hiện các T-DNA hoặc các opine Con đường trực tiếp được ưa thích hơn, như một vài trường hợp, quá trình sản xuất các opine không bền và thậm chí có thể biến mất (Sevon và Oksman-Caldentey, 2002) Phát hiện T-

DNA bằng phương pháp PCR (Palazon và cs., 2003; Le Flem-Bonhomme và cs., 2004) hay phương pháp Southern blot (Nin và cs., 1997; Xie và cs., 2001) Sau khi thích nghi một thời gian ngắn, rễ chuyển gen được sử dụng để sản xuất các chất biến dưỡng (Wysokinska và Chmiel, 1997; Shanks và Morgan, 1999; Sevon và Oskman-Caldentey), hạt nhân tạo (Uozumi2004) hay thực vật chuyển gen (Choi và cs., 2004; Crane và cs., 2006) Hai ứng dụng sau ngoài phạm vi nghiên cứu của đề tài này, do đó sẽ không được đề cập tới

Hình 1.5 Sơ đồ cảm ứng ra rễ của Agrobacterium

Nhiều yếu tố ảnh hưởng khả năng thành công của sự chuyển gen của mẫu

mô thực vật mẹ và sự cảm ứng ra rễ, như loài, tuổi và loại mô thực vật (Sevon

và Oskman-Caldentey, 2002), các loài thuộc chủng Agrobacterium, mật độ vi

khuẩn (Part và Facchini, 2000) Kỹ thuật mới SAAT (sonication-assisted

Agrobacterium- mediated transfomation), chuyển gen gián tiếp Agrobacterium

dựa vào hỗ trợ của sóng âm, để cảm ứng hình thành lông rễ ở những thực vật khó chuyển gen, đã được phát triển gần đây

1.3.1.3 Dùng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen vào thực vật

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl và cộng sự phát minh năm 1985, được sử

dụng rộng rãi nhất Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không

cần sự hiện diện của tế bào

Hình 1.6 Quá trình PCR

Nguyên tắc của phương pháp PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA có nằm giữa hai mồi (hình 1.8) Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các

mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Từ “xuôi” và “ngược” phải được hiểu theo là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba bước:

Bước 1 – Giai đoạn biến tính (Denaturatioon): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94oC - 95oC, trong vòng 30 giây – 1 phút

Bước 2 – Giai đoạn lai (Hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp, thấp hơn Tmcủa các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40o

C – 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng

và kéo dài từ 30 giây – 1 phút

Bước 3 – Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Elongation): Nhiệt độ được tăng lên tới 72oC sử dụng, vốn là polymerase chịu nhiệt, hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút

Một chu kỳ bao gồm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm gia tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân: theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu (hình 1.8)

Các ứng dụng của phương pháp:

ü Sản xuất mẫu dò

ü Khuếch đại số lượng các RNA

ü Định lượng bằng phương pháp PCR

(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000)

1.3.2 Nuôi cấy rễ chuyển gen ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp

Tiềm năng sinh tổng hợp cao của nuôi cấy rễ chuyển gen bị bỏ phí trong nhiều năm, và các nghiên cứu tập trung chính vào cơ chế của hiện tượng lông

rễ Tuy nhiên, trong suốt giữa những năm 1980 và đầu những năm 1990, một

số nghiên cứu về sự sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các alkaloid (Kamada và cs., 1986; Flores và cs., 1987) cho thấy khả năng sinh tổng hợp của hệ thống rễ chuyển gen Ngày nay, nuôi cấy lông rễ được quan tâm nhiều hơn, như các chất nền sinh học cho quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị, vì có nhiều ưu điểm như tính bền vững cao về mặt di truyền (so với nuôi cấy không biệt hoá) và tốc độ phát triển tương đối nhanh (so với rễ bình thường) Ngoài ra, không đòi hỏi CĐHSTTV trong suốt thời gian nuôi cấy

vì một số CĐHSTTV là chất độc (như acid 2,4-dicloro-phenoxyacetic) nên hiện diện của chúng trong nhiều sản phẩm cuối không thể chấp nhận Hơn nữa,

sử dụng hệ thống nuôi cấy lông rễ thuận lợi cho việc sản xuất một số các hợp chất thứ cấp được tổng hợp bởi rễ thực vật và tích luỹ ở những phần trên không của thực vật, là sự tích luỹ một số lượng rất thấp hoặc không có gì cả trong nuôi cấy không biệt hoá hoặc nuôi cấy chồi (Shanks và Morgam, 1999)

Một khía cạnh khác của phương pháp nuôi cấy rễ chuyển gen là tiềm năng cho sự sản xuất protein thương mại hóa (Shanks và Morgan, 1999) Các protein được sản xuất theo phương pháp này bao gồm các enzym dược phẩm quan trọng (các superoxide dismutase và peroxidase), phytase và các protein ngoại lai (kháng thể đơn dòng), và các protein bất hoạt ribosom

1.3.3 Các nguyên lý cơ bản nhằm làm gia tăng quá trình sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen

Trong suốt thập kỷ vừa qua, những tiến bộ đáng kể trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tóc Các nhân tố ảnh hưởng đến sự gia tăng hoặc làm giảm hoạt tính sinh tổng hợp của nuôi cấy

rễ tóc đều được quan tâm để cố gắng hiểu về sự đa dạng, cũng như để có được hàm lượng cao các hợp chất thứ cấp Ở thực vật, các con đường biến dưỡng thứ cấp bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, như nguồn dinh dưỡng, các nhân

tố gây stress, ánh sáng và chất điều hoà tăng trưởng thực vật (Giri và Lakshmi, 2000) Vì vậy, rõ ràng rằng sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng rễ tóc bị chi phối bởi điều kiện nuôi cấy (Kim và cs., 2002) Ở đây, một số nghiên cứu được tiến hành nhằm gia tăng hàm lượng của các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ

tóc được mô tả ngắn gọn

Hình 1.7 Các bước ứng dụng trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tóc

chuyển gen

1.3.3.1.Chọn lọc dòng rễ có năng suất cao

Để thu được dòng rễ có năng suất cao, chủng cải tiến bắt đầu với sự lựa chọn cây bố mẹ cho sản phẩm mong muốn có hàm lượng cao Các chủng

Agrobaterium rhizogenes khác nhau có thể ảnh hưởng đến sự chuyển gen Giri

và cộng sự (2001), chỉ ra rằng sự khác biệt giữa các chủng A4, 15834, K599,

LBA 9402 và chủng 9340 thuộc A rhizogenes, trong đó chủng LBA 9365 được khẳng định là có khả năng cảm ứng tạo rễ ở A annua với hàm lượng

artemisinin cao hơn Tuy nhiên, một số loài thực vật khác có thể đáp ứng tốt

hơn với các chủng A rhizogenes khác (Kim và cs., 2002)

1.3.3.2 Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy

Thành phần của môi trường trong nuôi cấy rễ tóc đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định sự phát triển và sản xuất các hợp chất thứ cấp (Giri và Lakshmi, 2000) Sự tối ưu hoá nồng độ CĐHSTTV và sự kết hợp thường mang lại hiệu quả (Kim và cs., 2002) Việc thay đổi các yếu tố môi trường (mức độ dinh dưỡng, ánh sáng, nguồn carbon, ) có hiệu quả góp phần làm gia tăng năng suất (Kim và cs., 2002; Weathers và cs., 1997) Chẳng hạn, khi giảm lượng phosphat thường kích thích sự tích lũy sản phẩm (Kim và cs., 2002) Nguồn Nitrogen cũng đóng một vai trò quan trọng (Wang và Tan, 2002), giảm nồng độ NH4+ và tăng nồng độ NO3- gia tăng tổng hợp artemisinin ở lông rễ

của A Annua, trong khi ham lượng nitrogen tổng cao lại ức chế sự phát triển và

sản suất hợp chất thứ cấp (Wang và Tan, 2002; Weathers và cs.,1997)

1.3.3.3 Elicitor

Là những chất dẫn xuất từ bề mặt tế bào xâm nhiễm (mầm bệnh) cũng như

từ tế bào bị xâm nhiễm (tế bào chủ) khơi màu cho phản ứng bảo vệ Các enzym

do động vật ăn thực vật tiết ra cũng là elicitor

Phân tử elicitor kết hợp với các thụ thể trên màng tế bào thực vật hình thành các phức hợp hoạt hoá hay cảm ứng hàng loạt gen đặc hiệu tổng hợp phytoalexin (bổ thể thực vật), là những chất do thực vật tạo ra để chống lại tác nhân xâm nhiễm, bao gồm virus, vi khuẩn, nấm và động vật ăn thực vật) Bataxin là chất tạo ra khi khoai lang bị sùng

Thực vật sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp trong tự nhiên là một cơ chế phòng thủ nhằm chống lại sự tấn công của mầm bệnh (Croteau và cs., 2000) Elicitor là tín hiệu khởi sự một quá trình hình thành nên sản phẩm thứ cấp Con đường thứ cấp để đáp ứng với các stress (Croteau và cs., 2000) Các elicitor vô sinh và hữu sinh được sử dụng để kích thích sự hình thành các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy lông rễ, giúp rút ngắn thời gian và đạt được sản phẩm có hàm lượng cao, đồng thời gia tăng thể tích nuôi cấy (Ramachandra - Rao và Ravinshankar, 2002) Elicitor của nấm, vi khuẩn, nấm men, viz Polysaccharid, glycoprotein, enzym bất hoạt, xanthan và chitosan, và muối của kim loại nặng được chứng minh là làm gia tăng sự sản xuất các hợp chất thứ

cấp khác nhau (Kim và cs., 2002; Robbins và cs., 1991) Artemisinin được sản

xuất bởi lông rễ A annua gia tăng gấp 6 lần, đạt 1.8 mg.mg-1

trọng lượng khô chỉ sau 6 ngày nuôi cấy nhờ bổ sung 150 mg chitosan l-1 Mức độ gia tăng phụ thuộc vào hàm lượng các elicitor được sử dụng Tương tự, khi bổ sung methyl jasmonate (0,2 mM) hoặc dịch chiết nấm men (2 mg.ml-1) làm gia tăng sự sản xuất artemisinin lần lượt là 1,5 và 0,9 mg.mg-1

(Waraporn Putalun và cs., 2007)

1.3.3.4 Nuôi cấy hai giai đoạn

Gần đây, nhiều hợp chất thứ cấp thường được sản xuất sau khi sự tăng trưởng đã ngừng lại, hoặc tối thiểu tại thời điểm pha log (Bourgaud và cs., 2001) Thật vậy, shikonin, sản phẩm được sản xuất bởi thực vật được thương mại hoá đầu tiên, được tổng hợp trong suốt giai đoạn thứ hai, trong môi trường mới, và sau khi sự tăng trưởng đã ngừng lại (Yazaki và cs., 1999) Đây là quá trình nuôi cấy gồm hai giai đoạn, trong một số trường hợp khác thì sự tăng trưởng và sản xuất chất thứ cấp cao hơn năm lần so với chỉ có một giai đoạn nuôi cấy với cùng môi trường nuôi cấy (Luo và cs., 2001)

Thời điểm bổ sung dinh dưỡng, hormon, hoặc elicitor đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp Lou và cộng sự (2001) theo dõi

ở T Chinensus, nhận thấy có sự giảm sinh khối rễ khi CĐHSTTV được bổ

sung tại thời điểm ban đầu, kết quả hoàn toàn ngược lại khi bổ sung ở ngày thứ

12 Kết hợp sử dụng hai giai đoạn nuôi cấy có bổ sung CĐHSTTV cho phép tối

ưu hoá điều kiện nuôi cấy để sản xuất hợp chất thứ cấp

xuất hợp chất thứ

1.3.3.5.1 Khái niệm bioreactor

Từ điển Oxford (2001) định nghĩa: Bioreactor là hệ thống trong đó có những phản ứng sinh học xảy ra, thông thường là sự lên men hay là quá trình biến nạp sinh học Các phản ứng sinh học thực hiện trong bình, gọi là bình bioreactor Bình bioreactor chia làm 3 kích cỡ: Bình dùng cho thí nghiệm, bình cho sản xuất quy mô nhỏ và bình cho sản xuất quy mô lớn

- Loại thí nghiệm có bình từ 3 l đến bình 50 l Chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu và thực hiện các phản ứng lên men

- Loại thí nghiệm, sản xuất quy mô nhỏ: Thường dùng để nhân nhanh, hoặc thực hiện các quá trình lên men Những loại này có thể tích bình biến động từ

50 – 1000 l, khá linh hoạt và có thể ứng dụng cho nhiều đối tượng khác nhau

- Loại sản xuất quy mô lớn, công nghiệp có thể tích không hạn chế, nhưng thông thường ít nhất cũng là 1000 l, và có thể lên đến cả 1.000.000 l tuỳ vào đối tượng và quy mô sản xuất Những loại này thường được thiết kế rất chuyên biệt cho từng đối tượng và được chế tạo sao cho quá trình sản xuất đạt hiệu quả

cao nhất

Hệ thống bioreactor được thiết kế với mục đích cải thiện và nâng cao hiệu quả cũng như năng suất của quá trình vi nhân giống Mô hình bioreactor được thiết kế theo dạng bình lên men trong nuôi cấy vi sinh vật, tuỳ thuộc vào đối tượng cây mà có nhiều kiểu bioreactor khác nhau nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mô và cơ quan trong môi trường lỏng có hệ thống làm thoáng khí

Bioreactor cho phép sản xuất tế bào thực vật trên quy mô lớn Một hệ thống bioreactor sản xuất phôi trên quy mô lớn không cần những đơn vị bioreactor có thể tích 100 – 500.000 l như lên men vi sinh Một bình bioreactor 10 l có khả năng sản xuất 5 – 10 triệu phôi trong một năm Sử dụng bioreactor trong nuôi cấy phát sinh cơ quan hay phát sinh phôi đã được báo cáo nhiều như hệ thống bioreactor nuôi cấy Cà rốt (có lọc), cây Đinh lăng và khoai Lang (có sục khí) Trên 60.000 phôi soma Cà rốt có thể được sản xuất từ 1 lít dịch huyền phù được nuôi cấy trong một bioreactor (Ziv, 2001)

Với các loài cây rừng, nuôi cấy phôi Thông radiata, Vân sam trắng và Vân sam địa phương, được nuôi cấy sinh trưởng trong những điều kiện bình bioreactor Giai đoạn đầu của phôi trong bình bioreactor được trải trên môi trường bán rắn hay lỏng có giá thể đỡ Việc sản xuất phôi chính thuần thục trong những điều kiện bình bioreactor không thành công ở một số loài Trước khi kỹ thuật này có thể được sử dụng sản xuất thương mại, cần có nhiều nghiên cứu cơ bản và phát triển hơn nữa (Trần Văn Minh, 2007)

Tế bào thực vật khác với tế bào nấm men Nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không

xảy ra sự sinh trưởng đồng thời giống như nấm men Tuy nhiên, bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thì việc nhân sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hóa trong môi trường lỏng thì tỏ ra hiệu quả hơn hẳn (Ziv, 2001)

Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được thực hiện đầu tiên

vào năm 1981 do Takayama thực hiện trên đối tượng cây Begonia Hệ thống

này còn được sử dụng có hiệu quả trên nhiều loại thực vật khác Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ (4 –10 l) trong khoảng 1 – 2 tháng có thể tạo ra đến 4.000 đến 20.000 cây con Điều này cho thấy một triển vọng lớn trong việc áp dụng bioreactor thương mại, mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật Mục đích của nuôi cấy trong bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng nhất, đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật (Dương Tấn Nhựt và cs., 2005)

1.3.3.5.2 Khó khăn và thuận lợi của nuôi cấy bằng hệ thống bioreactor

Thuận lợi của nuôi cấy bằng bioreactor

Theo Takayama và cộng sự (1994), một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là:

- Sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường

- Không có sự hạn chế về trao đổi khí

- Có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường

- Tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc cấy chuyển

- Dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối

- Dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy

- Tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng lên do được tăng cường không khí

- Mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng nhanh

- Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi bên biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn

Khó khăn của nuôi cấy bằng bioreactor

Theo Ziv (2001), mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ

ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn

nhưng bên cạnh đó nó vẫn có những hạn chế nhất định

- Tùy thuộc vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều đối tượng khác nhau, đặc biệt là trong nhân giống đại trà và công nghiệp

- Thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như: Hiện tượng thủy tinh thể, hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

- Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật Nấm, vi khuẩn là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng, là cản trở lớn của mục đích khai thác thương mại với bioreactor Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán rắn) Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương

1.3.3.5.3 Phân loại bioreactor

Chức năng cơ bản của một bản của một bioreactor là cung cấp các điều kiện sinh trưởng thích hợp nhất cho đối tượng cây được nuôi cấy bằng cách điều khiển các nhân tố lý hóa học Nhờ đó, có thể đạt được hiệu quả tối đa và tiến đến tự động hóa quá trình sản xuất cây, từ những thí nghiệm nhân giống nhỏ có thể nâng lên áp dụng cho hệ thống nhân giống có thể tích lớn

Năm 2000, Paek và cộng sự đã đưa ra phân loại như sau:

* Bioreactor sục khí và sục khí hình cột (airlift và bubble column-type bioreactor)

* Bioreactor sục bóng khí dạng cầu (Balloon-type bubble bioreactor – BTBB)

* Bioreactor cánh khuấy (Stirred tank bioreactor – STRs)

* Bioreactor ngập chìm tạm thời (Ebb and flood bioreactor)

1.3.3.5.4 Ứng dụng công nghệ bioractor trong công nghệ nuôi cấy rễ

chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp

Nuôi cấy bioreactor được xem như là bước cuối cùng trong sự phát triển kỹ thuật sản xuất hợp chất thứ cấp trong hệ thống in vitro thực vật (Bourgaud và cs., 2001) Nhiều loại bioreactor đã được sử dụng một cách thành công cho quá trình nuôi cấy rễ chuyển gen (như các bể khuấy thường với sự phân tách bởi sức đẩy về phía trước, kiểu hình trụ, kiểu hình cầu… (Curtis, 2000) Để có thể thành công trên qui mô lớn khi nuôi cấy rễ chuyển gen, nhiều kiểu bioreactor

đã được thiết kế, ngoài các yếu tố bao gồm cả sinh lý học, hình thái học, cũng cần quan tâm về khả năng nuôi cấy kéo dài và tính nhạy cảm với stress cao của

rễ tóc (Wysokinska và Chmiel, 1997)

Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor đã được thực hiện thành công (Wysokinska

và Chmiel, 1997; Curtis, 2000; Kim và cs., 2002a, 2002b; Weathers và cs., 2005; Kim và cs., 2002; Georgiev và cs., 2007; Towler, 2005; Towler và cs., 2007) Thiết kế phát triển hệ thống bioreactor trong điều kiện môi trường được chuyển động liên tục, hoạt động chính của những hệ thống này là dựa trên sự khuấy để gây ra sóng và làm giảm mức độ stress một cách đáng kể Sự sản xuất

ginsenoside của nuôi cấy rễ tóc P ginseng trong bioreactor đã được nghiên cứu

một cách chi tiết (Palazon và cs., 2003c) Một trong những vấn đề giới hạn của thương mại hóa nuôi cấy rễ tóc là thiết kế các bioreactor thích hợp tránh việc gián đoạn sinh trưởng và sự không đồng nhất rễ tóc trong nuôi cấy (Weather và cs., 1994, 1999, 2004; Kim và cs., 2001, 2002, 2003; Seung và Jong, 1996) Hiện nay đã có nhiều thiết kế thích hợp cho nuôi cấy rễ tóc sản xuất artemisinin

đã được nghiên cứu (Rodriguez Mendiola và cs., 1991; Kondo và cs., 1989; Chatter và cs., 1997; Wyslouzil và cs., 2000; Sivakumar, 2006)

Các hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời cũng đã được sử dụng thành

công trong nuôi cấy rễ Beta vulgaris và Harpagophytum procumbens Mặc dù

hệ thống ngập chìm tạm thời được thiết kế để nghiên cứu nhân giống thực vật

in vitro, có nhiều thuận lợi (do làm giảm sự ngập nước, chi phí môi trường thấp

hơn, giảm chi phí lao động, giảm diện tích làm việc) cho việc nuôi cấy rễ chuyển gen Hệ thống này có thể giải quyết một vấn đề ngập nước, mà kết hợp với bioreactor để nuôi cấy rễ chuyển gen trong một vài trường hợp Tỷ lệ môi trường của hệ thống khoảng 200 ml, và dồn lại hàng ngày trong suốt thời gian

nuôi cấy của giai đoạn ngập chìm có thể thay đổi từ 1 phút đến vài giờ Pavlov

và Bley (2006) đã tìm ra sự tăng trưởng tối ưu cho lông rễ Beta vulgaris là một

chu kỳ 15 phút ngập chìm và 75 phút không ngập chìm, trong khi hàm lượng sắc tố betalain được tích luỹ cao nhất với 15 phút ngập chìm và 60 phút không ngập chìm trong một chu kỳ

1.4 Sắc ký lỏng cao áp HPLC

1.4.1.Nguyên tắc

Ø Sắc ký lỏng cao áp HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi bằng các hạt có kích thước khoảng 10 µm Trong đó, người ta dùng một bơm có áp suất cao khoảng 300 atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/ phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ

khoảng 20 µg

Ø Ưu điểm: Có khả năng tách các hợp chất đặc thù như :

- Các hợp chất cao phân tử và ion

Ø Bình chứa pha động (solvent reservoir)

Ø Bơm tạo áp lực cao và hệ thống tạo ra việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến (pump + gradient system)

Ø Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột

Ø Cột (column) được nhồi với pha tĩnh có hiệu quả cao Cột có thể được đặt trong một bộ phận điều nhiệt

Ø Bộ phận phát hiện (bộ phận phát hiện) và hệ thống xử lý số liệu (data processing system)

Ø Máy ghi (recorder) hoặc máy vi tính (computer) để ghi hoặc lưu giữ sắc ký đồ, in ra hoặc biên tập lại sau này

Ảnh 1 Máy sắc ký lỏng cao áp (hãng Waters, Mỹ)