bài báo cáo công nghệ enzyme và protein

Thực hành - Chuẩn bị 7 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng với enzyme, 5 ống có phản ứng với enzyme.. - Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BÀI BÁO CÁO CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ

PROTEIN

GVHD: CN ĐỖ THỊ TUYẾN

SVTH: THỜI THỊ BÍCH NGA

TP.HCM, tháng 04 năm 2011

MỤC LỤC

BÀI1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1

Bài 2: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 9

Bài 3: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50 23

Bài 4: ĐIỆN DI 31

BÀI 5: CỐ ĐỊNH ENZYME 38

BÀI1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD

1 Thu nhận chế phẩm enzyme cellulose thô.

a Thực hành

- Cân 5 g CPE cho vào cốc và tách bằng nước với tỉ lệ là 1:5, tức 5 g + 25

ml nước cất

- Khuấy đều trong thời gian 30 phút

- Lọc lấy dịch chiết và được thể tích là 21 ml

- Tủa bằng cồn lạnh với tỷ lệ 1:3, tức 21 ml dịch chiết + 63 ml cồn lạnh

- Cho hỗn hợp dung dịch trên vào bình erlen và giữ lạnh 30 phút

- Tách lấy phần tủa ở phần dưới bình với thể tích là 25 ml và cho vào ống lytâm 50 ml

- Đem cân phân tích được 33.4 g

Hình 2: Dịch tủa protein trong ống ly tâm 50 ml

2 Dựng đường protein chuẩn.

- Dung dịch thuốc thử Bradford :

 Coomassie Brilliant blue : 0,001g

 Ethanl tuyệt đối 4,7g

 Acid photphoric 85%: 8,5g.

- Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng

có nắp, bổ sung acid photphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.

 Thiết bị : máy quang phổ.

b. Lập đồ thị chuẩn

Để dung dich albumine chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:

- Dựng đường chuẩn protein( Albumine):

Hình 3: Kết quả so màu.

 Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm:

Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5

 Dựng đường protein chuẩn.

Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm, ta dựng được đường protein chuẩn như sau:

d Nhận xét kết quả:

 Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì màu xanh càng đậm.

 Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì chỉ số OD càng cao.

3 Dựng đường chuẩn của đường glucose.

- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS)

c Kết quả:

 Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng, các ống thí nghiệm có màu đỏ và đậm dần từ ống thí nghiệm số 1 đến ống thí nghiệm số 5 như hình 4.

d Nhận xét kết quả:

 Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì màu đỏ càng đậm.

 Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì chỉ số OD càng cao.

Bài 2: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

1 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme (30 0 C – 70 0 C)

a Nguyên tắc

- Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme, ở những nhiệt độ khác nhau

là 30 0 C, 40 0 C, 50 0 C, 60 0 C, và 70 0 C Cho kết quả so màu và chỉ số OD, khác nhau ở bước sóng 540 nm.

b Thực hành

- Chuẩn bị 7 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng với enzyme,

5 ống có phản ứng với enzyme.

 Ống đối chứng :

- Hút 1 ml H 2 O cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều.

- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm

 Ống nghiệm không có phản ứng enzyme

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme

- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều

- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm

 5 ống nghiệm có phản ứng enzyme, được đánh số từ 1 đến 5

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 1 và ủ ở nhiệt độ phòng (300C) trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịchCMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ phòng

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 2 và ủ ở nhiệt độ

400C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC

pH5 thích hợp ở nhiệt độ 400C

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 3 và ủ ở nhiệt độ

500C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC

pH5 thích hợp ở nhiệt độ 500C

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 4 và ủ ở nhiệt độ

600C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC

pH5 thích hợp ở nhiệt độ 600C

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 5 và ủ ở nhiệt độ

700C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC

Hình 5: Kết quả so màu.

- Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm là:

d Tính toán kết quảDựa vào chỉ số OD ở các nhiệt độ khác nhau 300C,400C, 500C, 600C,

700C và chỉ số OD của ống không phản ứng, ta tính được chỉ số OD lần lượt là:

U= ( At – A0)*F *Thế x vào phương trình U ta được:

Dựa vào chỉ số U và nhiệt độ ta vẽ được đồ thị:

f Biện luận sơ đồ:

 Dựa vào đồ thị ta thấy:

- Hoạt tính eyme đạt cực đại ở nhiệt độ 600C Vì ở nhiệt độ này hoạt tính enzyme thủy phân tốt nhất

- Ở nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 700C không đủ nhiệt độ cho enzyme thủyphân Vì vậy hiệu suất thủy phân giảm

- Ở nhiệt độ 700C thì enzyme dần dần bị biến tính nên hiệu suất thủy phân giảm dần

g Đánh giá kết quả:

Dựa vào kết quả so màu ta thấy:

- Mẫu đối chứng có màu vàng là màu của thuốc thử DNS pha loãng với 1ml nước cất.

- Ống không phản ứng có màu vàng đậm, chứng tỏ ở đây hoạt tính enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme

và dung dịch CMC pH5

- Ống có phản ứng với enzyme từ nhiệt độ 30, 40 và 50 0c có màu đỏ đậm dần theo thứ tự từ nhiệt độ 30, 40 đến 500C Chứng tỏ nhiệt độ tăng dần từ 30, 40 đến 500C thì hoạt tính enzyme tăng dần

- Ở nhiệt độ 600C màu đỏ đậm nhất, chứng tỏ ở nhiệt độ này hoạt tính enzyme hoạt động mạnh nhất Enzyme thủy phân dung dịch CMC càng mạnh làm cho màu của dung dịch có màu đỏ đậm

- Ở nhiệt độ 700C màu đỏ nhạt dần, chứng tỏ hoạt tính enzyme giảm dần Vìnhiệt độ càng cao thì enzyme bị biến tính

2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme ( pH 3 – pH 8 )

a Nguyên tắc Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme cellulose, trong dung dịch các đệm Na-acetate có pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 Cho kết quả so màu khác nhau ở bước sóng 540 nm.

b Thực hành

- Chuẩn bị 13 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 6 ống không phản ứng với enzyme và 6 ống có phản ứng với enzyme.

 Ống đối chứng :

- Hút 1 ml H 2 O cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều.

- Thêm 1ml CMC pH5 vào ống nghiệm và lắc đều.

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.

 6 ống không phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6.

- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào 6 ống nghiệm và đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme.

- Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose vào 6 ống nghiệm và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 3 vào ống nghiệm số 1 và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 4 vào ống nghiệm số 2 và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 5 vào ống nghiệm số 3 và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 6 vào ống nghiệm số 4 và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 7 vào ống nghiệm số 5 và lắc đều.

- Thêm 1ml dung dịch CMC pH 8 vào ống nghiệm số 6 và lắc đều.

- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước sóng

540 nm

 6 ống phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6.

- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch: CMC pH3, CMC pH4, CMC pH5, CMC pH6, CMC pH7, CMC pH8, thích hợp ở

- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.

Hình 6: Kết quả so màu của ống ĐC và 6 ống nghiệm không phản ứng.

 Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng và 6 ống nghiệm có phản ứng với enzyme có màu đỏ Từ ống số 1 ở

pH 3 đến ống số 2 ở pH 4 màu đỏ đậm dần, từ ống số 3 ở pH 5 đến ống số 6 ở pH 8

màu đổ nhạt dần như hình 7.

Hình 7: Kết quả so màu của ống đối chứng và 6 ống nghiệm có phản ứng.

 Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540nm:

X6=0.126

f Biện luận sơ đồ:

- Theo đồ thị trên, ở pH=4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất, mà pH tối ưu là pH

có hoạt tính enzyme cao nhất

- Vượt quá pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm Vì vậy trong môi trườngcàng kiềm hay càng acid thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm

3 Xác định hàm lượng protein trước sắc ký.

a Nguyên tắc:

Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thục ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài

µg protein/ml,dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.

b Thực hành:

- Lấy tủa protein thu được ở bài 1, hòa trong đệm và pha loãng 100 lần, sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein trước sắc ký

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm gồm: 1 ống đối chứng và 1 ống thực nghiệm

 Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0

- Hút 1 ml nước cất cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie.

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

 Ống thực nghiệm: phản ứng enzyme

- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

c Kết quả:

- Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang ta thấy, ống đối chứng có màu xanh nhạt và ống thực nghiệm có màu xanh như ở hình 8

Hình 8: Kết quả so màu

- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có OD = 0.25

d Tính toán kết quả thu được:

Đường chuẩn protein có dạng y = Ax + B

Ta có đường chuẩn protein là: y = 0.003x + 0.0657

Ta lại có: OD = 0.25

Suy ra: x = = 61.4 ( µg/ml )

Vì được pha loãng 100 lần nên:

x = 61.4 (µg/ml)* 100 * 10 (ml) = 61400 ( µg ) = 61.4 (mg)

Vậy tổng hàm lượng protein là: = 61.4 (mg)

4 Xác định hoạt tính enzyme trước sắc ký.

i Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulose ở pH 5 và 40 0 C Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobeenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm.

 Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0

- Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều

- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong cốc nước mát Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm

 Ống nghiệm không có phản ứng enzyme

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme

- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều.

- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một cốc nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm

tỏ ở đây có xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC

pH5, như hình 9

Hình 9: Kết quả so màu

- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm:

+ Ống không phản ứng có OD = 0.036+ Ống phản ứng có OD = 1.541

iv Tính toán kết quả thu được:

Dựa vào phương trình: y = 1.303x + 0.003

Ta có: ODkpư = 0.036

ODpư = 1.541Suy ra OD = 1.505

Ta có phương trình: u = At – A0 * F * * * *

Bài 3: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50

1 Bước đầu tinh sạch enzyme cellulose bằng sắc ký lọc gel.

a Nguyên tắc

Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ

bị trì hoãn và di chuyển chaamjqua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh vàđược giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ

- Sau khi quá trình hydrat hóa xãy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt.Chuyển dung dịch vào một bình nút hút chân không có gắn với vòi hútchân không Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 phút-10 phút,

thỉnh thoảng lắc nhẹ bình Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel.

- Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ Để gel ổn định cho đến khi 90% - 95% số hạt ổn định Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn Lặp lạicông việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel

- Gắn phiểu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột

- Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí

- Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel

- Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đện với thể tích gấp 2 lần thể tíchlớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy

- Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel.Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị

 Chuẩn bị mẫu

- Hòa tan hoàn toàn protein trong dung dịch đệm, sau đó tiến hành lọc

Vì mẫu chạy sắc ký phải sạch

- Lọc mẫu qua milipore sẽ làm gia tăng độ bền /thời gian sử dụng của cột

c Kết quả

Trong 8 ống nghiệm trên ta lấy từ ống số 2 đến ống số 8, trộn chung lại để xác định hàm lượng protein sau sắc ký và họat tính enzeme sau sắc ký

2 Xác định hàm lượng protein sau sắc ký.

a Thực hành

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm: 1 ống đối chứng và 1 ống thực nghiệm

 Ống nghiệm đối chứng: chỉ quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0

- Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml dung dịch thuốc thử Coomassie

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

 Ống nghiệm thực nghiệm

- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml dung dịch thuốc thử Coomassie

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

b Kết quả

- Quan sát bằng mắt thường ta thấy: ống nghiệm đối chứng có màu xanh nhạc, ống nghiệm thực nghiệm có màu xanh đậm hơn như hình 11

Hình 11: kết quả so màu

- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm là OD = 0.265

c Tính toán kết quả thu được

Dựa vào phương trình y = 0.003x + 0.0657

Và ta có OD = 0.265

Suy ra x = = 88.3 ( µg/ml ) * 20 ( ml ) = 1766 ( µg )

= 1.766 ( mg )

Vậy tổng hàm lượng protein sau sắc ký là: = 1.766 ( mg )

3 Xác định hoạt tính enzyme sau sắc ký.

a Thực hànhChuẩn bị 2 ống nghiệm: 1 ống nghiệm đối chứng và 1 ống nghiệm thực nghiệm

 Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0

- Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm

- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều

- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm

b Kết quả:

- Quan sát bằng mắt thường ta thấy: ống đối chứng có màu vàng là màu của dung dịch DNS-lastose Ống có phản ứng với enzyme có màu đỏ đậm, chứng tỏ ở đây có xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5, như hình 12

Hình 12: Kết quả so màu

- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm có OD = 1.53

c Tính toán kết quả thu được:

Dựa vào phương trình: y = 1.303x + 0.003

Ta có kết quả đo độ bước sóng 540 nm là OD = 1.53

Ta có phương trình: u = (At-A0) * F * * * * 20 * 2