Công nghệ gen người

Định nghĩa tạo ra các cá thể có sự tổ hợp mới về đặc điểm di truyền.. – Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector và chuyển n

Công nghệ gen

TS Trần Cát Đông

Mục tiêu

Định nghĩa

tạo ra các cá thể có sự tổ hợp mới về đặc điểm

di truyền.

– Các thao tác tế bào, liên quan đến việc tạo tế bào lai

– Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo ra phân

tử ADN tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector và chuyển nó vào tế bào chủ

– Sản xuất lượng lớn gen đích

Đoạn gen

gen đích

Dòng tế bào mang gen đích

Nuôi cấy Chiết tách

Tạo dòng

Nghiên cứu chức năng

Thực hiện biến đổi Đưa trở lại

tế bào

Các công cụ cơ bản

– Chủng duy trì: mang các đột biến cho phép nhận và

ổn định ADN ngoại lai như DH5α, JM103, …

– Chủng biểu hiện: mang các đột biến giúp biểu hiện gen ngoại lai và ổn định protein tái tổ hợp như

BL21(DE3), BL21(DE3)plysS, …

vector sử dụng

Vector tạo dòng - Plasmid

 Plasmid

– Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp,

– Có điểm khởi đầu sao chép (Ori)

– Có vùng tạo dòng

– Các plasmid sau khi tái tổ hợp sẽ được đưa vào tế

bào chủ bằng cách biến nạp hay thẩm điện

– pGEM, pBR322 và pBluescript II, …

– pET, pGEX, …

 Dễ sử dụng, thao tác, đa năng

 Khó tạo dòng được các ADN lớn

Plasmid

Các vector từ phage lambda

đóng gói in vitro rất đơn giản và cần ít ADN đích

mẫu dò, khuếch đại và bảo quản trong một thời gian dài

 λ gt10, λ gt11, λ ZAP II, …

Vector cosmid

và có được các ưu thế của cả hai dạng vector

plasmid

Vector từ phage dạng sợi - M13

dòng.

tự hoặc làm khuôn mẫu để gây đột biến đặc hiệu điểm

Các enzym biến đổi acid nucleic

– Cắt ADN tại vị trí xác định

– Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù

– Lưu ý tính tương thích khi cắt nối

– ADN polymerase phụ thuộc ADN

– Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN)

– ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu

– ARN polymerase phụ thuộc ADN

– Nối hai đoạn ADN

Tạo đoạn ADN đích

Polymerase

PCR

– Trong điều kiện có sẵn nucleotid

– Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống

– biến tính dsADN thành các sợi đơn,

– ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN,

– enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với các ssADN mẫu

3’-OH

5’-P

nucleotid

PCR

Tổ chức vật liệu di truyền

Tính tương thích của phản ứng cắt nối

– Tế bào được xử lý với CaCl2

– Không phải loại tế bào nào cũng biến nạp được

Tạo dòng đoạn ADN nhỏ

 Tạo đoạn ADN đích

 Cắt ADN đích và vector

 Nối ADN đích và vector

 Biến nạp vào tế bào

 Kiểm tra dòng tế bào

Tạo dòng bằng phage λ

Tóm tắt các bước tạo dòng

– Dựa vào hoạt tính đặc hiệu

– Protein phải biểu hiện được

Biểu hiện gen tái tổ hợp

Sản xuất protein tái tổ hợp

– Hàm lượng rất thấp

– Qui trình sản xuất khó khăn và tốn kém

– Giá thành sản xuất rất cao

– Protein từ động vật lại không hoàn toàn giống ở người

– Nguy cơ nhiễm mầm virus hay prion

– Gen của người được tạo dòng và sản xuất nhờ vi sinh vật tái tổ hợp

– Sản phẩm có nguồn gốc từ người (gen của người)

– Các nồi lên men ở qui mô công nghiệp 2000-5000 lít

 Protein: nguyên thủy: 193 aa, hoạt động: 165 aa

 Protein bị glycosyl hóa mạnh

– Dòng tế bào BHK và ψ2

– Nuôi cấy bề mặt trên khay nhựa

– Thu dịch nuôi cấy để chiết sản phẩm

Mức tinh chế (lần)

Interferon

dịch để đáp ứng với virus, ký sinh trùng và tế bào u

 Tinh chế: sắc ký ái lực với Matrex Gel Blue A

 Loại chí nhiệt tố: RIEF (điện di đẳng điện)

Insulin tái tổ hợp

Hormon tăng trưởng

Vaccin viêm gan B tái tổ hợp

Chẩn đoán bằng lai hóa ADN