báo cáo phụ gia enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định. Enzyme có dạng hình hạt, hình cầu, có khối lượng phân tử lớn. Hòa tan trong nước, dung dịch muối loãng, dung môi hữu cơ có cực, không hòa tan trong dung môi không phân cực. Có tính đặc hiệu, chọn lọc cao. Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Enzyme dễ bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học.

BÀI 6: ENZYME 6.1 Cơ sở lý thuyết

6.1.1 Enzyme

6.1.1.1 Khái niệm chung về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định

Enzyme có dạng hình hạt, hình cầu, có khối lượng phân tử lớn

Hòa tan trong nước, dung dịch muối loãng, dung môi hữu cơ có cực, không hòa tan trong dung môi không phân cực

Có tính đặc hiệu, chọn lọc cao Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định

Enzyme dễ bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học

6.1.1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme

Enzyme xúc tác theo cơ chế chìa khóa, ổ khóa

Các giai đoạn trong quá trình xúc tác của enzyme: Trong phản ứng có sự tương tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme- cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm Qúa trình này thường xảy ra theo sơ đồ sau:

Hình 6.1 Cơ chế xúc tác của enzyme Giai đoạn 1: Tạo phức ES Giai đoạn này xảy ra nhanh, năng lượng hoạt hóa thấp Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp ES Phức ES tạo ra không bền, chỉ tồn tại trong thời gian ngắn

Giai đoạn 2: Hoạt hóa cơ chất Mức năng lượng hoạt hóa không cao Sự chuyển hóa cơ chất: Sự phân bố lại nội năng, sự chuyển vị electron, phá vỡ các liên kết đồng hóa trị, hình thành liên kết mới trong cơ chất Cơ chất bị kích thích, sẵn sàng chuyển hóa thành sản

Giai đoạn 3: Tạo thành sản phẩm E tự do, còn enzyme được giải phóng trở lại tình trạng tự do ban đầu để quay vòng xúc tác

6.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

Nồng độ enzyme

Nồng độ cơ chất

Nhiệt độ

pH

Chất hoạt hóa và chất kiềm hãm

Các yếu tố khác như ánh sáng, sự chiếu điện, sóng siêu âm

6.1.1.4 Nguồn thu nhận enzyme

Các nguồn khai thác thu nhận enzyme :

- Từ thực vật : urease, amylase, lipase, saccharose, papain,…

- Từ động vật : trypsin, cacboxyl – peptidaza, ribonucleaza, lipaza, pepxin,…

- Từ vi sinh vật : là giàu nguồn enzyme

- Từ vi sinh vật có thể tổng hợp nên hầu như tất cả các enzyme như : là nguồn phổ biến và giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất như gluco-oxydase lấy từ nấm mốc, catalaza lấy từ Aspergillus

6.1.1.5 Ứng dụng của enzyme

Enzyme thường được sử dụng theo hai cách sau:

- Không tách enzyme ra khỏi nguyên liệu, tạo điều kiện cho enzyme chuyển hóa các chất

có cùng trong nguyên liệu

- Tách enzyme khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm để sử dụng khi cần thiết

Enzyme được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc phân tử, định lượng các chất, công nghiệp và y học

Enzyme còn có nhiều vai trò khác trong chế biến thực phẩm như:

- Chuyển hóa các sản phẩm tự nhiên: Dưới tác dụng của enzyme, các sản phẩm tự nhiên chuyển hóa từ dạng này sang dạng khác, từ dạng phức tạp sang dạng đơn giản hơn

- Bảo quản thực phẩm: Giúp loại bỏ oxy và các sản phẩm gây bất lợi có trong thực phẩm

- Cải thiện cấu trúc và độ bền thực phẩm:

+ Amylase làm tăng độ nở bánh mì

+ Protease làm tăng độ giòn của biscuit

+ Cải thiện chất lượng cảm quan của thực phẩm

+ Dưới tác dụng của enzyme, mùi vị của sản phẩm sẽ được cải thiện, giúp cho sản phẩm

có mùi thơm hơn, vị đậm đà hơn

- Thực hiện các quá trình kĩ thuật:

+ Cắt mạch các chất cao phân tử thành những chất nhỏ hơn

+ Tạo màu sắc, hương vị cho thực phẩm

Sử dụng thành công enzyme trong một quá trình chế biến công nghiệp phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Quá trình sử dụng phải đơn giản, dễ thực hiện

- Giá thành của chế phẩm enzyme phải thấp

- Enzyme có hoạt tính cao, có thể hoạt động trong điều kiện cơ chất có nồng độ cao

- Phải nắm vững các điều kiện tối thích cho enzyme có hoạt tính cao nhất: pH, nhiệt độ, thời gian, nồng độ cơ chất…

6.1.1.6 Nhóm các Enzyme thường được sử dụng trên thị trường

Protease(59%): Được dùng phần lớn trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa Chỉ khoảng 20% là rennet được dùng trong sản xuất phomai và một phần nhỏ trong công nghệ chế biến thịt

Carbonhydrase(28%): Được sử dụng chủ yếu là amylase, gluco isomerase, pectinase

Lipase(3%): Xúc tác cho phản ứng thủy phân triaxylglixerol( dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành các axit béo tự do glixerol

Oxidase và một số loại khác(10%): Được dùng chủ yếu là polyphenoloxidase, peroxidase

6.1.2 Enzyme pectinase

6.1.2.1 Khái niệm

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có trong mạch polyme của pectin

6.1.2.2.Nguồn gốc enzyme pectinase

Enzyme pectinase trong tự nhiên có ở thực vật, vi sinh vật Ở thực vật, sự thủy phân pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Vì vậy nó có vai trò rất quan trọng trong quá trình chín tự nhiên của trái cây hay trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

6.1.2.3 Thu nhận

Hiện nay có hai phương pháp sản xuất pectinase:

- Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphoric…

- Thu chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu

+ Phương pháp hiếu khí: Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng

phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn pH của môi trường nuối cấy thường đạt từ 6 – 7,2

là thích hợp

+ Phương pháp yếm khí: môi trường là bã củ cải 2%; (NH4)2SO4 0,75%; KH2PO4 0,1%; CaCO3 0,3%; nước chiết ngô 0,5% Pectinase cũng có khoảng pH và nhiệt độ tối ưu cho

sự hoạt động của nó Enzyme pectinase dưới dạng thương phẩm có khoảng pH tối ưu là 4.5 – 5.5 và nhiệt độ tối ưu là 45 – 55oC

6.1.2.4 Ứng dụng enzyme pectinase:

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau:

- Sản xuất rượu vang

- Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, …

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

Vì nó có tác dụng:

- Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả

- Làm trong dịch quả, giảm độ nhớt của dịch quả giúp quá trình lọc được tốt hơn

6.1.3 Rau má

Rau má hay tích tuyết thảo hoặc lôi công thảo (danh pháp hai phần: Centella

asiatica) là một loài cây một năm thân thảo trong phân họ Mackinlayoideae của họ Hoa tán (Apiaceae), có nguồn gốc Australia, các đảo Thái Bình Dương, New Guinea,

Melanesia, Malesia và châu Á Nó được sử dụng như một loại rau cũng như trong y học Ayurveda và y học cổ truyền Trung Hoa Tên khoa học đồng nghĩa là Hydrocotyle

asiatica L., Trisanthus cochinchinensis Lour

Theo Trung y, rau má có tính hàn (lạnh), tân (cay), khổ (đắng) Khi ăn ở dạng tươi như một loại rau, người ta cho rằng nó giúp cho việc duy trì sự trẻ trung Nước sắc từ lá rau má được coi là có tác dụng hạ huyết áp Loại nước sắc này cũng được coi là một loại thuốc bổ dưỡng để có sức khỏe tốt (tăng trí nhớ, thị lực) Loại thuốc đắp từ lá cũng được dùng để điều trị những chỗ đau, hạ sốt Nó còn được dùng trong điều trị các chứng phù; viêm thanh quản, tĩnh mạch, phế quản; các bệnh trĩ, phong, eczema hay vẩy nến; giải ngộ độc sắn và lợi tiểu

Một vài báo cáo khoa học cho thấy khả năng của rau má trong việc hỗ trợ làm lành vết thương Khi điều trị bằng rau má, sự liền sẹo được kích thích bằng việc sản xuất ra các

chất keo loại I Việc điều trị này cũng cho thấy sự giảm sút đáng kể của các tác động viêm nhiễm và việc tạo ra các nguyên bào sợi

Các nhà thảo mộc học còn cho rằng nó có chứa nhân tố trường thọ gọi là 'Vitamin

X trẻ trung, có tác dụngbổ dưỡng cho não và các tuyến nội tiếtvà xác nhận rằng nước chiết từ rau má giúp cải thiện các vấn đề về hệ tuần hoàn và da

Hình 6.2 Rau má

6.2 Mục tiêu thí nghiệm

Xác định thể tích dịch thu được, pH, độ nhớt, nồng độ chất khô,… của mẫu rau quả

có bổ sung phụ gia và mẫu đối chứng Từ đó giúp cho sinh viên tìm hiểu vai trò của enzyme trong thực phẩm, thực hiện các thao tác bằng cách bổ sung enzyme vào thực phẩm Quan sát những sản phẩm thực phẩm khi có và khi không có phụ gia

6.3 Phương pháp tiến hành

Sử dụng enzyme pectinase nhằm hai mục đích cơ bản:

- Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả

- Làm trong, giảm độ nhớt và ổn định chất lượng nước

Phương pháp phân tích:

- Tiến hành đo thể tích các mẫu bằng ống đong, so sánh giữa các mẫu trắng và mẫu thử có

xử lý enzyme ở lượng khác nhau

- Xác định độ nhớt bằng nhớt kế và đồng hồ bấm giây

- Xác định độ brix bằng brix kế và pH bằng giấy pH

- Quan sát màu sắc, độ trong rồi so sánh giữa các mẫu

6.4 Dụng cụ và hóa chất

6.4.1 Dụng cụ

Vải lọc, bông thấm nước pH kế hoặc giấy pH

Phiễu thủy tinh, đũa khuấy Đồng hồ bấm giây

6.4.2 Hóa chất

Pectinase

Nước cất

6.5 Cách tiến hành

6.5.1 Sơ đồ quy trình

Rau má

Xử lý Rác, lá dập, úa Cắt nhỏ

Xay

Enzyme pectinase Xử lý enzyme

Lọc Bã

Xác định V, độ pH, độ Brix, độ nhớt, màu sắc, độ trong

So sánh để tìm kết quả

6.5.2 Thuyết minh quy trình

Xử lý: Xử lý nguyên liệu nhằm tạo thuận lợi cho những khâu tiếp theo Loại bỏ những phần không dùng được như rác, lá úa, dập sau đó rửa sạch

Cắt nhỏ: Làm nhỏ nguyên liệu, thuận lợi cho quá trình xay nhuyễn

Xay nhuyễn: Nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào để tách chiết dịch được dễ dàng hơn Xay nhuyễn rau má đã cắt nhỏ cùng với nước cất theo tỉ lệ 1:2

Xử lý enzyme: Khảo sát hiệu suất trích ly dịch, màu sắc, độ brix, độ nhớt và độ trong của dịch sau khi xử lý qua enzyme Tiến hành khảo sát việc xử lý enzyme với mẫu trắng và ba mẫu nồng độ 0,05 %, 0,1% và 0,2% enzyme pectinase trong vòng 30 phút Mỗi cốc 100g dịch rau má và lặp lại mỗi mẫu 2 lần Sau đó đun cách thủy 90oC trong vòng 5 phút

Lọc: Nhằm tách loại bã để thu dịch Vì để tránh nhiễm bẩn vào mẫu dịch thu được nên không thể dùng thiết bị lọc chân không để thu dịch Do đó cần sử dụng giấy lọc và phễu lọc để lọc thủ công

Sau đó ta tiến hành xác định thể tích, độ nhớt, độ Brix : Mục đích để kiểm tra và

so sánh số liệu

6.6 Kết quả

6.6.1 Số liệu ban đầu

Hình 6.3 Các mẫu dịch thu được lần 1

Hình 6.4 Các mẫu dịch thu được lần 2

Bảng 1 Bảng số liệu thí nghiệm đo được

Thời gian chảy (s) 9.16 9.24 9.51 8.34 9.56 8.88 9.33

Thời gian chảy của nước cất: 8.29s

Với:

- Độ trong: Màu nâu vàng (đậm nhất) ứng với 4 điểm Cường độ màu giảm dần tương ứng với 3 điểm, 2 điểm và 1 điểm

- M0 là mẫu không qua xử lý enzyme

- M1 là mẫu có bổ sung 0,05% enzyme pectinase

- M2 là mẫu có bổ sung 0,1% enzyme pectinase

- M3 là mẫu có bổ sung 0,2% enzyme pectinase

6.6.2 Xử lý số liệu

Mức độ giảm độ nhớt của dung dịch khi sử dụng pectinase:

Trong đó :

- Et0 là thời gian chảy của dịch không xử lý enzyme (giây)

- Et1 là thời gian chảy của dịch có xử lý enzyme (giây)

- Etw là thời gian chảy của mẫu nước cất (giây)

- N là mức độ giảm nhớt của dịch đã xử lý enzyme (%)

Bảng 2 Số liệu thực nghiệm sau khi xử lý

Mức giảm độ nhớt N

6.7 Nhận xét và biện luận

6.7.1 Nhận xét

Về độ trong: Trong dần từ mẫu 0 đến mẫu 3 Mẫu 0 có màu vàng nâu đậm nhất và giảm dần đến mẫu 3 có màu vàng nâu nhạt nhất Do dưới tác dụng của enzyme pectinase phân giải protopectin thành dạng pectin hòa tan nên làm dịch rau trong hơn, màu nhạt hơn

Về thể tích dịch thu được: Có sự biến thiên giữa các thể tích thu được Trong quá trình làm, do thời gian hạn hẹp nên để thúc đẩy quá trình lọc phải dùng nhiều cách khác

nhau như dùng đũa khuấy hay gạn nước Do đó việc thất thoát dịch lọc là điều không tránh khỏi Từ đó dẫn đến sai số khá nhiều Thể tích dịch lọc ở mẫu 0 là nhiều nhất bởi vì ban đầu không thúc đẩy quá trình lọc

Về độ Brix: Độ Brix tăng dần từ mẫu 0 đến mẫu 3 nhưng tăng không đáng kể Do việc xử lý enzyme làm tăng hàm lượng chất khô hòa tan vào dịch rau nên làm cho độ Brix tăng lên, tuy nhiên xử lý enzyme với liều lượng vừa phải nên không làm tăng hàm lượng chất khô quá nhiều

Về độ pH: Độ pH gần như không thay đổi với cả 4 mẫu ( pH=5 )

Về thời gian chảy của dịch: Có sự biến thiên không theo xu hướng tăng hay giảm Trong quá trình làm, việc canh thời gian gây sai số

Về mức giảm độ nhớt: Độ nhớt có sự biến thiên giữa các mẫu Xảy ra sai số âm và

sự biến thiên không trật tự này là do sai số ở việc đo thời gian chảy của dịch

6.7.2 Biện luận

6.7.2.1 Trình bày và giải thích vai trò của enzyme pectinase

Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào(thành tế bào) Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào.Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau Pectinase sẽ phá vỡ sự gắn kết này tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào giúp quá trình thu nhận dịch quả tốt hơn

Làm trong và ổn định chất lượng nước quả Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa nhiều chất khác nhau.Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả.Pectinase tham gia phân giải pectin ở gian bào làm cho các tế bào khó liên kết với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra

Tăng hàm lượng đường trích ly, cải thiện màu sắc và giảm độ nhớt sản phẩm

6.7.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, khi ta tăng nồng độ enzyme thì tốc

độ phản ứng tăng

Nồng độ cơ chất: Với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì

sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của enzyme Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hoà bởi cơ chất

Nhiệt độ: Độ bền nhiệt của enzyme thường tăng lên khi có cơ chất, coenzyme,

Ca2+ Mỗi enzyme đều có một nhiệt độ tối ưu riêng Khi chưa đạt đến nhiệt độ tối ưu của enzyme thì nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng càng tăng Khi tăng nhiệt độ vượt qua nhiệt độ tối ưu thì enzyme sẽ bị biến tính, không thực hiện phản ứng xúc tác được nữa

pH : Khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới liên kết của cơ chất và enzyme, thay đổi cấu trúc không gian của enzyme, từ đó ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme pH tối ưu của phần lớn enzyme vào khoảng 7 Tuy nhiên một số enzyme có pH tôí ưu rất thấp (pepsin) hoặc rất cao (subtilisin) Ứng dụng yếu tố pH trong việc tăng tốc độ phản ứng nhờ pHopt, tách chiết enzyme, tinh sạch enzyme (nhờ pH thuận nghịch), vô hoạt enzyme (nhờ pH bất thuận nghịch)

Các chất kìm hãm:

- Chất kìm hãm (chất ức chế) là những chất mà khi kết hợp với enzyme sẽ làm giảm hoạt tính enzyme

- Ký hiệu I (inhibitor)

- Sự ức chế enzyme là những ức chế đặc hiệu và đặc trưng riêng cho từng enzyme

- Dựa vào các hình thức ức chế đặc hiệu, người ta chia làm 2 nhóm chính:

+ Ức chế không thuận nghịch: Loại bỏ I, E không khôi phục hoạt tính ban đầu

+ Ức chế thuận nghịch: Loại bỏ I, E khôi phục hoạt tính ban đầu

Các chất hoạt hóa:

- Chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, từ trạng thái hoạt động yếu sang trạng thái hoạt động mạnh

- Bản chất hóa học:

+ Chất hoạt hóa gián tiếp: Tham gia phản ứng nhưng không tác dụng trực tiếp với enzyme

+ Chất hoạt hóa trực tiếp: Tác dụng vào trung tâm hoạt động enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình không gian enzyme

Các yếu tố khác:

- Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme Ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất

- Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao, phá hủy càng mạnh Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp