Nghiên cứu này xây dựng bộ KIT để phân biệt thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt này trở nên đơn giản hơn. Kết quả này hi vọng góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt. Mời các bạn cùng tham khảo!
Trang 1XÂY DỰNG BỘ KIT PHÂN BIỆT THỊT HEO VÀ THỊT BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ
Hồ Viết Thế*, Ngô Thị Kim Anh, Phạm Thị Tuyết Trinh
Nguyễn Hiếu Thuyên, Hồ Lê Quỳnh Trinh
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM
*Tác giả liên lạc: thehv@cntp.edu.vn
TÓM TẮT
Xác định các loại thịt bằng phương pháp sinh học phân tử trở nên phổ biến trong những thập niên qua vì mức độ chính xác cao Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex PCR thông qua việc khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên hai gene ty thể là COI và ND5 Kết quả tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR đượ hoàn thiện thành bộ KIT Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng bộ KIT đạt độ chính xác cao
và có thể áp dụng cả ở thịt tươi và các sản phẩm thịt đã qua chế biến
Từ khóa: Thịt bò, thịt heo, multiplex PCR, KIT
DEVELOP MOLECULAR BIOLOGY- BASED KIT TO DISTINGUISH
BETWEEN PORK AND BEEF
Ho Viet The*, Ngo Thi Kim Anh, Pham Thi Tuyet Trinh
Nguyen Hieu Thuyen, Ho Le Quynh Trinh
Ho Chi Minh city University of Food Industry
*Corresponding Author: thehv@cntp.edu.vn
ABSTRACT
Identifying meat by molecular markers has become ubiquitous in the past decades In this study, multiplex PCR –based detectionn KIT was developed to distinguish between pork and beef relying on the presence of specific DNA fragments on two mitochondrial genes consisting of COI and ND5 After optimization, the obtained KIT could differentiate beef from pork with high accuracy and this KIT is also applicable for identifiying both raw meats and meat-proccessed products
Keywords: Beef, pork, multiplex PCR, KIT
MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển về kinh tế, nhu cầu sử
dụng thực phẩm chất lượng cao cũng tăng
theo, đặc biệt trong đó có thịt bò [1] Tuy
nhiên, hiện nay nhiều trường hợp người buôn
bán vì lợi nhuận đã dùng hóa chất để làm giả
thịt bò từ nguyên liệu là các loại thịt khác [2]
Điều này gây ảnh hưởng đến việc kinh doanh,
sản xuất cũng như sức khỏe người tiêu dùng
Vì vậy, việc tìm ra phương pháp phân biệt thịt
heo và thịt bò một cách nhanh chóng, chính
xác phục vụ người tiêu dùng cùng các nhân
viên kiểm tra thực phẩm là hết sức cần thiết
Những phương pháp phân biệt thịt heo, thịt bò
hiện nay chủ yếu dựa trên màu sắc, mùi vị, độ
dai của thịt bò nhưng đối với những loại thịt
bò tẩm hóa chất hay các sản phẩm đã qua chế
biến thì phương pháp trên cho độ chính xác
thấp hoặc không thể thực hiện [2] Trong
những thập niên gần đây, nhờ sự phát triển của
sinh học phân tử nên các phương pháp phân biệt thịt dựa vào DNA cho kết quả chính xác hơn Trong đó, phương pháp PCR dễ thực hiện, cho kết quả chính xác với độ nhạy cao trong thời gian ngắn [3] Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Matsunaga đã phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt tươi và thịt chế biến bằng kỹ thuật multiplex PCR [4] Gần đây, Kitpipit và cộng sự đưa ra những bước tiến mới trong việc phát hiện các loại thịt bằng cách thực hiện PCR trực tiếp mà không cần tách chiết DNA trước với primer được thiết kế từ cytochrome ty thể (cyt b), cytochrome oxidase I (COI), và 12s rRNA [5] Phương pháp hiện đại và chính xác nhất hiện nay để phát hiện và phân biệt các loại thịt là PCR định lượng [6], tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền nên chưa được sử dụng phổ biến Một bước cải tiến mới của phương pháp PCR là
Trang 2multiplex PCR, đây là kỹ thuật giúp nhanh
chóng phát hiện nhiều gen mục tiêu trong
cùng một phản ứng từ đó rút ngắn được thời
gian đưa ra kết quả cũng như tận dụng được
các thiết bị PCR truyền thống có mặt phổ biến
ở các phòng thí nghiệm Trong nghiên cứu này
chúng tôi xây xây dựng bộ KIT để phân biệt
thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex
PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt
này trở nên đơn giản hơn Kết quả này hi vọng
góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại
đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản
phẩm chế biến từ thịt
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Mẫu được thu thập từ lò mổ, siêu thị và các
chợ ở trên địa bàn quận Tân Phú, thành phố
Hồ Chí Minh Các sản phẩm chế biến từ hai
loại thịt này được thu thập tại các chợ và siêu thị Sau khi thu thập, mẫu được mã hóa bảo quản ở -80 oC đến khi sử dụng
Phương pháp
Mẫu được rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tiến hành tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lương Quý Phương [7] Tuy nhiên, chúng tôi thay đổi thời gian ly giải thịt từ 30 phút lên 1 giờ
và tủa DNA bằng isopropan thay vì sử dụng ethanol tuyệt đối DNA sau khi tách chiết được định tính bằng phương pháp điện di 110V trong 20 phút và định lượng bằng phương pháp đo quang phổ
Sau đó, tiến hành phản ứng PCR với các cặp primer được thiết kế dựa trên đoạn gene COI đối với heo và đoạn gene ND5 đối với bò (Bảng 1) Các cặp primer đã được sử dụng trong nghiên cứu của các nhóm Spychaj [8] và Motalib [9]
Bảng 1 Trình tự các primer xuôi và ngược
Độ dài sản phẩm (bp)
Tài liệu tham khảo
Heo 5’- GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3’ 5’- TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3’ COI 294 [8]
Bò 5’- GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGG-3’ 5’- GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAG-3’ ND5 106 [9]
Phản ứng PCR được thực hiện theo từng cặp primer
với từng loại DNA mẫu thịt khác nhau của heo và
bò Sau đó chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ
DNA tối ưu cho phản ứng PCR, bao gồm các nồng
độ 50 ng/µl, 100 ng/µl, 150 ng/µl và nồng độ
primer tối ưu bao gồm các nồng độ 5 µM, 10 µM,
15 µM cho mỗi phản ứng Sau khi tối ưu hóa các
nồng độ DNA và nồng độ primer ở thí nghiệm
trước, chúng tôi thử nghiệm tính chuyên biệt của
các cặp primer trong phản ứng multiplex PCR
Tiếp theo, chúng tôi tối ưu hóa nồng độ các cặp
primer cho phản ứng multiplex PCR và tối ưu hóa
nhiệt độ bắt cặp ở các nhiệt độ 52oC, 53oC, 54oC,
55oC, 56oC, 57oC Tổng thể tích phản ứng PCR là
20 µl, bao gồm: MyTaqTM HS Mix White 2X 8
µl, primer 1 µl, DNA mỗi loại thịt 1 µl và nước
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt
như sau: biến tín ban đầu 94oC - 1 phút; 35 chu kỳ:
94oC - 1 phút, 54oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; kéo
dài kết thúc 72oC - 5 phút
Sau đó, quy trình multiplex PCR hoàn thiện được
sử dụng để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các mẫu thực phẩm chế biến từ thịt
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tách chiết DNA
Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi được thể hiện ở Hình 1 Các band DNA thu được sau khi ly trích rõ ràng, nồng độ khá cao Đối với các mẫu DNA tách chiết từ thực phẩm được trình bày ở Hình 2 Kết quả điện di cho thấy DNA bị đứt gãy và nhiễm tạp nhiều nên các band mờ, kéo các vạch dài Nguyên nhân có thể là do trong các sản phẩm này chứa nhiều bột, các chất phụ gia, ít thịt và đã qua chế biến nên gây cản trở cho việc tách chiết Tuy nhiên, nồng
độ DNA thu được khá cao, chứng tỏ quy trình có thể tách chiết được DNA trong các sản phẩm từ thịt DNA được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR và multiplex PCR (Hình 7 và Hình 8)
Trang 3Hình 1a Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi
(H1, H2: mẫu thịt heo tươi; B1, B2: mẫu thịt bò tươi)
Hình 1b Kết quả tách chiết DNA từ các sản phẩm thịt đã qua chế biến
(XH, XB: xúc xích heo, bò; CH: chả heo; BV: bò viên)
Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nồng độ
DNA cho mỗi loại thịt
Nồng độ DNA và nồng độ primer có ảnh hưởng
quan trọng đến tính chính xác, độ nhạy của phản
ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Bên
cạnh đó, vào năm 2013 Marin và cộng sự cũng đã
tiến hành tối ưu hóa nồng độ primer để thu được kết
quả PCR tốt nhất [10] Nghiên cứu của Jonker và
cs (2008) chỉ ra rằng nồng độ DNA trong khoảng
50 đến 250 ng không gây ra các phản ứng chéo giữa các DNA động vật Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ primer và nồng độ DNA cho phản ứng PCR phát hiện DNA thịt heo và thịt bò Kết quả được trình bày ở Hình 2 và Hình 3
Hình 2 Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA heo
(M: thang chuẩn DNA)
Trang 4Hình 3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA bò
(M: thang chuẩn DNA)
Từ kết quả quan sát được ở Hình 2 và Hình 3 cho
thấy các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt cho heo
và bò có kích thước phù hợp với các nghiên cứu
trước [8,9] Chúng tôi nhận thấy nồng độ primer có
ảnh hưởng lớn tới kết quả phản ứng PCR vì ở cùng
1 nồng độ DNA nhưng cho những sản phẩm
khuếch đại có độ sáng khác nhau tăng dần theo
nồng độ primer Đối với phản ứng phát hiện thịt
heo, nồng độ DNA ở 5 µM cho kết quả tốt nhất,
trong khi đó nồng độ 10 µM phù hợp với việc phát
hiện thịt bò hơn Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn
nồng độ tối ưu cho phản ứng như sau: nồng độ
DNA 50 ng/µl cho hai loại thịt và nồng độ primer
heo, bò lần lượt là 5 µM, 10 µM để thực hiện phản
ứng multiplex PCR cho thịt heo và thịt bò ở thí
nghiệm tiếp theo
Kết quả thử nghiệm tính chuyên biệt các cặp
primer trong phản ứng multiplex PCR
Trong phản ứng multiplex PCR việc kết hợp nhiều
primer và nhiều DNA sẽ dễ dẫn đến trường hợp
nhiễm chéo hay còn gây ra hiện tượng dương tính
giả nên việc tìm ra được cặp primer chuyên biệt cho
mỗi loại DNA là rất quan trọng Chính vì vậy,
chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ chuyên biệt
trong phản ứng multiplex của hai cặp primer đã
chọn Kết quả được trình bày ở Hình 4
Hình 4 Kết quả multiplex PCR chuyên biệt
(N: mẫu đối chứng âm; 1: primer heo, primer bò và DNA heo; 2: primer heo, primer bò và DNA bò; 3: primer heo, primer bò, DNA heo và DNA bò; M: thang chuẩn DNA)
Kết quả cho thấy các mẫu không bị nhiễm chéo, các band sản phẩm khuếch đại rõ ràng, kích thước tương ứng với các nghiên cứu trước [8,9] Các cặp primer có tính chuyên biệt cao có thể đáp ứng cho các phản ứng multiplex PCR phân biệt thịt heo và thịt bò
Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR
Do khi kết hợp nhiều primer với các nồng độ không phù hợp trong một phản ứng multiplex PCR sẽ xảy
ra sự khuếch đại không đồng đều giữa các locus, một số sản phẩm khuếch đại có thể khó quan sát được sau phản ứng [11] Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ primer cho phản ứng này, kết quả được trình bày ở Hình 5
Trang 5Hình 5 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex PCR phát hiện DNA heo và DNA
bò (M: thang chuẩn DNA) Quan sát Hình 5, chúng tôi thấy có sự khác biệt khi
kết hợp các nồng độ primer khác nhau trong một
phản ứng multiplex PCR Kết quả này cho thấy cần
có nồng độ primer tương ứng khi kết hợp các
primer trong một phản ứng multiplex PCR Trước
đó, nhóm nghiên cứu của Markoulatos cũng đã sử
dụng các nồng độ primer khác nhau trong một phản
ứng multiplex PCR [12] Ở Hình 5, các mẫu ở
giếng số 5, 6, 8, 9 cho hai sản phẩm khuếch đại heo
và bò đều sáng rõ và dễ quan sát Vì vậy, chúng tôi
quyết định chọn nồng độ primer heo 5 µM, nồng
độ primer bò 10 µM (giếng số 5) để thực hiện phản ứng multiplex PCR heo, bò và viết hướng dẫn sử dụng cho bộ KIT
Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp cũng là một yếu tố quan trọng trong multiplex PCR vì mỗi cặp primer
có nhiệt độ bắt cặp khác nhau nên khi kết hợp trong một phản ứng cần tìm được một nhiệt độ phù hợp
để kết quả của phản ứng là tốt nhất [11] Nên chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo và bò Kết quả được trình bày
ở Hình 6
Hình 6 Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo, bò
(M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC)
Tại Hình 6, kết quả thu ở tất cả các nhiệt độ bắt cặp
khảo sát đều cho sản phẩm khuếch đại rõ, sáng đều
như nhau Nên ở các nhiệt độ đã khảo sát không
gây ra sự thay đổi cho sản phẩm multiplex PCR heo
và bò Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ
bắt cặp là 57oC làm nhiệt độ thích hợp nhất cho
phản ứng multiplex PCR heo và bò Vì ở nhiệt độ
bắt cặp cao, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm sẽ thấp
hơn, ngoài ra quy trình PCR cũng sẽ tiến hành
nhanh hơn do mức dao động giữa nhiệt độ biến tính
và nhiệt độ bắt cặp thấp hơn
Chúng tôi thử nghiệm với các mẫu thực phẩm được lấy từ các khu chợ và siêu thị khu vực quận Tân Phú, thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu được thử: xúc xích heo, chả quế, xúc xích bò và bò viên Kết quả tách DNA được thể hiện ở Hình 1b Qua đây cho thấy rằng DNA của sản phẩm từ thịt bị đứt gãy làm chất lượng giảm đi rõ rệt so với DNA ly trích
từ thịt tươi (Hình 1a), tuy nhiên kết quả ly trích DNA ly trích từ sản phẩm từ thịt qua chế biến vẫn phù hợp để thực hiện phản ứng PCR phát hiện riêng biệt từng loại thì (Hình 7) hoặc phản ứng muliplex
Trang 6Hình 7 Kết quả PCR đơn của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến
(M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo)
Hình 8 Kết quả multiplex PCR của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến
(M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Qua kết quả ở Hình 8, chúng tôi nhận thấy trong
các sản phẩm xúc xích heo, bò viên và xúc xich heo
có sự hiện diện của DNA cả bò và heo, chứng tỏ có
sự lẫn tạp trong thành phần nguyên liệu hoặc sự pha
trộn của các loại thịt này Đối với mẫu xúc xích bò
và bò viên là hành vi gian dối trong kinh doanh sản
xuất vì có sự sai khác với các nguyên liệu được in
trên bao bì, đây là điều cần phải thanh kiểm tra kỹ
hơn, nhất là ở các mặt hàng xuất khẩu sang các
nước không sử dụng thịt heo như các nước đạo Hồi Duy nhất mẫu chả heo là không phát hiện diện DNA từ bò, chứng tỏ quy trình sản xuất sản phẩm này đạt tiêu chuẩn chất, và điều này cũng có thể dễ hiểu vì đây là sản phẩm của một công ty thực phẩm lớn trên thị trường Từ quy trình trên, chúng tôi phát triển thành bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò (Hình 9)
Hình 9 Bộ kít phát hiện và phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex- PCR KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình multiplex PCR để phân biệt thịt heo và thịt bò Quy trình này cũng có khả năng phát hiện
Trang 7sự có mặt của thịt heo, thịt bò trong một số sản
phẩm thực phẩm đã qua chế biến Qua nghiên cứu
này cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc sử dụng
sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật multiplex PCR
để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các nguyên liệu
thực phẩm và sản phẩm chế biến từ thịt Với bộ KIT này, chúng tôi cũng đang tiếp tục hoàn thiện để sản phẩm này có thể sớm triển khai vào thực tế
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phòng thương mại và công nghiệp Việt Nam, 2016, wesite:http://vcci-hcm.org.vn/diem-nhan-thi-truong/nganh-thit-viet-nam-%E2%80%93-co-hoi-va-thach-thuc-tt6357.html
Http://tuoitre.vn/lai-phat-hien-thit-heo-gia-bo-1082770.htm
Martín I, García T, Fajardo V, López-Calleja I, Rojas M, Pavón MA, Hernández PE, González I, Martín
R (2007) Technical note: detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction Meat Science 76: 721-729
Matsunaga, T., Chikuni K., Tanabe R et al (1999) A quick and simple method for the identification of meat species and meat product by PCR assay Meat science 51 (2): 143-148
Kitpipit, T., Thanakiatkrai, P., & Chotigeat, W (2013) Direct PCR-FINS: Wildlife species identification without DNA extraction Forensic Science International, Genetics Supplement Series
Iwobi, A., Sebah, D., Kraemer, I et al (2015) "A multiplex real-time PCR method for the quantification
of beef and pork fractions in minced meat" Food Chemistry 169: 305-313
Lương Quý Phương (2006), Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR phát hiện gene halothan trên heo, Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Spychaj A, Marlena Szalata, Ryszard Słomski and Edward Pospiech (2015) Identifi cation of Bovine, Pig and Duck Meat Species in Mixtures and in Meat Products on the Basis of the mtDNA Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Sequence, Pol J Food Nutr Sci., 66(1): 31–36
Motalib Hossain M A., Eaqub Ali, Sharmin Sultana, Asing, Sharmin Quazi Bonny, Md Abdul Kader and M Aminur Rahman (2017) Quantitative Tetraplex Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay with TaqMan Probes Discriminates Cattle, Buffalo, and Porcine Materials in Food Chain, Journal of Agricultural and Food Chemistry 65(19):3975-3985
Marín A, Takafumi Fujimoto, Katsutoshi Arai (2013) Rapid species identification of fresh and processed scallops by multiplex PCR, Food Control, 32: 472-476
Henegarui O, Heerema N.A, Dlouhy.S.R, Vance G.H và Vogt P.H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol Biotechniques Journal, 23: 504-511