XÂY DỰNG các KIT CHẨN đoán tác NHÂN gây BỆNH TAI XANH và BỆNH TIÊU CHẢY cấp TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH học PHÂN tử

THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 1 Tên đề tài XÂY DỰNG CÁC KIT CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH TAI XANH VÀ BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG 6 Thuộc Chương trình Ghi rõ tên chương t

B1-2-TMĐT

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài

XÂY DỰNG CÁC KIT CHẨN ĐOÁN TÁC

NHÂN GÂY BỆNH TAI XANH VÀ BỆNH TIÊU

CHẢY CẤP TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG

6 Thuộc Chương trình (Ghi rõ tên chương trình, nếu có), Mã số:

Thuộc dự án KH&CN; Đề tài độc lập;

8 Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Nguyễn Thị Hoàng

Ngày, tháng, năm sinh: 16/04/1972 Nam/ Nữ: Nữ

Địa chỉ tổ chức: 260 Phạm Văn Thuận, Phường Thống Nhất, Biên Hòa, Đồng Nai Địa chỉ nhà riêng: 45 KP4, Phường Bửu Long, Biên Hòa, Đồng Nai

Đồng chủ nhiệm đè tài

Họ và tên: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Ngày, tháng, năm sinh: 19/10/1959 Nam/ Nữ: Nữ

Fax: 38304924 E-mail: hhtduong@hcmuns.edu.vn

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Khoa học và Tự nhiên tp HCM

Địa chỉ tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM

Địa chỉ nhà riêng:

9 Thư ký đề tài

Họ và tên: Trịnh Thị Thanh Huyền

Ngày, tháng, năm sinh: 27/03/1985 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Kỹ sư

Chức danh khoa học:

Chức vụ: Chuyên viên sở Khoa học công nghệ Đồng Nai

Điện thoại:

Tổ chức: 0613.82297 Nhà riêng: 0613990118 Mobile: 0917737270 Fax: 0613.825585 E-mail: thanhhuyencnsh@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học-Sở Khoa học công nghệ Đồng Nai

Địa chỉ tổ chức: 260, Phạm Văn Thuận, phường thống nhất, Biên Hòa, Đồng Nai

Địa chỉ nhà riêng: 45D/Cư Xá Lắp Máy 45/4, Kp5, P.Trảng Dài, Biên Hòa, Đồng Nai

Địa chỉ: 260, Phạm Văn Thuận, phường thống nhất, Biên Hòa, Đồng Nai

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Giám đốc trung tâm: ThS.: Nguyễn Thị Hoàng

Số tài khoản: 946.04.00.01266 tại Kho bạc Nhà nước Việt Nam

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Đồng Nai

11 Các tổ chức phối hợp chính thực hiện đề tài (nếu có)

1 Tổ chức 1: Công ty TNHH CNSH Khoa Thương

Điện thoại: (08)3761 2606 Fax: (08) 3761 2603

Địa chỉ: 17 Đường Số 4, KDC Gia Hòa, Phong Phú, Bình Chánh, TP Hồ Chí Minh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Mỹ Quan

Số tài khoản: 9628359

Ngân hàng: Tại Ngân Hàng TMCP Á Châu (ACB)

2 Tổ chức 2: Chi Cục Thú Y Dồng Nai

Tên cơ quan chủ quản: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Đồng Nai

Điện thoại: Fax: Địa chỉ: Đường Đồng Khởi, KP3, P.Tam Hòa, TP Biên Hòa

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Văn Quang – Chi cục phó Chi cục Thú y Đồng Nai

(Ghi những người có đóng góp khoa học và chủ trì thực hiện những nội dung chính thuộc tổ

chức chủ trì và tổ chức phối hợp tham gia thực hiện đề tài, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm

đề tài)

Họ và tên, học

hàm học vị

Tổ chức công tác

Nội dung công việc tham gia Thời gian làm

việc cho đề tài

(Số tháng quy đổi2)

1 Nguyễn Thị

Hoàng

Sở Khoa Học

& Công Nghệ Đồng Nai

Chủ nhiệm đề tài – chịu trách nhiệm về điều phối thực hiện đề

Đồng chủ nhiệm đề tài – chịu trách nhiệm về nội dung nghiên

cứu

12

3 Trần Văn Quang Chi cục Thú y

Đồng Nai

Chịu trách nhiệm quản lý nội

dung lấy mẫu

18

4 Nguyễn Tuấn Anh Công ty

TNHH CNSH Khoa Thương

Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung xây dựng các kit PRRSV và real-time PRRSV, TGEV/PEDV/rotavirus

Thành viên – chịu trách nhiệm nội dung nghiên cứu về bệnh tích trên bệnh tai xanh và tiêu

Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung xây dựng kit các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp

12

8 Nguyễn Thành

Khôi

Công ty TNHH CNSH Khoa Thương

Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung thiết kế và kiểm tra primer, probe cho các

Xây dựng 04 bộ kit sinh học phân tử phát hiện nhanh bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp

ở heo nuôi, phân biệt chủng độc lực cao với chủng thường đối với tác nhân gây bệnh tai xanh, để kịp thời có biện pháp phòng trị bệnh trên heo nuôi tại địa bàn tỉnh Đồng Nai,

gồm:

- 01 bộ kit PCR phát hiện PRRSV gây bệnh tai xanh (phân biệt chủng độc lực cao - đang gây khó khăn cho các phương pháp chẩn đoán khác - và chủng thường)

- 01 bộ kit PCR multiplex phát hiện nhóm rotavirus, TGEV và PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp

- 01 bộ kit PCR multiplex phát hiện Salmonella spp., E coli ETEC và Clostridium

perfringens gây bệnh tiêu chảy cấp

- 01 bộ kit real-time PCR phát hiện PRRSV

14 Tình trạng đề tài

Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả

Kế tiếp nghiên cứu của người khác

15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên cứu của Đề tài

15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài

Ngoài nước (Phân tích đánh giá được những công trình nghiên cứu có liên quan và những kết quả nghiên cứu mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu của đề tài; nêu được những bước tiến về trình độ KH&CN của những kết quả nghiên cứu đó)

Bệnh “tai xanh” hay còn gọi là hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo (PRRS – Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm

1987 Tác nhân gây bệnh được xác định năm 1991, là virus RNA thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus Hai chủng chính được xác định gồm: (1) genotype 1 với prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu) và genotype 2 với prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ) Gần đây, một biến thể của genotype 2 có độc lực cao hơn đã gây nhiều tổn thất ở châu Á Bệnh làm giảm tỉ lệ sinh sản, gây sảy thai, heo chết lúc sinh ở heo nái, và gây rối loạn hô hấp dẫn đến tử vong cho heo con Bệnh có thể lây lan nhanh trong đàn heo trong 7-10 ngày Theo Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO), các yếu tố chủ chốt kiểm soát và loại bỏ dịch PRRS bao gồm phát hiện bệnh sớm và có phương pháp phân tích nhanh và chính xác, nhận diện nhanh các đàn heo nhiễm và sử dụng những biện pháp dập tắt

dịch hiệu quả

Năm 2007, dịch PRRS xảy ra tại Trung Quốc làm chết gần 70.000 con heo và buộc nước này phải tiêu hủy khoảng 200.000 heo nghi bệnh tạo nên cơn sốt giá trên thị trường thịt lên đến 74.6% Người ta cho rằng virus gây bệnh PRRS tại nước này là chủng Châu Mỹ độc lực cao Chủng virus này sau đó cũng đã lây lan sang nhiều nước trên thế giới gây khó khăn, phức tạp trong quá trình chẩn đoán, phân biệt giữa chủng thường và chủng độc lực cao này Các phương pháp chẩn đoán: (1) dựa trên biểu hiện lâm sàng không rõ ràng vì biểu hiện này biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi trường, (2) phân lập virus đối với PRRSV rất khó khăn, (3) huyết thanh học như phương pháp ELISA, và (4) RT-PCR Phương pháp ELISA, với đại diện là kit HerdCkeck-PRRS (IDEXX Laboratories Inc.) được sử dụng phổ biến do nhiều ưu điểm nhưng chỉ cho kết quả dương tính 9-13 ngày sau nhiễm Theo khuyến cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật (World Organisation for Animal Health) (2008), phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong việc kiểm soát tính sạch bệnh

ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo dõi các đàn heo nhiễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh Phương pháp RT-PCR đơn giản, ít tốn kém và nhanh hơn rất nhiều so với thử nghiệm có tên là “swine bioassay” vốn được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc xác định PRRSV Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu Hai vùng gene bảo tồn cao là ORF 6 mã hoá protein màng và ORF 7 mã hoá protein nhân (nucleocapsid) thường được dùng để thiết kế primer (mồi) cho phản ứng RT-PCR phát hiện PRRSV Một số vùng khác như ORF 5 mã hoá protein vỏ (envelope) được sử dụng khi cần phân biệt các chủng (chủng độc lực cao -chủng thường)

Một số vaccine đã được thương mại hóa nhưng mỗi loại đều có ưu và nhược điểm, và điều quan trọng nhất là sử dụng đúng loại vaccine tùy theo chủng PRRSV lưu hành Hiện nay vẫn chưa có khả năng phân biệt kháng thể do vaccine và kháng thể do virus từ môi trường

Đối với bệnh tiêu chảy cấp, các tác nhân gây bệnh rất đa dạng bao gồm virus, vi khuẩn

và nguyên sinh động vật, trong đó virus là tác nhân gây hại lớn nhất Nhìn chung

Clostridium perfringens được phát hiện trong 48 %, E coli 20 %, C difficile 10 %, rotavirus

9 % các trường hợp tiêu chảy cấp

Trong số các virus, nhóm rotavirus và hai coronavirus là PEDV (Porcine Epidemic

Diarrhea Virus) và TGEV (Transmissible Gastroenteritis Virus) có khả năng lây nhiễm rất cao

PEDV được phân lập vào năm 1978 ở châu Âu nhưng tỉ lệ lưu hành ở châu Âu hiện nay đã giảm đáng kể Trong khi đó ở châu Á từ những năm 1990, PEDV bắt đầu nổi lên như một tác nhân dịch bệnh quan trọng, đặc biệt là ở Hàn Quốc và Nhật Bản, với tỉ lệ gây chết lên đến 50 – 95 % ở heo con nhỏ hơn 2-3 tuần tuổi PEDV là một virus RNA mạch đơn với

bộ gene chứa các gene mã hóa cho các protein pol1 (P1), spike (S), envelope (E), membrane (M) và nucleocapsid (N); trong đó hai protein được quan tâm là protein S có chức năng gắn với thụ thể tế bào chủ và protein M tham gia vào quá trình “tự ráp” của virus Cơ chế gây bệnh của PEDV bắt đầu với sự bám của protein S virus lên thụ thể aminopeptidase N trên bề mặt lông nhung ruột dẫn đến sự phá hủy biểu mô lông nhung Điều này sẽ làm biến đổi quá trình tiêu hóa sữa, vận chuyển tế bào và hấp thụ chất dinh dưỡng ở heo con Các phương pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy phân lập virus, miễn dịch học, phổ biến là ELISA, sử dụng kính hiển vi điện tử, và một số phương pháp sinh học phân tử phổ biến là RT-PCR Các phương pháp ELISA và PCR tiến hành trực tiếp trên phân hoặc trên mẫu mô ruột non heo

Trong phương pháp RT-PCR, primer sử dụng thường được thiết kế trong vùng gene S hay M

Hiện nay đã có một số vaccine được phát triển dựa trên chủng PPEDV-9 (Hàn Quốc) hay 5V (Nhật Bản), được chỉ định dùng cho heo nái nhưng chưa phổ biến

TGEV được phát hiện đầu tiên năm 1946 ở Hoa Kỳ, và được ghi nhận sau đó ở tất cả các nước có ngành chăn nuôi heo phát triển, gây tổn thất kinh tế lớn Chỉ riêng ở Iowa (Hoa Kỳ) trong khoảng 1987-1988, tổn thất do TGEV gây ra cho đàn heo là 10 triệu USD TGEV

là một virus RNA mạch đơn có bộ gene với 8 mRNA: mRNA 2 (S), 3, 3-1, 4 (sM), 5 (M), 6 (N) và 7 mã hóa cho các protein S, sM, M, N và một protein màng Tác hại TGEV gây ra trên đàn heo thay đổi tùy thuộc tình trạng miễn dịch của heo: (1) có thể gây chết 100 % heo con ở đàn chưa từng tiếp xúc với virus, (2) gây chết khoảng 20 % ở những đàn đã được miễn dịch một phần hoặc (3) gây những đợt dịch ngắt quãng ở những đàn trong đó heo nái đã được miễn dịch Cơ chế gây bệnh tương tự như PEDV Các phương pháp chẩn đoán giống

với trường hợp PEDV Trong phương pháp RT-PCR phát hiện TGEV, primer sử dụng

thường được thiết kế trong vùng gene N có tính bảo tồn cao Vaccine thương mại hóa đối với

TGEV đã xuất hiện từ 1966 nhưng chưa có vaccine nào tỏ ra thực sự hiệu quả; người ta vẫn đang tiếp tục cải tiến chúng

Rotavirus là một virus RNA mạch đôi thuộc họ Reoviridae, với bộ gene bao gồm 11 trình tự, mỗi trình tự mã hóa ít nhất một protein Rotavirus được phân thành nhiều nhóm từ

A đến G, trong đó các nhóm A, B, C và E có hiện diện ở heo nhưng nhóm A là nhóm phổ biến nhất ở heo con Nhóm C cũng được xem là tác nhân gây rối loạn tiêu hóa ở heo mọi lứa tuổi tuy ít phổ biến hơn nhóm A Rotavirus có tính bền cao trong môi trường Cơ chế gây bệnh liên quan đến sự biến đổi các tế bào chịu trách nhiệm hấp thu chất dinh dưỡng ở ruột non, làm giảm hàm lượng enzyme lactase dẫn đến nôn mửa và tiêu chảy ở heo con Đến 33

% heo con còn bú bị nhiễm có thể chết khi có dịch Các phương pháp chẩn đoán bao gồm soi kính hiển vi điện tử, điện di phát hiện RNA virus trên gel polyacrylamide, các phương pháp miễn dịch học và sinh học phân tử, phổ biến nhất là RT-PCR Trong phương pháp RT-PCR,

primer thường được thiết kế trong vùng gene VP6 hay VP7 của bộ gene Vaccine đã được

phát triển nhưng chưa phổ biến đại trà ở nhiều quốc gia

Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở heo con thì một số chủng E coli,

Salmonella spp và Clostridium perfringens được xem là những tác nhân gây bệnh phổ biến

Các chủng E coli gây độc đường ruột (ETEC – enterotoxigenic E coli) gây bệnh

thông qua việc tiết một số độc tố đường ruột như LT, STa (STI) và STb (STII) Các chủng này còn tạo ra các adhesin diềm (fimbrial), như K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F41, và F18, giúp vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhày ruột non Một số ít chủng, được gọi là STEC

(Shiga toxin-producing E coli) có thể tạo cả độc tố Shiga (Shiga toxin) như Stx2e Bên cạnh

đó, một số chủng E coli không tạo độc tố nhưng có khả năng làm tiêu biến các lông nhung của tế bào biểu mô ruột khi bám vào, chúng có tên là AEEC (Attaching and Effacing E coli)

Các phương pháp chẩn đoán đa dạng, bao gồm soi kính hiển vi, nuôi cấy định danh, nhuộm

mô với Hematoxylin-eosin hay Wright-Giemsa, miễn dịch học phát hiện adhesin vi khuẩn,

và các phương pháp sinh học phân tử, phổ biến là PCR Phương pháp PCR cho phép phát

hiện các gen adhesin, các gene mã hóa độc tố đường ruột như LT, Sta, STb đối với chủng ETEC, gene Stxe đối với chủng STEC và eaeA đối với chủng AEEC

Clostridium là nhóm vi khuẩn được xem là tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến ở người và động vật Trong đó C perfringens là tác nhân gây bệnh đường ruột chính ở vật nuôi Đây là một vi khuẩn Gram (+), kỵ khí, được phân thành nhiều type C perfringens type

C từ lâu đã được biết là tác nhân phổ biến gây viêm ruột hoại tử xuất huyết ở heo con nhỏ hơn 10 ngày tuổi Sau đó type A cũng được xem là có khả năng gây bệnh ở heo và nhiều động vật khác Vi khuẩn này có thể tạo ra từ 1 đến 20 loại ngoại độc tố, trong đó có 5 loại chính , , ,  và CPE Độc tố  đóng vai trò chủ chốt trong tính gây bệnh của C

perfringens type A Còn ở type C người ta phát hiện cả hai loại độc tố  và  Chẩn đoán hiện nay dựa trên việc phát hiện cả hai type với type A khó phát hiện hơn do không có biểu hiện biến đổi hình thái tế bào rõ ràng Các phương pháp chẩn đoán chính bao gồm: chẩn đoán lâm sàng, soi kính hiển vi nhằm phát hiện các thương tổn mô và tế bào, nuôi cấy định danh, phát hiện các độc tố dựa trên kỹ thuật miễn dịch như ELISA hay tụ latex, và các phương pháp sinh học phân tử như lai phân tử và PCR Các phương pháp sinh học phân tử chủ yếu tập trung phát hiện sự hiện diện của các gene độc tố như  ,  ,  ,  , và cpe Phương

pháp PCR đặc biệt hữu dụng để phát hiện các chủng độc khi biết rằng tương quan kiểu gene (có gene độc tố) và kiểu hình (tạo độc tố) gần bằng 100%

Salmonella cũng được xem là một tác nhân gây nên bệnh tiêu chảy cấp ở heo Cho đến nay, đã có 4 serotype Salmonella thuộc loài Salmonella enterica là S Typhimurium, S Heidelberg, S Agona, and S Infantis được phát hiện ở heo bị bệnh trong các công trình nghiên cứu ở châu Âu và châu Mỹ (CDC, 2006), trong đó S Typhimurium và S

Choleraesuis là hai serotype thường gặp nhất Tuy nhiên, tại mỗi giai đoạn thường chỉ có

một vài serotype Salmonella hoạt động nổi trội Tại Mỹ, 1986 đến 1995 - serotype nổi bật là

S Choleraesuis; 1996 - S Derby; 1997 và nhiều năm sau đó - S Typhimurium; 2007, khảo

sát trên 2175 mẫu - S Typhimurium (n = 784), S Derby (n = 386), S Heidelberg (n = 164),

S Choleraesuis (n = 153), và S Agona (n = 91) Cho đến hiện nay, phương phát hiện và định

danh thông qua nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc được xem là tiêu chuẩn vàng

trong việc phát hiện Salmonella Tuy nhiên, phương pháp này tốn rất nhiều thời gian (ít nhất

trên 7 ngày), công sức và có khả năng ngoại nhiễm cao Các phương pháp sinh học phân tử, chủ yếu là PCR, Real-time PCR được phát triển cho chẩn đoán Và để đảm bảo phát hiện

Salmonella gây bệnh tiêu chảy ở heo một cách tương đối đầy đủ, việc thiết kế primer cho

phương pháp PCR hay Real-time PCR cần phải dựa trên những vùng gene bảo tồn cao giữa

ít nhất 6 serotype trên

Trong nước (Phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực nghiên

cứu của đề tài, đặc biệt phải nêu cụ thể được những kết quả KH&CN liên quan đến đề tài

mà các cán bộ tham gia đề tài đã thực hiện Nếu có các đề tài cùng bản chất đã và đang được thực hiện ở cấp khác, nơi khác thì phải giải trình rõ các nội dung kỹ thuật liên quan đến đề tài này; Nếu phát hiện có đề tài đang tiến hành mà đề tài này có thể phối hợp nghiên cứu được thì cần ghi rõ Tên đề tài, Tên Chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì đề tài đó)

Đối với bệnh “tai xanh”, có những nghiên cứu bước đầu về sự hiện diện và tỉ lệ nhiễm của PRRSV trên heo bằng phương pháp ELISA (Trần Thị Bích Liên & cộng sự, 2003) hay bằng RT-PCR (Nguyễn Ngọc Hải & cộng sự, 2007) Công trình của Kim Văn Phúc và cộng

sự (2007) sử dụng các phương pháp ELISA, phân lập virus, RT-PCR, IPMA điều tra sự lưu hành của virus trên 8 tỉnh thành (Tp HCM, Đồng Nai, Bình Dương, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh, Bà Rịa Vũng tàu và Khánh Hòa) cho thấy tỉ lệ nhiễm là 40,2 %, trong đó khu vực chăn nuôi gia đình nhiễm 31,9 % - 48,8 % và toàn bộ các trại chăn nuôi công nghiệp đều bị nhiễm Tình trạng nhiễm xảy ra ở heo thuộc mọi lứa tuổi Công trình của Youjun Feng và cộng sự (2008) tiến hành trên một số chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam và ở Trung Quốc năm 2007 cho thấy 99 % đồng nhất ở trình tự bộ gene giữa các chủng này, đặc biệt chúng đều thiếu một trình tự 30 amino acid ở protein “không cấu trúc” (nonstructural protein) 2 Các tác giả dự đoán chủng Việt Nam có thể có cùng nguồn gốc với chủng Trung Quốc và bắt nguồn từ đợt dịch lớn xảy ra năm 2006 trên hơn nửa lãnh thổ Trung Quốc, tác động đến trên hơn 2 triệu heo nuôi Một công trình khác của Lê Thanh Hòa và cộng sự (2009) tìm hiểu đặc tính di truyền của chủng PRRSV phân lập từ heo bệnh ở Việt Nam dựa trên việc phân tích gene M mã hoá protein màng của virus cũng cho kết quả tương tự

Đối với các tác nhân gây tiêu chảy cấp PEDV và TGEV, đã có đề tài luận văn Thạc sĩ của Vũ Thị Lan Hương (2007) nghiên cứu về tình hình phơi nhiễm ở heo với các tác nhân này bằng phương pháp ELISA Không thấy công trình công bố trên nhóm rotavirus gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam

Đối với các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp trên heo, công trình của Hideki Kobayashi và cộng sự (2003) tiến hành trên mẫu heo và mẫu từ môi trường nuôi heo lấy tại Cần Thơ cho thấy sự hiện diện của STEC và AEEC với tỉ lệ 29 % trên tổng số trại nghiên cứu, không thấy

sự hiện diện của chủng ETEC Trong khi đó, một công trình khác (Thuy N Do và cộng sự, 2006) thực hiện trên heo con trước cai sữa ở miền Bắc cho thấy 43 % trường hợp tiêu chảy ở

heo mới đẻ và 23,9 % là trên heo con cho đến khi cai sữa là do E coli chủng ETEC gây ra Trong một công trình nghiên cứu so sánh các chủng Salmonella trên heo nuôi (Tran

Thi Phan và cộng sự, 2001), kết quả khảo sát trên 13 mẫu cho thấy sự phân bố các chủng là

S Derby (n = 8), S Javiana (n=4), S Typhimurium O9 (n=1) Hiện tại, ở Việt Nam, tình

hình tiêu chảy cấp ở heo gây ra bởi Salmonella vẫn chưa được điều tra và thống kê Việc phát hiện Salmonella ở Việt Nam được thực hiện chủ yếu trên các sản phẩm của gia súc, gia

cầm và thủy sản

Không thấy công bố nào trên tác nhân gây tiêu chảy trên heo là C perfringens

15.2 Luận giải về việc đặt ra mục tiêu và những nội dung cần nghiên cứu của Đề tài

(Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, phân tích những công trình

nghiên cứu có liên quan, những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu đề tài, đánh giá những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới, những vấn đề đã được giải quyết, cần nêu rõ những vấn đề còn tồn tại, chỉ ra những hạn chế cụ thể, từ đó nêu được hướng giải quyết mới - luận giải và cụ thể hoá mục tiêu đặt ra của đề tài và những nội dung cần thực hiện trong Đề tài để đạt được mục tiêu)

Việc chiếm lĩnh thị trường thịt động vật nuôi thế giới của các nước đang phát triển ngày càng tăng, từ 31% năm 1980 dự kiến sẽ tăng đến 60% vào năm 2020 Trong tỉ lệ 60% này, các nước Đông Nam Á, Campuchia, Lào, Philippines và Việt Nam, chiếm 13.2% Ở các nước vừa kể, sản xuất heo chiếm 2.0 đến 2.8% giá trị GDP quốc gia Những năm gần đây,

các quốc gia này phát triển việc sản xuất thịt heo hướng đến xuất khẩu heo và thịt heo Sự tăng trưởng đàn heo này dẫn theo nhiều hệ quả kinh tế, xã hội, môi trường quan trọng và một

sự phụ thuộc ngày càng lớn vào thức ăn, thuốc thú y và giống nhập khẩu Dịch bệnh, do lưu hành trong nước hay qua con đường nhập khẩu, là một trong những yếu tố chính tác động xấu trên sản lượng heo Do có gần 70% số heo do các cơ sở quy mô nhỏ sản xuất, việc kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn, thiếu đồng bộ

Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó chăn nuôi chiếm 25% GDP trong lĩnh vực nông nghiệp (2008) Mục tiêu năm 2010 là 32%, 2015 là 38% và 2020 sẽ là 42% Thịt heo chiếm tỉ lệ 71.5 % (2004) trên tổng loại thịt tiêu thụ và có mức độ tăng 0.7 %/năm Cùng với việc gia nhập Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO), Việt Nam định hướng xuất khẩu 40.000-50.000 heo/năm (2004) Để đạt mục tiêu này, bên cạnh việc giảm giá thành, thì cần đảm bảo sản lượng và chất lượng heo thông qua những chương trình phòng chống dịch bệnh hiệu quả Chăn nuôi heo chịu tác động của nhiều dịch bệnh, trong đó dịch “tai xanh” và tiêu chảy cấp gây nhiều tổn thất kinh tế lớn Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Trên những trại heo giống tại các tỉnh phía Nam, tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29%

Tỉnh Đồng Nai không nằm ngoài diễn biến dịch bệnh của cả nước Với nhiều cơ sở,

hộ nông dân hoạt động trong lĩnh vực chăn nuôi, trong đó đàn heo chiếm tỷ trọng khá cao, ngành chăn nuôi trong nhiều năm qua gặp nhiều khó khăn do tình hình giá cả bất ổn,

và dịch bệnh hoành hành Theo báo cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật, trong khoảng tháng 3 đến tháng 8/2007, có 44 điểm dịch ở các tỉnh miền bắc (tháng 3-tháng 5) và ở các tỉnh miền nam (tháng 6-tháng 7) gây chết 4.000 heo trên 44.000 con mắc bệnh Trong tháng 8, 9/2007, thêm 9 đợt dịch xảy ra ở Khánh Hòa, Cà Mau và Lạng Sơn với tỉ

lệ tử vong là 24 % Từ các vùng có dịch, heo bệnh vẫn được vận chuyển đến các vùng tiêu thụ khác nhau, từ đó bệnh nhanh chóng lan truyền sang các tỉnh phía nam Tác nhân gây bệnh này tồn tại trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân, nước tiểu và có thể phát tán theo gió rất nhanh và thông qua việc tiếp xúc, vận chuyển heo bệnh Trong những năm qua ngành chăn nuôi nước ta cũng như các nước khác trên thế giới vẫn sống chung

với loại bệnh này tuy nhiên gần đây tại Trung Quốc xuất hiện trận dịch lớn gây chết hàng loạt trên heo nuôi, người ta xác định nguyên nhân là do tác nhân PRSSV – chủng virus Bắc Mỹ độc lực cao gây ra Từ Trung Quốc tác nhân này lây lan sang nhiều nước trong đó có Việt Nam và cũng đã gây thiệt hại rất lớn trên diện rộng Khó khăn thứ nhất hiện nay là làm sao phân biệt được chủng độc lực cao và chủng thường để có biện pháp phòng ngừa, chẩn trị hiệu quả nhất Khó khăn thứ hai là theo cách lấy mẫu bệnh phẩm hiện nay thường từ các mô nội quan sẽ không thể tiến hành trên đàn heo giống làm mẹ nên phương pháp chẩn đóan cần thiết hiện nay phải xác định được tác nhân gây bệnh trên mẫu huyết thanh Dựa vào các nguyên lý hoạt động của các phương pháp chẩn đóan sinh học phân tử thì phương pháp PCR hoàn toàn có thể phân biệt nhờ thiết kế primer đặc hiệu cho mỗi chủng và thí nghiệm cũng có thể tiến hành trên mẫu huyết thanh hay các loại mẫu khác

Hiện nay ngoài dịch tai xanh còn có bệnh tiêu chảy cấp có thể có xu hướng phát triển thành dịch Bệnh đe doạ nhóm heo sơ sinh theo mẹ Đối với nhóm heo con sơ sinh dưới 7 ngày tuổi thì tỉ lệ chết có thể lên tới 100 % Bệnh lây từ mẹ sang con Ở heo trưởng thành bệnh thường tự khỏi nếu được chăm sóc tốt nhưng khi con mẹ mang mầm bệnh sẽ truyền cho đàn con gây tiêu chảy cấp trên heo sữa không có sức kháng bệnh gây tử vong Thời gian vừa qua (những tháng đầu năm 2009) bệnh xuất hiện thành dịch ở nhiều nơi trong cả nước đặc biệt tại Đồng Nai nơi có đàn heo rất lớn dịch bệnh đã gây nhiều thiệt hại về kinh tế, gây hoang mang cho người chăn nuôi Một số cơ sở chăn nuôi theo quy mô công nghiệp đã phải

tự tiêu hủy các con bệnh ngay khi phát hiện để ngăn dịch lây lan Các hộ nông dân nhỏ lẻ thì

cố gắng cứu chữa bằng mọi cách nhưng không hiệu quả Bệnh có tốc độ lây lan rất nhanh, khi có tác nhân gây bệnh xuất hiện trong vùng bệnh rất dễ lay lan thành dịch Do đó vấn đề

là phải tìm ra một phương pháp chẩn đóan nhanh chóng, chính xác các tác nhân gây bệnh để kịp thời phòng ngừa đặc biệt từ đàn heo giống nhập về Bệnh do nhiều tác nhân gây ra nhưng chúng lại có triệu chứng tương tự nhau; mỗi loại tác nhân đòi hỏi phải có những biện pháp phù hợp để phòng ngừa, chẩn trị Để giải quyết vần đề này phải có một phương pháp chẩn đoán đồng thời các tác nhân trên và xác định mẫu bệnh phẩm đó nhiễm loại tác nhân nào Phương pháp mulplex PCR sẽ cho phép ta phát hiện và chỉ ra chính xác một loại hoặc đồng

thời các loại tác nhân nên rất phù hợp với mục tiêu này

Việc xây dựng các phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân gây bệnh để kịp thời phát hiện ổ dịch, cách ly và tìm phương pháp xử lý là cần thiết Phương pháp PCR

có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian tiến hành ngắn có thể là một công cụ bổ sung hiệu quả cho các kit ELISA vẫn được sử dụng hiện nay (ELISA khó phân biệt kháng thể do tiêm vaccine hay kháng thể do mầm bệnh)

Chúng tôi tiến hành xây dựng các kit phát hiện các tác nhân gây bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp trên heo có tính chính xác cao với mục đích góp phần vào công tác kiểm soát các dịch trên ở địa bàn tỉnh Đồng Nai nói riêng và các địa phương khác có nhu cầu

16 Liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài đã trích dẫn khi đánh giá tổng quan

(Tên công trình, tác giả, nơi và năm công bố, chỉ nêu những danh mục đã được trích dẫn để luận giải cho sự cần thiết nghiên cứu đề tài)

1 Do T.N., Cu P.H., Nguyen H.X., Au T.X., Vu Q.N., Driesen S.J., Towsend K.M., Chin J

J-C., & Trott D.J 2006 Pathotypes and serogroups of enterotoxigenic Escherichia coli

isolated from pre-weaning pigs in north Vietnam J Med Microbiol 55:93-99

2 FAO EMPRES 2007 Focus on: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) regional awareness Issue No 2

3 Feng Y., Zhao T., Nguyen T., Inui K., Ma Y., Nguyen T.H., Nguyen V.C., Liu D., Bui Q.A., To L.T., Wang C., Tian K., & Gao G.F 2008 Porcine Respiratory and Reproductive

Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Emerging Infectious Diseases –

www.cdc.gov/eid - 14:1774-1776

4 Huynh T.T.T., Aarnink A.J.AS., Drucker A., Verstegen M.W.A Pig production in

Cambodia, Laos, Philippines, and Vietnam: a review Asian J Agri Develop 4:69-90

5 Ishikawa K., Sekiguchi H., Ogino T., & Suzuki S 1997 Direct and rapid detection of

porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR J Virol Methods,

6 Jung K & Chae C 2004 RT-PCR-based dot blot hybridization for the detection and

differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus in

fecal samples using a non-radiaactive digixigenin cDNA probe 2004 J Virol Methods

7 Kim J., Choi C., Chae C 2001 Prevalence of eaeA+ Escherichia coli isolated from pigs

with diarrhea J Vet Diagn Invest 13:355-356

8 Kim L., Chang K-O., Sestak K., Parwani A., Saif L.J 2000 Development of a reverse transcription-nested polymerase chain reaction assay for differential diagnosis of transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus from feces and nasal

swabs of infected pigs J Vet Diagn Invest 12:385-388

9 Kim Văn Phúc, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Trần Thanh Quân, Bùi Anh Thy, Chris Morrissy 2007 Báo cáo kết quả nghiên cứu – Điều tra sự lưu hành virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên heo ở một số tỉnh Nam Bộ Bộ Nông Nghiệp

và PTNR, Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y

10 Kobayashi H., Ly T.L.K., Tran T.P., Kamakawa A., Yamasaki S., & Taniguchi T 2003

Prevalence of pathogenic Escherichia coli in a swine breeding environment in the Cantho

province of Vietnam J.A.R.Q., 37:59-63

11 World Organisation for Animal Health 2008 PRRS: the disease, its diagnossis,

prevention and control Report of the OIE ad hoc group on Porcine Reproductive Respiratory

Syndrome

12 Smitalova R., Rodak L., Psikal I., Smid B 2006 Isolation, immunochemical demonstration of field strains of porcine group A rotaviruses and electrophoretic analysis of

RNA segments of group A and C rotaviruses Veterinarni Medicina 51:288-295

13 Suh D.K., Song J.C 2005 Prevalence of Lawsonia intracellularis, Brachyspira

hyodysenteriae and Salmonella in swine herds J Vet Sci 6:289-293

14 Yaeger M 2007 The prevalence of clostridial enteritis in neonatal diarrhea cases submitted to the Iowa State Veterinary Diagnostic Lab 2007 Swine Health Symposium

17 Nội dung nghiên cứu khoa học và triển khai thực nghiệm của Đề tài và phương án

thực hiện

(Liệt kê và mô tả chi tiết những nội dung nghiên cứu khoa học và triển khai thực nghiệm phù hợp cần thực hiện để giải quyết vấn đề đặt ra kèm theo các nhu cầu về nhân lực, tài chính và nguyên vật liệu trong đó chỉ rõ những nội dung mới, những nội dung kế thừa kết quả nghiên cứu của các đề tài trước đó; những hoạt động để chuyển giao kết quả nghiên cứu đến người

sử dụng, dự kiến những nội dung có tính rủi ro và giải pháp khắc phục – nếu có

Đề tài bao gồm hai nội dung chính:

- Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp ở heo

- Tạo 4 kit chẩn đoán và thử nghiệm trên mẫu thực địa

1 Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh ”tai xanh“ và tiêu chảy cấp ở heo

Có 4 nhóm quy trình cần xây dựng là: quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA, DNA, quy trình PCR và RT-PCR, quy trình real-time RT-PCR, quy trình tạo dòng nhằm xây dựng các chứng dương cho các kit

1.1 Quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA virus hay DNA vi khuẩn

Tùy thuộc bản chất mẫu – huyết thanh, mô hay phân, cũng như loại nucleic acid cần thu nhận – RNA hay DNA - mà quy trình cần được điều chỉnh cho phù hợp

Chúng tôi khảo sát hiệu quả xử lý các loại mẫu bằng nghiền cơ học, nhiệt, proteinase, hay các biện pháp phối hợp Đặc biệt mẫu phân được xem như mẫu chứa nhiều chất ức chế phản ứng PCR cần có bước tiền xử lý thích hợp

Hai phương pháp tách chiết RNA, DNA được khảo sát là phương pháp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tủa) và phương pháp Boom

Các quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA, DNA phù hợp sẽ được rút ra từ các kết quả trên

1.2 Quy trình RT-PCR phát hiện PRRSV, PEDV, TGEV, rotavirus và quy trình PCR phát hiện E coli, Salmonella spp và C perfringens

 RNA tách chiết từ mẫu nhiễm các virus như PRRSV, PEDV, TGEV, rotavirus

được phiên mã ngược bằng phương pháp RT (reverse transcription) rồi nhân bản bằng phương pháp PCR

Đối với từng loại virus, chúng tôi chọn lọc một số cặp primer đã công bố và thiết kế một số primer dựa trên một số vùng gene như: ORF6/7 cho PRRSV, S/M cho PEDV, N cho TGEV, VP6/7 cho rotavirus Các cặp primer này sẽ được so sánh về hiệu quả nhân bản và tính đặc hiệu cho tác nhân cần nhân bản Chúng tôi sẽ chọn chứng nội dùng để kiểm tra hiệu quả phản ứng RT và PCR là sản phẩm mRNA của gene β-actin trong bộ gene của heo Tiếp theo, chúng tôi thiết kế quy trình PCR monoplex phát hiện từng tác nhân riêng biệt với các yếu tố cần tối ưu hóa là: nồng độ MgCl2, nhiệt độ lai, lượng bản mẫu/phản ứng Sau đó, chúng tôi xây dựng quy trình PCR multiplex phát hiện đồng thời PEDV, TGEV và rotavirus Các yếu tố cần tối ưu hóa bao gồm: nồng độ MgCl2, nhiệt độ lai, lượng

bản mẫu/phản ứng, nồng độ Taq polymerase và nồng độ các loại primer

Quy trình PCR multiplex sẽ được so sánh với PCR monoplex về hiệu quả nhân bản trên cả 3 virus cần phát hiện ở các tổ hợp nồng độ khác nhau Nếu cần thiết, quy trình PCR multiplex sẽ tiếp tục được cải tiến để đạt hiệu quả bằng với PCR monoplex dùng cho việc phát triển thành kit sau này Quy trình này tạo thuận lợi lớn cho công tác chẩn đoán, giảm chi phí, thời gian và công sức

 Nội dung tương tự cũng được tiến hành trên các vi khuẩn E coli, Salmonella spp

và C perfringens, trừ đi bước RT và chứng nội được sử dụng là một trình tự DNA nhân tạo

được bổ sung vào mẫu

 Tính đặc hiệu của các sản phẩm từ quá trình RT-PCR hay PCR tương ứng với từng tác nhân được kiểm tra bằng phương pháp Southern blot và phương pháp giải trình tự

Trong phương pháp Southern blot, chúng tôi sử dụng các mẫu dò (probe) đặc trưng cho từng tác nhân và tiến hành lai phân tử với sản phẩm nhân bản từ tác nhân đó và từ một

số tác nhân khác Kết quả lai đặc hiệu cho phép kết luận về bản chất của tác nhân khảo sát Phương pháp giải trình tự được dùng để khẳng định kết quả Southern blot Các sản phẩm nhân bản đại diện cho từng tác nhân được gửi giải trình tự Kết quả giải trình tự sẽ

được so sánh với cơ sở dữ liệu gene (GenBank) để rút ra kết luận về độ đồng nhất của trình

tự nucleotide mà chúng tôi có so với các trình tự đã công bố đặc trưng cho mỗi tác nhân  Độ nhạy kỹ thuật của các quy trình được xác định dựa trên các trình tự mục tiêu tạo dòng hoặc tổng hợp nhân tạo Độ nhạy được tính toán với các nồng độ pha loãng khác nhau của các trình tự mục tiêu đối với từng tác nhân gây bệnh khảo sát

Từ các kết quả thu được, chúng tôi chọn ra các quy trình RT-PCR và PCR multiplex phù hợp cho các tác nhân cần phát hiện

1.3 Quy trình real-time RT-PCR phát hiện PRRSV

Phương pháp real-time PCR có ưu điểm lớn so với phương pháp PCR cổ điển do có

độ nhạy cao hơn, thao tác đơn giản hơn và hầu như không có khả năng ngoại nhiễm tuy vẫn

có nhược điểm là chi phí cao hơn và cần thiết bị đắt tiền hơn Việc xây dựng quy trình PCR real-time cho PRRSV là nhằm cung cấp một chọn lựa khác nếu hội đủ điều kiện

Trong nội dung này, chúng tôi chọn phương pháp real-time RT-PCR sử dụng Taqman probe Phương pháp này có độ đặc hiệu cao hơn so với sử dụng chất phát huỳnh quang liên kết với mạch đôi DNA như SYBrGreen Chúng tôi khảo sát và thiết kế các cặp primer và Taqman probe tương ứng cho vùng gene ORF6/7 của PRRSV, so sánh các cặp primer này và chọn tổ hợp primer/probe cho hiệu quả nhân bản tốt nhất và đặc hiệu nhất Tổ hợp primer/probe cũng được thiết kế cho gene chứng nội

1.4 Quy trình tạo dòng một số trình tự gene dùng làm chứng dương cho các kit

Một trong những thành phần quan trọng của kit chẩn đoán là mẫu chứng dương giúp người sử dụng kiểm tra chất lượng của hóa chất cung cấp cũng như hoạt động của thiết bị Chúng tôi tạo dòng các trình tự gene được dùng làm trình tự mục tiêu cho quá trình nhân

bản đối với từng tác nhân từ các mẫu virus và vi khuẩn chứng vào chủng E coli DH5 Các trình

tự tạo dòng được bảo quản ở dạng plasmid tinh sạch và dạng khuẩn lạc Khi cần thiết khuẩn lạc được nuôi cấy tăng sinh và plasmid tái tổ hợp được tách chiết và tinh sạch cho sử dụng

Từ các quy trình thiết lập ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các kit

2 Tạo 4 kit chẩn đoán và thử nghiệm kit trên mẫu thực địa

2.1 Tạo 4 loại kit bao gồm kit real-time RT-PCR PRRSV, kit RT-PCR momoplex PRRSV, kit RT-PCR multiplex PEDV/TGEV/rotavirus và kit PCR multiplex E.coli/Salmonella spp./C perfringens

 Tập hợp, sắp xếp các thành phần kit bao gồm hóa chất xử lý, tách chiết, hóa chất

RT, hóa chất PCR, hóa chất điện di hoặc hóa chất real-time PCR, chứng dương, chứng âm trong bao bì thiết kế phù hợp cho 50 phản ứng/kit

 Xây dựng bảng hướng dẫn sử dụng các kit

 Khảo sát độ ổn định của các kit cho đến 9 tháng bảo quản Hóa chất của các kit được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR, RT-PCR trên một số mẫu DNA và RNA chứng cách 2 tháng/lần Kết quả giữa các lần nhân bản được so sánh để rút ra kết luận về độ ổn định của kit theo thời gian

 Khảo sát độ lặp lại và sự tiện dụng của các kit: nội dung này sẽ được tiến hành ở một cơ sở có đủ điều kiện để sử dụng kit và cung cấp các nhận xét đánh giá phản hồi

 Các kit tạo ra được so sánh với một số kit thương mại có cùng mục tiêu hoặc có mục tiêu gần giống để rút ra kết luận hiệu quả phát hiện, độ tiện dụng và giá cả

2.2 Chúng tôi đồng thời áp dụng thử nghiệm các kit trên một số mẫu thực địa và đánh giá thông qua so sánh với kết quả Southern blot và kết quả giải trình tự trên một số mẫu đại diện

18 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng

(Luận cứ rõ cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ sử dụng gắn với từng nội dung chính của đề tài; so sánh với các phương pháp giải quyết tương tự khác và phân tích để làm rõ được tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề tài)

Cách tiếp cận:

Vấn đề nghiên cứu được tiếp cận từ hai hướng: từ các công trình trong và ngoài nước đã công bố và từ kết quả thử nghiệm trên mẫu chứng cũng như mẫu thực địa Từ các thông tin lý

thuyết và thực tế, chúng tôi sẽ chọn các đối tượng khảo sát phù hợp với tình hình ở Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng

1 Tách chiết DNA, RNA theo phương pháp Boom (1990): mẫu được ly giải bởi guanidine thiocyanate, DNA/RNA được hấp phụ trên các hạt silica Sau nhiều bước rửa để loại tạp chất, DNA/RNA được dung giải trong nước hay trong dung dịch TE (Tris-EDTA)

2 Tách chiết DNA, RNA theo phương pháp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tủa): mẫu được ly giải với SDS hay một số hóa chất khác, protein trong mẫu được loại bỏ bằng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol Sau đó DNA/RNA được thu hồi qua ly tâm sau khi tủa với ethanol hay isopropanol

3 Phương pháp thiết kế các primer và probe: các phần mềm Annhyb, Primer Premier, ClustalX, Oligos được sử dụng để tìm các vùng bảo tồn trên các vùng gene mục tiêu, thiết kế rồi kiểm tra các đặc tính của các oligonucleotide đã thiết kế

4 Phương pháp PCR: DNA sau khi thu hồi được nhân bản trong phản ứng do hoạt động kéo dài các primer đã bắt cặp đặc hiệu trên mạch khuôn của enzyme Taq polymerase Sản phẩm khuếch đại của mỗi vùng gene mục tiêu có độ dài phân biệt với các sản phẩm còn lại

5 Phương pháp RT-PCR: RNA sau khi thu hồi được chuyển thành cDNA dưới hoạt động phiên mã ngược của enzyme reverse transcriptase (RT) Phản ứng PCR sau đó sử dụng cDNA để làm mạch khuôn cho quá trình tổng hợp sản phẩm

6 Phương pháp điện di trên gel agarose: Các sản phẩm nhân bản của phản ứng PCR

có độ dài khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau trong môi trường bán rắn của gel agarose dưới tác động của điện trường Kích thước của các sản phẩm được xác định tương đối khi so sánh về vị trí với các thang chuẩn

7 Phương pháp real-time PCR sử dụng Taqman probe: Hoạt động tổng hợp sản phẩm

PCR của Taq polymerase làm phân cắt Taqman probe bắt cặp đặc hiệu bên trong vùng gene mục

tiêu và giải phóng ra một phân tử phát huỳnh quang Mẫu được kết luận dương tính khi cường độ huỳnh quang thu được trong phản ứng tăng cao hơn giá trị ngưỡng tại một thời điểm bất kỳ

8 Phương pháp Southern blot sử dụng probe là DNA đặc trưng cho trình tự mục tiêu tạo dòng đánh dấu với digoxigenine Sản phẩm lai được phát hiện bằng phản ứng tạo màu với cộng hợp antiDIG-peroxidase và cơ chất là TMB (Kem-En-Tech)

9 Phương pháp tạo dòng: vector pGEM-T Easy (Promega) được sử dụng để tạo dòng các sản phẩm PCR Plasmid tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào E coli DH5

Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo:

Đây là đề tài đầu tiên được đề xuất ở Việt Nam ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc tạo các kit dùng trong phát hiện hai loại bệnh gây tác hại lớn cho ngành chăn nuôi heo là bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp

Chúng tôi kế thừa các nghiên cứu trong nước và ngoài nước vốn chủ yếu tập trung vào các vấn đề dịch tễ học để tạo những sản phẩm cụ thể có thể được triển khai rộng rãi trong lĩnh vực thú y

19 Phương án phối hợp với các tổ chức nghiên cứu và cơ sở sản xuất trong nước(Trình

bày rõ phương án phối hợp: tên các tổ chức phối hợp chính tham gia thực hiện đề tài và

nội dung công việc tham gia trong đề tài, kể cả các cơ sở sản xuất hoặc những người sử

dụng kết quả nghiên cứu; khả năng đóng góp về nhân lực, tài chính, cơ sở hạ tầng-nếu có)

Đề tài là một công trình nghiên cứu hợp tác giữa Trung Tâm Ứng Dụng Công Nghệ

Sinh Học Đồng Nai và Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Nội dung thực hiện đề tài

được phân bố như sau:

1 Trung Tâm Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Đồng Nai (TT UDCNSH ĐN)

- Tiếp nhận chuyển giao kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu để có thể ứng dụng các quy

trình và kit tạo được trong tương lai

- Đăng ký xét duyệt, giám sát, nghiệm thu đề tài với các cơ quan chức năng

- Điều phối kinh phí nghiên cứu

Nhân lực: 02

2 Công ty TNHH CNSH Khoa Thương (CT TNHH CNSH KT)

- Xây dựng các quy trình nhằm phát hiện các tác nhân gây bệnh “tai xanh” và tiêu chảy

cấp ở heo đã đăng ký

- Áp dụng các quy trình đã xây dựng vào việc tạo 4 loại kit như đã đăng ký; kiểm tra khả

năng sử dụng thực tế của các kit này

- Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các thành viên từ TT UDCNSH ĐN

- Chịu trách nhiệm cung cấp các thiết bị và hóa chất cũng như các chi phí khác cần thiết

cho nội dung nghiên cứu; đề tài được thực hiện tại phòng R&D của CT TNHH CNSH KT

Nhân lực: 05

2 Chi cục thú y Đồng Nai do Ông Trần Văn Quang – Chi cục phó- đại diện:

-Điều tra, liên kết với các hộ nông dân;

- Thu mẫu thực địa;

- Thu nhận các thông tin liên quan đến tình hình dịch bệnh của đàn heo và mẫu heo thu nhận

Nhân lực:02

20 Phương án hợp tác quốc tế (nếu có)

(Trình bày rõ phương án phối hợp: tên đối tác nước ngoài; nội dung đã hợp tác- đối với đối tác đã có hợp tác từ trước; nội dung cần hợp tác trong khuôn khổ đề tài; hình thức thực hiện Phân tích rõ lý do cần hợp tác và dự kiến kết quả hợp tác, tác động của hợp tác đối với kết quả của Đề tài )

Không có

21 Tiến độ thực hiện

Các nội dung, công việc

chủ yếu cần được thực hiện;

các mốc đánh giá chủ yếu

Kết quả phải đạt

Thời gian

(bắt đầu, kết

thúc)

Cá nhân,

tổ chức thực hiện*

Dự kiến kinh phí

1 Nội dung 1: Xây dựng các

quy trình phát hiện các tác

nhân gây bệnh ”tai xanh“ và

tiêu chảy cấp ở heo

Công việc 1: Thu mẫu thực

địa và thu thập thông tin về

tình hình heo bệnh - 500 mẫu heo bệnh

tiêu chảy cấp

CCTYĐN

Công việc 2: Xây dựng quy

trình xử lý mẫu và tách chiết

RNA virus hay DNA vi khuẩn

bằng hai phương pháp tủa và

Boom

Chọn được phương pháp tách chiết RNA

và DNA cho hiệu quả tách chiết cao

phát hiện từng tác nhân với

các thông số cần tối ưu hóa là:

cặp primer, nồng độ MgCl2,

nhiệt độ lai, lượng bản

mẫu/phản ứng

- Quy trình PCR multiplex

PEDV, TGEV và rotavirus

Các thông số cần tối ưu hóa:

- Xác định được các thông số tối ưu cho các phản ứng PCR monoplex

- Xác định được các thông số tối ưu cho các phản ứng PCR multiplex

- Xác định được tính đặc hiệu các sản phẩm PCR

- Xác định được độ nhạy kỹ thuật của các phản ứng PCR monoplex và

6 tháng CT TNHH

CNSH KT