Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5 mg đã được khoa dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” đã được thực hiện.
Trang 1XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLONIDIN TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
VỚI ĐẦU DÒ PDA
Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm * , Huỳnh Văn Hóa * , Lê Hậu * , Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Đức Tuấn*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Dạng thuốc dán hấp thu qua da với dược chất clonidin đã được phát
triển với tên thương mại là Catapres Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin chỉ có trong Dược điển Mỹ Trên thế giới chỉ có một vài công trình công bố qui trình định lượng clonidin được phóng thích từ thuốc dán Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương pháp LC-MS Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5 mg đã được Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công Bước tiếp theo của đề tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” đã được thực hiện
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin
chuẩn bằng phương pháp tủa protein và chiết pha rắn Thăm dò các điều kiện sắc ký về pha động: không có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào một tác nhân tạo cặp ion
Kết quả: Đã xác định được điều kiện thích hợp để chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn với
hiệu suất chiết khoảng 70% và có độ lặp lại cao Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng clonidin trong huyết tương thỏ Qui trình định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của FDA Hoa Kỳ Cuối cùng, qui trình đã được ứng dụng để định lượng clonidin trong một số mẫu huyết tương thỏ sau khi được dán thuốc thử nghiệm
Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công qui trình HPLC-PDA định lượng clonidin trong huyết tương thỏ
Qui trình có thể được tiếp tục ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên huyết tương thỏ
Từ khóa: Clonidin, huyết tương thỏ, sắc ký lỏng hiệu năng cao
ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDINE IN RABBIT PLASMA BY HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR
Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Truong Quoc Ky, Nguyen Duc Tuan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 14 - 20
Introduction - Aims: Transdermal patches containing clonidine have been launched into global market
under trade name Catapres–TTS (Transdermal Therapeutic System) for a long time So far, there’s only TTS monograph clonidine in USP Liquid chromatography coupled with mass spectrometry has recently been applied for measurement of clonidine in rabbit plasma In Vietnam, transdermal therapeutic system of clonidine 2.5 mg and 7.5 mg has been successfully prepared by Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City Therefore, the aim of this study was to develop a simple HPLC-PDA method for quantitative determination of clonidine in rabbit plasma
Subjects and Methods: Protein precipitation and solid phase extraction were applied for clonidine
extraction from rabbit plasma Several chromatographic conditions such as mobile phase including buffer, without
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2buffer, or added to one ion pair agent, were investigated
Results: The protein precipitation was successfully applied for clonidine extraction from rabbit plasma with
recovery of 70% and high repeatability The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of clonidine from rabbit plasma The liquid chromatographic method was validated and satisfied all requirements under the guidance of US FDA Finally, the validated method could be a reliable statement concerning quantitative determination of clonidine in rabbit plasma
Conclusion: A simple HPLC-PDA method was successfully developed for quantitative determination of
clonidine in rabbit plasma The method can be further applied for clonidine quantitation in in vivo bioavailability study of transdermal patches
Key words: Clonidine, rabbit plasma, HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dạng thuốc dán hấp thu qua da
(Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày
càng được quan tâm phát triển rộng rãi do có rất
nhiều ưu điểm so với thuốc viên Thuốc dán
điều trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế
phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin
Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin
chỉ có trong Dược điển Mỹ(3) Trên thế giới chỉ có
một công trình công bố qui trình định lượng
clonidin được phóng thích từ thuốc dán
Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương
pháp LC-MS(2) Tại Việt Nam, thuốc dán thấm
qua da clonidin 2,5 và 7,5mg đã được Khoa
Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
bào chế thành công Bước tiếp theo của đề tài là
tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc Vì
vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng
clonidin trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật sắc
ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA” đã được
thực hiện
ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc dán Clonidin 2,5 mg và 7,5 mg của
Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí
Minh
Chất đối chiếu và thuốc đối chiếu
Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm
lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng
04/2014 Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 7,5
Hóa chất, dung môi
Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1-heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Methanol đạt tiêu
chuẩn sắc ký lỏng (Merck)
Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 Cân phân tích Sartorius CP 224D Máy đo pH
Metrohm 744 Bể siêu âm Elma
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát điều kiện sắc ký
Clonidin là một chất có tính base, phân cực nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn Qua tham khảo các tài liệu(3,2,1) định lượng clonidin trong huyết tương, điều kiện sắc ký ban đầu được đề nghị như sau:
Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)
Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Pha động A (không có dung dịch đệm): methanol – nước (40:60) được điều chỉnh đến pH
3 bằng acid phosphoric
Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1 ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%
Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml
Trang 3natri 1-heptansulfonat và 1 ml acid phosphoric,
điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%
Khảo sát 3 hệ pha động trên để chọn điều
kiện sắc ký thích hợp thoả mãn các yêu cầu
sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác
(nếu có) và có hệ số đối xứng nằm trong
khoảng 0,8 – 1,5
Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác 11,8 mg clonidin HCl chuẩn,
cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ
sung bằng dung dịch KOH 0,0025% đến vạch,
lắc đều Dung dịch sau khi pha được bảo quản
ở 0 – 4oC Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với
nước để được các dung dịch chuẩn nồng độ từ
2 – 13 µg/ml
Tủa protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ
Trước tiên, chọn phương pháp tủa protein
để xử lý mẫu vì đây là phương pháp đơn giản,
không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thời gian
xử lý nhanh Do clonidin tan tốt trong methanol
nên dung môi này được lựa chọn để tủa protein
Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi/huyết tương
để tủa hoàn toàn protein
Áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE)
Dựa theo tài liệu tham khảo(2), dùng cột SPE
đã được nhồi sẵn 500 mg silicagel C18, thể tích 5
ml Hoạt hóa cột bằng 1 ml methanol, 1 ml nước
Cho 0,04 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,36
ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút Cho qua
cột SPE, để yên 5 phút Rửa cột với 1 ml nước và
1 ml methanol 5% Rửa giải cột với 0,8 ml
methanol
Tủa protein trong huyết tương bằng acid percloric
Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào
0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút Thêm
tiếp 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút
Tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric
70%, lắc rung 1 phút Ly tâm 14000 vòng/phút
trong 10 phút
Thẩm định phương pháp
Theo hướng dẫn của US FDA(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng,
tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết), giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ ổn định.
Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ
Thử nghiệm đối với thuốc dán chứa clonidin 7,5 mg/17,28 cm2 do Khoa Dược, ĐHYD Tp HCM bào chế và thuốc dán đối chiếu Catapres – TTS chứa clonidin 7,5 mg/10,5 cm2 Mỗi loại thuốc dán trên sẽ được thử nghiệm trên 6 thỏ Lấy một miếng thuốc dán dán lên vùng thử nghiệm trên da thỏ Lấy 1 ml máu thỏ qua tĩnh mạch vành tai thỏ vào các thời điểm 0, 6, 12, 24,
36, 48, 60, 72, 78 giờ Mẫu máu được đem ly tâm,
xử lý và tiến hành định lượng
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký
Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký được thể hiện qua hình 1
Với pha động A, pic clonidin xuất hiện rất sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58 phút nhưng bị kéo đuôi Pha động C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 11,4 – 12,8 phút, pic clonidin tách hoàn toàn pic tạp và có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 Vì vậy pha động C được lựa chọn
Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương
Phương pháp kết tủa protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ có ưu điểm là xử
lý mẫu nhanh, sau một tuần khảo sát, tỷ lệ methanol/ huyết tương để tủa hoàn toàn protein là 3:1 Tuy nhiên nồng độ clonidin bị loãng đi, còn lẫn nhiều tạp chất khi tiến hành sắc ký và pic clonidin không tách khỏi hoàn toàn pic tạp (hình 2)
Trang 4(a) (b)
Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C và mẫu huyết tương
trắng thêm dung dịch chuẩn: (d) với pha động C
Phương pháp chiết pha rắn có thời gian xử lý
mẫu lâu hơn, sau khi tiến hành sắc ký thấy còn
khá nhiều tạp và pic clonidin còn lẫn với các pic
tạp khác (hình 3)
Phương pháp tủa protein với acid percloric
dù còn nhiều tạp nhưng pic clonidin tách hoàn
toàn khỏi pic tạp và phát hiện được với nồng độ
mẫu rất thấp (hình 1d)
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được
xử lý bằng cách tủa protein với methanol
Hình 3: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được
xử lý bằng phương pháp chiết pha rắn
Do đó phương pháp xử lý mẫu huyết tương
bằng acid percloric được lựa chọn
Thẩm định phương pháp
Khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Kết quả phân tích lặp lại 6 lần mẫu huyết tương thêm chuẩn clonidin được trình bày ở bảng 1
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên
mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6)
Diện tích pic (µAu x giây)
Thời gian lưu (phút)
Hệ số đối xứng (A s )
Số đĩa lý thuyết (N)
Độ phân giải (R s )
Nhận xét: RSD của các thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý thuyết, độ phân giải đều có RSD < 2%, chứng tỏ qui trình có tính phù hợp hệ thống
Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu huyết tương thêm chuẩn và mẫu huyết tương trắng theo điều kiện sắc ký đã chọn Kết quả cho thấy: phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu huyết tương thêm chuẩn và mẫu chuẩn giống nhau (hình 4), thời gian lưu của pic trong mẫu huyết tương thêm chuẩn (hình 1d) tương đương với thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu huyết tương Clonidin HCl
Clonidin HCl
Trang 5clonidin, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh
khiết của pic cho thấy pic clonidin trong mẫu
huyết tương thêm chuẩn tinh khiết (hình 6) Do
đó, có thể khẳng định qui trình phân tích có tính đặc hiệu
Hình 4: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (a) và mẫu huyết tương thêm
chuẩn (b)
Hình 5: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 6: Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic clonidin
HCl trong mẫu huyết tương thêm chuẩn
Khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết, độ ổn định
Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết và
độ ổn định
4oC Mẫu huyết tương chứa clonidin có thể bảo quản ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ, bảo quản ở -70oC trong khoảng 1 tháng, ổn định sau 3 chu kỳ đông, rã đông và sau khi xử lý mẫu
12 tiếng ở nhiệt độ phòng
* Được thực hiện tại 3 nồng độ khác nhau 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml
Nhận xét: Bằng các kết quả thực nghiệm thu
được, phương pháp định lượng clonidin trong
huyết tương thỏ đạt yêu cầu thẩm định của quy
trình phân tích thuốc trong dịch sinh học về tính
phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, hiệu suất
chiết, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính,
độ đúng và độ chính xác, độ ổn định theo hướng
dẫn của FDA Hoa Kỳ(4)
Tóm tắt qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác 11,8 mg chuẩn clonidin HCl, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ sung bằng dung dịch KOH 0,0025% (g/ml) đến vạch, lắc đều Pha loãng dung dịch thu được với nước để thu được 3 dung dịch chuẩn ở 3 mức
Trang 6nồng độ sao cho nồng độ clonidin sau xử lý mẫu
huyết tương là 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml
Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49
ml huyết tương trắng, lắc rung (vortex) 1 phút,
thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1
phút, tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid
percloric 70%, lắc rung 1 phút Ly tâm 14000
vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch trong qua
màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký
Chuẩn bị mẫu thử
Lấy 0,5 ml huyết tương thỏ, thêm 0,05 ml
dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút, thêm 0,05
ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung 1 phút
Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch trong qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 260C
Pha động: hòa tan 1,21 g natri heptansulfonat trong 600 ml nước, thêm 400 ml methanol và 1
ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH = 3 bằng dung dịch KOH 30%
Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm Thể tích tiêm mẫu: 100 µl
Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ
Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ clonidin trong huyết tương thỏ theo thời gian sau khi dán thuốc dán
clonidin 7,5 mg và thuốc dán Catapres 7,5 mg
Nhận xét:
Thuốc dán Catapres 7,5 mg và clonidin 7,5
mg đều có nồng độ nồng độ clonidin cực đại
trong huyết tương thỏ tương đương sau khi dán
thuốc 36 giờ Không phát hiện clonidin sau khi
dán thuốc (0 giờ) và nồng độ clonidin trong
huyết tương thỏ nhỏ hơn giới hạn định lượng
dưới sau khi dán thuốc 6, 60, 72 và 78 giờ
Phương pháp HPLC-PDA tuy có độ nhạy không
bằng phương pháp LC-MS/MS nhưng giá trị giới
hạn định lượng dưới chấp nhận được để định
lượng hoạt chất trong huyết tương Các kết quả
định lượng ban đầu cho thấy qui trình có thể
được ứng dụng cho các nghiên cứu về sinh khả dụng trên thỏ
KẾT LUẬN
Đề tài đã xây dựng được qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA Qui trình định lượng clonidin đã được thẩm định về tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, tỷ lệ hồi phục và độ ổn định Qui trình đã được ứng dụng để định lượng clonidin trong huyết tương thỏ sau khi được dán thuốc thử nghiệm và có thể được tiếp tục ứng dụng để
Thời gian (Giờ)
Trang 7đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên
huyết tương thỏ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Determination of submicrogram quantities of clonidin in
biological fluids, Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(1), 72-74
sensitive, selective, precise and accurate LC-MS method for
determination of clonidine in human plasma, Chromatography,
69, 11-12
States Pharmacopeial Convention 557-563
Evaluation and Research (2001) Guidance for Industry:
Bioanalytical method validation, 3 – 15
Ngày nhận bài báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014