Xây dựng quy trình xác định vitamin C trong trái cây bằng phương pháp chuẩn độ điện thế sử dụng thuốc thử 2,6–Dichlorphenol indophenol

Bài viết Xây dựng quy trình xác định vitamin C trong trái cây bằng phương pháp chuẩn độ điện thế sử dụng thuốc thử 2,6–Dichlorphenol indophenol khảo sát được giá trị tối ưu của một số thông số của máy chuẩn độ điện thế; tìm được dung môi tối ưu là H2C2O4 cho quá trình chiết mẫu và môi trường tối ưu cho phản ứng chuẩn độ acid ascorbic với chất chuẩn 2,6 – DPIP (pH 4,0). Mời các bạn cùng tham khảo!

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH VITAMIN C TRONG TRÁI CÂY BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ ĐIỆN THẾ

SỬ DỤNG THUỐC THỬ 2,6 – DICHLORPHENOL INDOPHENOL

Huỳnh Anh Tuấn 1 , Huỳnh Nguyên Thảo Vy 2

1 Viện Phát triển ứng dụng Email: tuanha@tdmu.edu.vn 2 Trung tâm Tuyển sinh

TÓM TẮT

Vitamin C có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta, nó tham gia vào các quá trình oxi hoá – khử khác nhau ở cơ thể Thiếu vitamin C cơ thể sẽ bị bệnh hoại huyết, ảnh hưởng tiêu cực đến sự tự vệ của cơ thể đối với các bệnh nhiễm trùng khác Ngày nay

có nhiều phương pháp xác định vitamin C, tuy nhiên mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm của nó Bài báo này được thực hiện nhằm xác định vitamin C trong trái cây bằng phương pháp chuẩn độ điện thế sử dụng thuốc thử 2,6-Dichlorphenol indophenol (2,6-DPIP) Kết quả

đã khảo sát được giá trị tối ưu của một số thông số của máy chuẩn độ điện thế; tìm được dung môi tối ưu là H 2 C 2 O 4 cho quá trình chiết mẫu và môi trường tối ưu cho phản ứng chuẩn độ acid ascorbic với chất chuẩn 2,6 – DPIP (pH 4,0)

Từ khoá: 2,6- Dichlorphenol indophenol, Chuẩn độ hiệu điện thế, Vitamin C

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Vitamin C hay acid ascorbic là một vitamin tan trong nước, có thể tìm thấy trong nhiều hệ sinh học và thực phẩm như rau tươi và trái cây, cụ thể là cây có múi như cam, chanh, bưởi,… Nó phân bố rộng rãi trong tế bào thực vật, nơi đóng nhiều vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng

và trao đổi chất Là một chất chống oxy hóa mạnh, vitamin C có khả năng loại bỏ một số loại oxy phản ứng khác nhau, giữ cho chất chống oxy hóa a-tocopherol liên kết màng ở trạng thái khử, hoạt động như một yếu tố duy trì hoạt động của một số enzym (bằng cách giữ các ion kim loại trong trạng thái giảm), dường như là chất nền cho quá trình sinh tổng hợp oxalat và tartrat và có vai trò trong việc chống stress (Arrigoni & De Tullio, 2002; Davey, 2000; Klein & Kurilich, 2000) Vitamin C đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp collagen (Shingo Tajima, 1982) , sự hấp thụ sắt, và kích hoạt phản ứng miễn dịch và được tham gia trong việc chữa lành vết thương Nó cũng hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh mẽ chống lại các gốc tự do gây ra bệnh Ngoài ra, vitamin C còn làm tăng sức đề kháng của cơ thể, kích thích thượng thận bài tiết các corticosteroid, làm tăng sự trưởng thành của hồng cầu Thiếu vitamin C có thể làm vết thương chậm lành, khiếm khuyết cấu tạo răng, vỡ mao mạch gây xuất huyết dưới da, chảy máu chân răng (Nguyễn Thị Hiền và nnk, 2010)

Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả tươi như ớt, nước cam, chanh,

quýt và có hàm lượng cao trong rau xanh, tiêu, khoai tây, cải brussel, rau cải,

cà chua, ớt Tên theo IUPAC của Vitamin C: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4-

lactone-2,3-enediol; có công thức phân tử: C6H8O6 và công thức cấu tạo:

2,6-Dichlorophenol indophenol (DPIP) là một hợp

chất hóa học được sử dụng làm thuốc nhuộm oxi hóa khử

Khi bị oxy hóa, DPIP có màu xanh với độ hấp thụ cực đại

ở 600nm; khi giảm, DPIP không màu DPIP có thể được sử

dụng để đo tốc độ quang hợp DPIP có công thức phân tử:

C12H7NCl2O2 và công thức cấu tạo:

Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định vitamin C bao gồm chuẩn độ, quang phổ, điện hoá, sắc ký, động học… Nhưng do những hạn chế sẵn có, những kỹ thuật (trừ chuẩn độ và quang phổ) không thường được sử dụng để phân tích thường xuyên Tuy nhiên, phương pháp chuẩn độ điện thế được quan tâm nhiều vì dễ dàng tiếp cận, chi phí tương đối thấp

và độ nhạy tương đối, thích hợp cho việc xác định hàm lượng vitamin C bằng nhiều loại thuốc thử Do đó tôi tiến hành khảo sát và xây dựng quy trình xác định vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ điện thế sử dụng thuốc thử DPIP (TCVN 6427-2:1998)

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thực nghiệm

Hoá chất: Dung dịch acid oxalic 2%, dung dịch CH3COONa 10%, dung dịch Vitamin C 0.002N, dung dịch chuẩn C12H6Cl2NNaO2.2H2O 0.002N, dung dịch NaOH 1M, dung dịch

CH3COONa 1M, dung dịch HCl 1M, dung dịch đệm acetate pH = 4.46

Dụng cụ: Máy chuẩn độ điện thế, tủ hút, cân phân tích, các dụng cụ thường sử dụng trong phòng thí nghiệm

2.2 Phương pháp phân tích

DPIP là một thuốc nhuộm oxi hóa khử thường được sử dụng như một tác chất của các phản ứng quang hoá Phản ứng này có tính thuận nghịch, DPIP không màu, có thể bị oxy hoá sang màu xanh (Wikipedia,2015)

Nếu có mặt vitamin C, một tác nhân khử, thuốc nhuộm sẽ từ màu xanh chuyển sang màu hồng trong môi trường acid và bị khử thành một hợp chất không màu bởi acid ascorbic DPIP (màu xanh) + H + → DPIPH (màu hồng)

DPIPH (màu hồng) + Vitamin C–

→ DPIPH2 (không màu)

Trong quá trình chuẩn độ, khi tất cả các acid ascorbic trong dung dịch đã được sử dụng,

sẽ không có bất kỳ điện tử có sẵn để khử DPIPH và dung dịch sẽ vẫn còn màu hồng do thừa các DPIPH Điểm cuối chuẩn độ dung dịch có màu hồng bền trong 10 giây hoặc nhiều hơn

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các thông số của máy chuẩn độ điện thế

Để tối ưu hoá các thông số trên máy chuẩn độ điện thế, chúng tôi tiến hành chuẩn độ 5

mL acid ascorbic 0.002 N bằng dung dịch chuẩn 2,6 – dichlorphenol indophenol 0.002 N trong môi trường acid oxalic Hiệu chuẩn chế độ MET (monotonic equivalence point) U, MET Ipol

và MET Upol sử dụng điện cực platin 60431100 và điện cực platin 60338100 Các thông số khảo sát là Signal.Drift, EPC (end point criterion), I (pol) và U (pol)

3.1.1 Kết quả khảo sát các thông số trên máy chuẩn độ điện thế sử dụng điện cực Pt

60431100

Kết quả khảo sát các thông số trên máy chuẩn độ điện thế (hình 1) cho thấy khi sử dụng điện cực Pt 60431100 máy chỉ ghi nhận được tín hiệu và thông tin chuẩn độ khi sử dụng chế độ MET U, không ghi nhận được tín hiệu trong trường hợp MET Upol và MET Ipol

c MET Ipol (overrange)

Hình 1 Đồ thị khảo sát thông số chế độ MET U, MET Upol và MET Ipol với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60431100

Ghi nhận sự biến đổi thế theo thể tích dung dịch chuẩn thêm vào, kết quả đường vi phân

∆E/∆V theo V trung bình được thể hiện ở hình 2 Kết quả này cho thấy điểm tương đương ghi nhận được tương ứng V trung bình là 4.35 mL

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

V (mL)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

V (mL)

Hình 2 Đồ thị dạng vi phân máy ghi nhận MET U với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60431100

Bảng 1 Kết quả khảo sát thông số trên máy với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60431100 với chế độ MET – U

Thông số Giá trị V EP (mL) C AA thực tế (N) C AA lý thuyết (N) (%) Sai số tương đối

(mV/min)

(EPC = 10 mV)

EPC

(Signal drift =

10 mV/min)

4,355

0.0001

95,24 19,05

Kết quả so sánh V tương đương trên máy và theo đồ thị vi phân là tương đương nhau, kết quả này so với giá trị đúng có sai số tương đối khoảng 19.05 (%) Ngoài ra, khi thay đổi các thông số signal drift (bảng 1) sẽ nhận thấy thông số signal drift không ảnh hưởng đến giá trị V tương đương cũng như số điểm tương đương ghi nhận Trong khi đó, nếu EPC thấp, máy sẽ ghi nhận nhiều điểm tương đương, do đó nên chọn khoảng EPC phù hợp để giảm sai số

Các kết quả khảo sát trên cũng cho thấy với điện cực Pt 60431100 chỉ thích hợp cho chế

độ MET–Uvới các thông số Signal.Drift = 10 mV/min và EPC = 10 mV

3.1.2 Kết quả khảo sát các thông số trên máy chuẩn độ điện thế sử dụng điện cực Pt

60338100

Kết quả khảo sát các thông số trên máy chuẩn độ điện thế (hình 3) cho thấy khi sử dụng điện cực Pt 60338100 máy chỉ ghi nhận được tín hiệu và thông tin chuẩn độ khi sử dụng chế độ MET Upol và MET Ipol, không ghi nhận được tín hiệu trong trường hợp MET U

-250 -200 -150 -100 -50 0 50 100

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

V (mL)

c MET Ipol

Hình 3 Đồ thị khảo sát thông số chế độ MET U, MET Upol và MET Ipol với với thuốc thử

DPIP sử dụng điện cực Pt 60338100

Ghi nhận sự biến đổi thế theo thể tích dung dịch chuẩn thêm vào, kết quả đường vi phân

∆E/∆V theo V trung bình được thể hiện ở hình 4 Kết quả này cho thấy điểm tương đương ghi nhận được tương ứng V trung bình chế độ MET Upol bằng 4.25 mL (19.05%) và MET Ipol bằng 5.25 mL (4.76%)

a Đồ thị dạng vi phân máy ghi nhận MET

Upol

b Đồ thị dạng vi phân máy ghi nhận MET

Ipol

Hình 4 Đồ thị dang vi phân máy ghi nhận MET Upol và MET Ipol với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60338100

Bảng 2 Kết quả khảo sát thông số trên máy với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60338100 với chế độ MET – Upol

Thông số Giá trị Kết quả trên máy

(mL)

C AA thực tế (N)

C AA

lý thuyết (N) (%) Sai số tương đối

U (pol) - µA

(EPC = 0,5 mV)

1

1,157 5,150 5,780

0,0005 0,0020 0,0023

0,0021

76,19 4,76 9,52

5

1,157 5,150 5,780

0,0005 0,0020 0,0023

0,0021

76,19 4,76 9,52

10

1,157 5,150 5,780

0,0005 0,0020 0,0023

0,0021

76,19 4,76 9,52

5,150

0,0005

76,19 4,76

0 100 200 300 400 500 600 700 800

V (mL)

-2

0

2

4

6

8

10

12

-3000 -2500 -2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500

Thông số Giá trị Kết quả trên máy (mL) C AA

thực tế (N)

C AA

lý thuyết (N) (%) Sai số tương đối

EPC – mV

(U (pol) = 1 µA)

0.5

1,157 5,150 5,780

0,0005 0,0020 0,0023

0,0021

76,19 4,76 9,52 0.6

1,157 5,150 5,780

0,0005 0,0020 0,0023

0,0021

76,19 4,76 9,52

Bảng 3 Kết quả khảo sát thông số trên máy với thuốc thử DPIP

sử dụng điện cực Pt 60338100 với chế độ MET – Ipol

Thông số Giá trị Kết quả

trên máy (mL)

C AA thực tế (N)

C AA

lý thuyết (N) (%) Sai số tương đối

I (pol) µA

(EPC = 1 mV)

5,150

0,0006

71,43 4,76

5,150

0,0006

71,43 4,76

5,150

0,0006

71,43 4,76

5,150

0,0006

71,43 4,76

EPC

(I(pol) = 5 µA)

5,150

0,0006

71,43 4,76

Nhận xét: qua kết quả khảo sát thông số trên máy chuẩn độ điện thế sử dụng điện cực Pt

60338100 chỉ thích hợp cho chế độ MET-Upol và MET Ipol Ở chế độ MET-Upol, chúng tôi

đã khảo sát được giá trị tối ưu của hai thông số U (pol) = 1µA và EPC = 0.8 mV, ở chế độ MET Ipol, đã khảo sát được giá trị tối ưu của hai thông số I (pol) = 1 µA và EPC = 5 mV

Bảng 4 Kết quả vi phân khảo sát thông số trên máy với thuốc thử DPIP

Chế độ Kết quả vi phân (mL) C AA thực tế (N) C AA lý thuyết (N) (%) Sai số tương đối

Để tối ưu hóa quy trình khảo sát các thông số trên máy chuẩn độ điện thế dùng trong chuẩn độ acid ascorbic bằng dung dịch chuẩn DPIP trong môi trường acid oxalic, thì chế độ MET Ipol đã được chọn, ở chế độ này cho kết quả sai số thấp nhất và có độ sai lệch thấp giữa kết quả trên máy và kết quả vi phân

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Để khảo sát ảnh hưởng của pH giữa acid ascorbic với 2,6 – dichlorphenol indophenol Hút chính xác 5 mL acid ascorbic vào beacher 250 mL, thêm 100 mL nước cất Sau đó, điều chỉnh pH dung dịch thay đổi từ 1 – 14 và chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn 2,6 – dichlorphenol indophenol 0.002 N

Bảng 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với thuốc thử DPIP

C AA (N) lý thuyết pH đầu pH cuối V DPIP (mL) C AA (N) thực tế (%) Sai số tương đối

0,100 N

Hình 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với thuốc thử DPIP

Nhận xét: Từ kết quả khảo sát, chúng tôi thấy, khoảng pH thích hợp để chuẩn độ acid ascorbic với chất chuẩn 2,6 – dichlorphenol indophenol là khoảng 4.0 Tại khoảng pH này, có thể nhận thấy sai số tương đối của phép chuẩn độ là thấp nhất

3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Để khảo sát quy trình xử lý mẫu vitamin C trong thực phẩm (rau, củ quả), tiến hành cân

10 g mẫu rau quả đã được loại bỏ hạt, nghiền nhỏ, chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml và định mức lên bằng nước, CH3COOH 10% và C2H2O4 2% Để yên 10 phút cho acid ascorbic trong mẫu hoà tan hết, đem lọc và thu dung dịch qua lọc Sau đó, chuẩn độ dung dịch thu được bằng phương pháp chuẩn độ điện thế sử dụng dung dịch chuẩn DPIP 0.002 N với các điều kiện tối ưu ở trên

Kết quả quy trình xử lý mẫu được thể hiện trong bảng 7 Nhận xét: Qua kết quả khảo sát các dung môi chiết Ta thấy rằng, sử dụng dung môi chiết H2C2O4 cho hiệu suất thu hồi cao hơn CH3COOH và H2O Vì thế, chúng tôi quyết định chọn H2C2O4 làm dung môi chiết tối ưu cho qui trình xử lý mẫu

Bảng 6 Kết quả khảo sát dung môi chiết không thêm chuẩn với thuốc thử DPIP

Loại mẫu Dung môi chiết m mẫu (g) C DPIP (N) V DPIP (mL) AA (mg/g mẫu)

Sơ ri

0,0020

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

C AA

Bảng 7 Kết quả khảo sát dung môi chiết khi thêm chuẩn với thuốc thử DPIP

Loại mẫu Dung môi chiết m mẫu + m chuẩn (g) C DPIP (N) V DPIP (mL) AA (mg/g mẫu) H%

Sơ ri

0.0021

Nhận xét: Qua kết quả khảo sát các loại dung môi chiết Chúng tôi thấy rằng, sử dụng dung môi chiết H2C2O4 cho hiệu suất thu hồi cao hơn CH3COOH và H2O Vì thế, quyết định chọn H2C2O4 làm dung môi chiết tối ưu cho qui trình xử lý mẫu

3.4 Khảo sát hiệu suất thu hồi và phân tích mẫu

Để khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình, tiến hành thêm acid ascobic vào mẫu ban đầu,

xử lý mẫu thêm chuẩn và không thêm chuẩn bằng dung dịch chiết thích hợp, dung dịch sau chiết được chuẩn bằng dung dịch chuẩn 2,6 – dichlorphenol indophenol 0.002 N với các điều kiện tối ưu ở trên Từ đó tính được hiệu suất thu hồi của quy trình

Kết quả hiệu suất thu hồi của quy trình được thể hiện trong bảng 8 và 9:

Bảng 8 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi

của quy trình không thêm chuẩn sử dụng thuốc thử DPIP

Loại mẫu m mẫu (g) V DPIP (mL) C DPIP (N) m AA (mg/g) 𝒎̅ AA (mg/g)

4,25

0,0020

3,74

3,80 ± 0,24

Bảng 9 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình khi thêm chuẩn với thuốc thử DPIP

Loại mẫu m chuẩn + mẫu (g) C DPIP (N) V DPIP (mL) AA (mg/g) H% 𝐇 ̅̅̅%

87,46

Nhận xét: Dựa vào bảng kết quả trên, thấy hiệu suất thu hồi của phương pháp khi sử dụng thuốc thử DPIP tương đối cao (gần 100%) Với hiệu suất này ta có thể định lượng chính xác lượng vitamin C với độ tin cậy cao

3.5 Phân tích mẫu

Cân 5 - 10 g mẫu đã cắt nhỏ, cho vào cối sứ 10 mL dung dịch acid oxalic 2%, nghiền nhỏ, lọc gạn phần dịch trong sang becher 100 mL Cho thêm 10 mL dung dịch acid oxalic, nghiền nhỏ

và tiếp tục lọc gạn phần dịch trong sang becher Thêm 10 mL dung dịch acid oxalic 2%, nghiền nhỏ, gộp tất cả vào bình định mức 100 mL, tráng cối và chày sứ bằng dung dịch acid oxalic, cho vào bình định mức và định mức và định mức đến vạch Để yên 10 phút cho acid ascorbic trong mẫu hoà tan hết, đem lọc và thu dung dịch qua lọc Lưu ý phải loại bỏ một vài mL dịch lọc đầu Lấy 1 mL mẫu đã lọc, 2 mL đệm pH = 4.6 Chuẩn độ bằng 2,6 DPIP và ghi nhận thể tích 2,6 DPIP tiêu tốn, vẽ đồ thị và xác định hàm lượng vitamin C

Công thức tính toán:

Hàm lượng Vitamin C, tính bằng miligam, có trong 100 gam mẫu được tính theo công thức:

mg ascorbic

100g

⁄ = (C × V)DPIP × D × F ×100

m (mg/100g)

Trong đó: F: là hệ số pha loãng

D : đương lượng gam acid ascorbic

C,V : nồng độ và thể tích của lượng DPIP tiêu tốn

m: khối lượng mẫu (g)

Bảng 10 Kết quả phân tích mẫu với thuốc thử DPIP

Loại mẫu m mẫu (g) V DPIP (mL) m AA (mg/100g) 𝒎 ̅𝑨𝑨 (mg/100g)

481,30 ± 15,92

Từ bảng 10, có thể thấy hàm lượng vitamin C trong quả sơ ri rất nhiều, kết quả này cũng trùng khớp với nhóm tác giả Lê Mỹ Hồng khi khảo sát hàm lượng vitamin để chế biến nước trái cây Mezadri và nnk, 2006, cũng đã nói so với các loại trái khác thì sơ ri là loại trái cây có nguồn vitamin C dồi dào, từ 695 đến 4827 mg/100 g trái tươi

4 KẾT LUẬN

Nghiên cứu này tìm được giá trị tối ưu của một số thông số của máy chuẩn độ điện thế; tìm được dung môi tối ưu là H2C2O4 cho quá trình chiết mẫu và môi trường tối ưu cho phản ứng chuẩn độ acid ascorbic với chất chuẩn 2,6 – DPIP (pH 4,0)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Arrigoni, O., & De Tullio, M C (2002) Ascorbic acid: Much more than just an antioxidant Biochimica et Biophysica Acta, 1569, 1–9

2 Davey, M W., Van Montagu, M., Inze´, D., Sanmartin, M., Kanellis, A., Smirnoff, N., et al (2000) Plant L-ascorbic acid: Chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing Journal of the Science of Food and Agriculture, 80, 825–860

3 Klein, B P., & Kurilich, A C (2000) Processing effects on dietary antioxidants from plant foods HortScience, 35(4), 580–584

4 Lê Mỹ Hồng, Nguyễn Thị Minh Duyên, Võ Ngọc Thúy, Nguyễn Thái Hiếu Hạnh, Quá trình chế biến nước trái cây hỗn hợp (sơ ri, khóm, chanh dây) (2009), Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 2009:11 235-244

5 Mezadri T, Fernández-Pachón MS, Villaño D, García-Parrilla MC, Troncoso AM El fruto de la acerola: composición, características productivas e importancia económica [The acerola fruit: composition, productive characteristics and economic importance] Arch Latinoam Nutr 2006 Jun;56(2):101-9 Spanish

6 Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phú, Trần Thanh Đại (2010), “Phân tích thực phẩm”, NXB Lao Động

7 Shingo Tajima, Sheldon R Pinnell, Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid Ascorbic acid

increases type I procollagen mRNA, Biochemical and Biophysical Research Communications,

Volume 106, Issue 2, 1982, Pages 632-637,

8 TCVN 6427-2: 1998 “Rau, quả và các sản phẩm rau quả - Xác định hàm lượng acid ascorbic Phần 2: Phương pháp thông dụng”

9 Wikipedia - https://en.wikipedia.org/wiki/Dichlorophenolindophenol