Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn tại hưng yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

VŨ PHÚC TRƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MẦM BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



VŨ PHÚC TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MẦM BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



VŨ PHÚC TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Đề tài được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài “Nghiên cứu một số đặc

điểm sinh học phân tử của các chủng virus gây ra dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine epidemic diarrhea-PED) đang lưu hành ở Việt Nam và ứng dụng trong chẩn đoán và định hướng sản xuất vaccine” do Quỹ phát triển khoa học và công

nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ, mã số đề tài là 106-NN.04-2014.16

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Vũ Phúc Trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn PGS.TS Nguyễn

Bá Hiên đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS Lê Văn Phan đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia đình, đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Vũ Phúc Trường

MỤC LỤC

Trang

1.2 Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm

Chương 2 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2 Nguyên liệu 17

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

TGE Transmissible Gastro Enteritis

95% CI 95 % Confidence Level

DANH MỤC BẢNG

3.3 Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Phù Cừ với

3.7 Tỷ lệ tử vong do bệnh PED theo lứa tuổi 38

3.14 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide của gene S của các chủng 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.6 So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi của bệnh PED tại huyện

DANH MỤC HÌNH

3.1 Kết quả chẩn đoán virus PED bằng phản ứng RT-PCR M: Marker DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) Giếng 1 – 8: 8 mẫu bệnh phẩm khác nhau tương ứng là VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2,

VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 Sản phẩm

3.2 So sánh trình tự nucleotide của gen S giữa các chủng virus PED

trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự

3.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen S giữa các chủng virus PED trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid của chủng VNUA/PED- HY1, sự sai khác về amino acid của các chủng

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chăn nuôi ở nước ta hiện nay đang phát triển mạnh mẽ đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngày càng lớn của xã hội và góp phần thúc đẩy kinh tế xã hội phát triển Đặc biệt, chăn nuôi lợn đã có nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng được phần lớn nhu cầu về thực phẩm cho xã hội Ở nhiều nước trên thế giới, mức tiêu thụ thịt lợn tính trên đầu người chiếm tỷ lệ cao so với các loại thịt khác Ở Việt Nam, tỷ lệ thịt lợn hơi tính theo đầu người chiếm phần lớn (khoảng 73%) trên tổng số các loại thịt được tiêu thụ hàng năm Chăn nuôi lợn đã trở thành nguồn thu nhập quan trọng đối với các hộ nông dân và là một trong những nghề góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp

Hưng Yên là tỉnh có ngành chăn nuôi tương đối phát triển, hiện nay tổng đàn trâu, bò có khoảng 40.000 con, đàn lợn trên 500.000 con, đàn gia cầm gần 8 triệu con và chăn nuôi của tỉnh ngày càng phát triển theo hướng sản xuất hàng hóa, đem lại thu nhập chính cho ngành nông nghiệp

Song song với sự phát triển đó, vấn đề về dịch bệnh diễn biến ngày càng phức tạp làm ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của ngành chăn nuôi cũng như làm thiệt hại về kinh tế

Trong những năm gần đây “bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn” thường xuyên xảy ra làm thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn do làm tăng chi phí phòng, chống bệnh, thiệt hại về số lượng…

Bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một

bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae

gây ra Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi Ở Châu Âu Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc gia khác ở Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan

Ở Việt Nam, bệnh PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ

đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng

cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vắc xin Trong khi các chủng virus thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật được các đặc tính sinh học của các chủng virus PED đóng vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vắc xin thích hợp và hiệu quả phục vụ cho công tác tiêm phòng

Để hạn chế dịch bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn do virus PED gây ra thì việc nghiên cứu về dịch tễ học, và nghiên cứu được những đặc tính sinh học phân

tử của virus PED là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng trong công tác phòng, chống dịch bệnh xảy ra trên đàn lợn và định hướng chiến lược cho việc sản xuất vắc xin phòng bệnh trong tương lai Vì vậy, xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở

lợn tại Hưng Yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

+ Tỷ lệ mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi

+ Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi

+ Một số triệu chứng lâm sang của bệnh PED

+ Một số đặc điểm về bệnh tích của bệnh PED ở lợn

- Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của PEDV được phân lập tại các ổ dịch trên địa bản tỉnh Hưng Yên:

+ Ứng dụng kỹ thuật RT- PCR trong chẩn đoán nhanh virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PED)

+ Giải mã, phân tích gen S (gen mã hóa cho protein Spike) của các chủng

PEDV thu thập được trong các mẫu bệnh phẩm

+ Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá về nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV thu thập được

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp, hoàn thiện thêm các thông tin dịch tễ học về bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn và đặc tính sinh học phân tử của virus

- Dựa trên những kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài để đề xuất các biện pháp phòng, chống phù hợp, từ đó khuyến cáo tới người chăn nuôi cũng như chính quyền địa phương triển khai áp dụng các biện pháp đồng bộ trong việc phòng, chống bệnh trên địa bàn tỉnh giúp cho ngành chăn nuôi phát triển ổn định

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.1 Nước ngoài

Bệnh PED ở lợn lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971 do virus PED gây ra Ban đầu virus PED được gọi là EVD (Epidemic viral diarrhea) gây bệnh trên lợn con, đặc biệt là lợn mới sinh, có tỉ lệ gây chết lên tới 100% Đến năm 1976, một phân type mới của virus EVD được phát hiện trên lợn ở mọi lứa tuổi, được gọi là virus EVD type 2 để phân biệt với virus EVD type 1 ban đầu (Wood, 1977) Năm 1978, Debouck và Pensaert đã phát hiện virus EVD type 2 là một dạng giống với coronavirus (Debouck and Pensaert, 1980), cũng từ thời gian

này, dịch EVD được chuyển tên thành dịch PED

Trong khoảng thời gian từ năm 1980 tới 1990, các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các Quốc gia Châu Âu như Bỉ, Anh, Đức, Pháp,

Hà Lan, Thụy Sỹ Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các Quốc gia Châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and Park, 2012) Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện năm 1973, sau hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của PEDV tương đối ít Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát ngày càng trầm trọng ở các Tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn

Từ tháng 2 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012) Ở Nhật, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết

từ 30 tới 100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con Ở Hàn Quốc, dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp

xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28kb Hệ gen bao gồm ít

nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc (gai(S), vỏ (E), màng (M) và nucleocapsid (N)) và 3 loại protein không cấu trúc (replicase 1a, 1b và ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’(Bridgen et al., 1993; Bridgen et al., 1998; Duarte and Laude, 1994 Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự gen S, M, và ORF3 (Song and Park, 2012) Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3) (Park et al., 2007) Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu (Do Tien Duy

et al., 2011; Puranaveja et al., 2009) ORF3 là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ, không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này trong việc quyết định độc tính của PEDV Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực địa Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm (Kusanagi et al., 1992) Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong việc phát hiện PEDV như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử hoặc phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), tuy nhiên các kỹ thuật này tiêu tốn nhiều thời gian và độ nhạy cũng như tính đặc hiệu thấp Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí nghiệm và từ thực địa (Tobler and Ackermann, 1995; Tobler and Ackermann, 1996) Để khẳng định sự có mặt của

PEDV trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen

M Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản, đã có rất nhiều những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplex-RT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006)

RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng DNA đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn

so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra số lượng lớn hơn các đoạn DNA (Ren and Li, 2011) Các kit phân tích Immunochromatography cũng được

sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98% Kỹ thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy

nhiên cho phép chẩn đoán nhanh trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012)

1.1.2 Trong nước

Hiện nay ở Việt Nam, Nguyễn Đình Quát và cộng sự đã sử dụng phương pháp nested-RT-PCR để phát hiện PEDV (Nguyen Dinh Quat et al., 2011) và Nguyễn Tất Toàn và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính di truyền của PEDV phân lập được từ các Tỉnh Miền Nam Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012) Ngoài ra chưa có nghiên cứu nào về mức độ quy mô và chuyên sâu để đánh giá một cách có

hệ thống về đăc điểm dịch tễ và sự phân bố của các chủng PEDV đang lưu hành ở Việt Nam hiện nay Các kết quả nghiên của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học quan trọng trong việc khoanh vùng dịch, định hướng chọn chủng sản xuất vaccine, cũng như góp phần đánh giá chất lượng vaccine nhập khẩu và sản xuất trong nước để từ

đó có chiến lược phòng chống dịch PED lâu dài ở Việt Nam

1.2 Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm gần đây

1.2.1 Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới

Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng Hiện nay, các ổ dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh Hơn

nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn mới sinh sản, trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh Tuy nhiên ở châu Á, dịch bệnh dữ dội với tỷ lệ tử vong cao vẫn xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi và không có sự khác biệt về mặt lâm sàng với dịch TGE cấp tính, gây tổn thất nặng nề về kinh tế

Trong thời gian cuối năm 2007 – 2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước Dịch lan rộng đã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan Phân tích phát sinh loài, thấy tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở Trung Quốc JS – 2004 – 2 (S.Puranaveja và cs, 2009)

1.2.2 Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam

Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy

ở Việt Nam (Nguồn: Báo Nông Nghiệp VN số 178 ra ngày 7/9/2011) Trong năm

2008 – 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ Tỷ lệ tử vong giữa các tỉnh dao động từ 65 – 91% Theo nhận định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009 Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi), ở các tỉnh ở miền Bắc thì phòng xét nghiệm nhanh chỉ mới ghi nhận có một trại bị nhiễm bệnh này thuộc tỉnh Thái Nguyên

Nhìn chung, bệnh chủ yếu xảy ra ở khu vực Nam Bộ với những trận dịch lớn, tuy nhiên ở khu vực phía Bắc cũng đã xuất hiện rải rác ở 1 số trại tại các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang…

1.2.3 Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên

Trên địa bàn tỉnh Hưng Yên trong những năm gần đây bệnh vẫn xảy ra rải rác, tập trung chủ yếu tại những địa phương có mật độ chăn nuôi lợn cao Bệnh

xảy ra quanh năm không theo mùa nhất định Bệnh tiến triển rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ Tỷ lệ tử vong dao động từ

65 – 91% Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu cụ thể nào về dặc điểm dịch tễ và đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh trên địa bàn do vậy việc áp dụng các biện pháp phòng chống bệnh của người chăn nuôi còn gặp nhiều khó khăn gây ra tổn thất về kinh tế cũng như cơ cấu đàn

1.3 Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)

1.3.1 Phân loại

Năm 1978, Pensaert và Deouck đã phân lập được virus gây dịch tiêu chảy

ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus – PEDV), mẫu được lấy từ ổ dịch xảy ra

ở Bỉ và Anh (1976) Virus gây dịch tiêu chảy (PEDV) là một thành viên họ Coronaviridae, phân họ Coronavirinae, giống Coronavirus PEDV được xếp vào nhóm 1 giống Coronavirus, cùng với TGEV, coronavirus gây bệnh cho mèo (feline coronavirus), coronavirus gây bệnh cho chó (canice coronavirus) và coronavirus gây bệnh cho người chủng 229E (human coronavirus) Dựa vào kết quả giải trình tự gen cho thấy PEDV có quan hệ gần gũi nhất với coronavirus gây bệnh cho người chủng 229E và TGEV

1.3.2 Hình thái, cấu trúc của PEDV

Hình thái, tính chất lý hóa và đặc điểm sinh học của hạt vius PED là đặc trưng cho họ Coronavirus Cấu trúc của PEDV giống với các virus khác trong họ,

có đường kính khoảng 90 – 190nm, là virus có vỏ bọc, nhân có cấu trúc là RNA sợi đơn, có kích thước lớn nhất từ 27 – 32 kb, với đầu 5’ và đuôi poly A 3’ Trên

bề mặt hạt virus có nhiều gai dạng hình chùy nhô ra, dài khoảng 20 nm Virus nhân lên thông qua việc nảy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ

Hình 1.1: Hình thái, cấu trúc của PEDV

Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012 (14)

1.3.3 Đặc tính nuôi cấy của virút

- Đặc tính nuôi cấy trong môi trường tế bào: Ban đầu, việc nhân virus PED được thực hiện bằng cách gây nhiễm cho lợn con theo đường miệng (DeBouck và Pensaert, 1980), bằng cách cho lợn con uống virus Việc nuôi cấy virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn, người ta đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công Phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học,

và công tác quản lý dịch bệnh

Năm 1988, Hofmann và Wyler đã nghiên cứu thành công môi trường tế bào thích hợp để PEDV phát triển, nhân lên và có thể phân lập được virus Đến nay, tế bào Vero (thận khỉ xanh châu Phi) có thể cấy chuyển được PEDV, gây bệnh tích tế bào, tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của men trypsin trong môi trường nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy, virus tác động lên tế bào hình thành các không bào và thể hợp bào (có thể lên tới 100 nhân) Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ Ngoài ra, virus PED đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở Nhật Bản (Shibata và cs, 2000) Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P – 5V) đã được sử

dụng làm chủng virus vaccine và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6

và IB – RS2 (Kadoi K và cs,2002)

- Sức đề kháng: PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 40C và giữa pH 6.5 – 7.5 tại 370C, bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9 Trong môi trường nuôi cấy thích nghi, virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 600C/30’, nhưng ổn định ở 500C Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài PEDV bị bất hoạt bởi hầu hết các chất khử trùng bao gồm cả: cresol, natri hydroxyt 2% (NaOH 2%), formol 1%, natri cacbonate (4% muối khan hoặc 10% dạng tinh thể với 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa có ion và không ion, iodophor mạnh (1%) trong acid phosphoric và dung môi lipid như chloroform (Callebaut P và DeBouck, 1981)

1.3.4 Dịch tễ học

1.3.4.1 Động vật cảm nhiễm

Bệnh xảy ra ở loài lợn Lợn có thể mắc ở mọi lứa tuổi Trong nhiều ổ dịch,

tỷ lệ nhiễm có thể lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình của lợn con là 50% nhưng cũng có thể rất cao 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 – 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 – 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%

1.3.4.2.Phương thức truyền lây:

Phương thức truyền lây của PEDV tương tự với TGEV, nhưng PEDV có

xu hướng tồn tại dễ dàng hơn trên cơ thể đã bị nhiễm bệnh Đường truyền phân miệng có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác PED cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4 – 5 ngày sau khi lợn bán hoặc mua về Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về hoặc các dụng

cụ có mang virus như: xe vận chuyển, ủng, quần áo bảo hộ…đây là những nguồn lây nhiễm tiềm năng cho lợn mẫn cảm PEDV không khác nhiều TGEV về đường truyền lây nhưng virus này có vẻ tồn tại lâu hơn trong các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi Khi dịch xảy ra ở trại lợn sinh sản, virus có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương Một chu kỳ dịch địa phương có thể được hình thành nếu số lứa lợn được sinh ra và lợn cai sữa

trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy Khả năng lây lan sang người và sự tác động tới sức khỏe cộng đồng cho tới nay chưa có công bố nào về sự lây truyền của PEDV sang người và các loài khác

1.3.4.3.Cơ chế gây bệnh:

Cơ chế sinh bệnh của PEDV được nghiên cứu trên lợn con không được bú sữa đầu Cho lợn con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777, sau khoảng 22 – 36 giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá hủy các tế bào biểu mô, làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột

và làm giảm hoạt động của enzym bề mặt biểu mô ruột Tỷ lệ chiều cao và độ dày của lông nhung thay đổi từ 7:1 xuống còn 3:1 (Utiger và cs, 1995; Porpischil

A, 1981) Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể quan sát được sau 12 – 18 giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 – 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế bào biểu mô ở kết tràng Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của lợn rất giống với TGEV So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy

sự nhân lên của virus ở các tế bào bên ngoài đường tiêu hóa Shibata và cộng sự (2000) đã chỉ ra rằng ở lợn sạch bệnh (SPF - specific pathogen free) khi được uống virus PED phân lập từ thực địa ở độ tuổi từ 2 ngày đến 12 tuần, sức đề

kháng tăng dần theo tuổi và lợn chỉ bị chết khi trong giai đoạn từ 2 – 7 ngày tuổi (Shibata và cs, 2000) Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo hoại

tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành

Biểu hiện và tiến triển lâm sàng của lợn sạch bệnh bị gây nhiễm chủng PEDV đã thích nghi trên môi trường nuôi cấy tế bào (ca – PEDV) nhẹ hơn nhiều

so với lợn nhiễm chủng thể hoang dại (wt – PEDV), độc lực của chủng ca – PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ sinh sản của virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt

vi thể ở các cơ quan của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn

1.3.5 Triệu chứng lâm sàng

Các mức độ nghiêm trọng gây ra bởi PEDV là rất khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch và tình hình dịch bệnh ở các trang trại lợn Khi lợn mắc PED, biểu hiện chủ yếu và thường là duy nhất ở lợn đó là tiêu chảy mạnh, phân rất nhiều nước Lợn có hiện tượng bỏ ăn, mệt mỏi

Lợn con theo mẹ: gầy, lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng, có sữa không tiêu; nôn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nước Lợn con thích nằm lên bụng mẹ, điều trị bằng các loại kháng sinh đặc trị tiêu chảy không có kết quả Lợn sinh sản: tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết rất khác nhau Lợn thường qua khỏi sau 1 tuần Bệnh xảy ra ở những trại giống mẫn cảm có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong rất khác nhau Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc với tỷ lệ có thể lên tới 100% Biểu hiện của PED tương tự TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có

tỷ lệ chết ở lợn con thấp hơn Lợn con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước sau khi tiêu chảy 2 – 4 ngày Tỷ lệ chết ở lợn con trung bình khoảng 50%, nhưng

có thể cao hơn tới 100% Ở giai đoạn lớn hơn, lợn thường tự hồi phục sau khi quá trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần Khi PED cấp tính ở 1 trại nào đó qua đi thì lợn con giai đoạn 2 – 3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và lợn mới nhập về thường phát bệnh Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp

tính điển hình với tỷ lệ chết cao trên lợn sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhưng các ổ dịch tại Nhật Bản và Hàn Quốc lại cho thấy tỷ lệ lợn sơ sinh chết rất cao (Sueyoshi M và cs, 1995; Chae C và cs, 2000)

Lợn trong giai đoạn vỗ béo: nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng

1 tuần tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước Biểu hiện lợn mắc PED trong giai đoạn vỗ béo

có thể nặng hơn so với mắc TGE Lợn thường có biểu hiện đau vùng bụng nhiều hơn Sau khoảng 7 – 10 ngày, lợn sẽ hồi phục.Tỷ lệ tử vong lợn ở giai đoạn này thường từ 1 -3%, lợn chết nhanh thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi có biểu hiện tiêu chảy.Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại lợn có giống mẫn cảm và chịu nhiều stress

1.3.6 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của PED tương tự như bệnh TGE Bệnh tích thường tập trung ở đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non Dạ dày thường trống rỗng do lợn nôn và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng do sự kém hấp thu ở ruột Ruột non màu nhợt nhạt, chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng tới mức có thể nhìn thấy được bên trong do sự teo lại của tầng niêm mạc.Chất chứa trong ruột non lợn cợn Hạch ruột xung huyết, xuất huyết

Hình 1.2: Bệnh tích ruột căng phồng ở lợn con

Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012(14)

Về mặt vi thể, có sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào biểu mô và sự bong tróc của tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hòa lẫn vào nhau rõ rệt Tuy nhiên, các biểu hiện này không rõ bằng TGE Ở kết tràng chưa có bệnh tích vi thể nào được báo cáo Điều thú vị là các nghiên cứu siêu vi thể đã cho thấy sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương

tế bào và sự thay đổi ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng Những thay đổi cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang ruột Sau đó, các tế bào trở nên phẳng, dẹt, các mối liên kết chặt chẽ bị mất đi và các tế bào rơi vào trong lòng ống ruột

1.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PEDV

1.3.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán Các triệu chứng điển hình như: lợn con theo mẹ lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng như kem, có sữa không tiêu, nôn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nước, lợn con hay nằm lên bụng mẹ

1.3.7.2 Chẩn đoán huyết thanh học

Sử dụng phương pháp chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang hoặc hóa mô miễn dịch có thể cho kết quả tương đối nhanh và chính xác Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế là mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán phải là ruột của lợn được giết khi mới bị tiêu chảy Nếu bệnh phẩm của lợn bị chết tự nhiên thì kết quả không được tin cậy

Hiện nay, một số Kit ELISA được phát triển để xác định kháng nguyên (PEDV) có trong phân của lợn và xác định sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh

1.3.7.3 Chẩn đoán virus học

Sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) để phân biệt hai virus gây bệnh PED và bệnh TGE

1.3.7.4 Chẩn đoán phân biệt

Ngoài tiêu chảy do PEDV, có nhiều bệnh khác cũng gây ra triệu chứng tiêu chảy, đó là phản ứng của cơ thể và hậu quả có liên quan đến đường ruột như:

* Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (TGE-Transmissible Gastro Enteritis):

Nguyên nhân do virus thuộc họ Coronavirus, bệnh lây lan nhanh và tỷ lệ

chết của lợn con rất cao Bệnh xảy ra ở lợn con dưới 2 tuần tuổi, lợn mất nước, sút cân nhanh, nôn mửa, ỉa chảy phân nhiều nước, màu vàng hoặc hơi xanh, lổn nhổn mùi khó chịu Bệnh tích là thành ruột non mỏng, dạ dày chứa sữa không tiêu màu trắng do TGEV phá hủy nhung mao ruột Ở lợn trưởng thành bệnh ở thể mang bệnh ít biểu hiện

* Bệnh do Rotavirus:

Bệnh do virus thuộc họ Reoviridae gây ra, thường xảy ra ở lợn 1-5 ngày tuổi,

tỷ lệ chết cao 50 - 100% Triệu chứng điển hình là phân nhão như hồ sau phân lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất vón Do virus cư trú, hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng tiêu hóa và hấp thu kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc và chậm lớn

* Bệnh do E.coli (Colibaccillosis):

Sau khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa, vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non bằng các yếu tố bám dính Tại đây vi khuẩn phát triển nhân lên, phá hủy tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố Toxigenic hoặc Verotoxin, gây tụ huyết, xuất huyết, hoặc vi khuẩn cư trú tại ruột gây chứng viêm ruột cấp Nếu con vật vượt qua giai đoạn này thường để lại bệnh tích ở hạch màng treo ruột, gan, lách và túi mật Với những gia súc trưởng thành khỏe mạnh

có thể không có triệu chứng lâm sàng nhưng có bệnh tích ở phủ tạng, vùng bụng

* Bệnh phó thương hàn (Salmonellosis):

Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa đến 4 tháng tuổi, lợn lớn ít mắc hơn Con vật có triệu chứng bỏ ăn, sốt cao 40.5 -41.6oC, ho khan khò khè, lúc đầu đi táo, sau khi nhiệt độ hạ xuống, con vật ỉa chảy nặng, phân lỏng sống màu vàng bột như cám, da xuất hiện những đám

tụ máu, gan có những điểm hoại tử hoặc áp se, lợn chết ở những ngày đầu lách sưng to, tụ máu Nếu lợn mắc ở thể mãn tính lách dai như cao su Niêm mạc ruột

già viêm loét, vết loét lan tràn bờ nông Do ỉa chảy nhiều, con vật dễ dẫn đến lòi dom và giai đoạn sau liệt cơ vòng hậu môn Da nhợt nhạt lông xù, bụng hóp lại hõm sâu xuống

* Bệnh hồng lỵ do Treponema:

Bệnh do xoắn khuẩn Treponema hyodysenteria gây nên thường kết hợp với phẩy

khuẩn Vibro và các nhóm vi khuẩn đường ruột khác Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa từ 3-6 tháng tuổi, dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là tiêu chảy, phân có lẫn máu tươi màng niêm mạc và dịch nhầy do viêm ruột già, manh tràng, trực tràng

Cơ thể suy nhược, mất nước, chậm lớn

là thời điểm 1-3 ngày tuổi sau khi sinh Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy ra máu, tỷ lệ chết cao, có bệnh tích ở ruột non xuất huyết máu đỏ tươi

Chương 2 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trong những năm gần đây trên địa bàn tỉnh Hưng Yên với các nội dung: lứa tuổi mắc bệnh, tỷ lệ chết, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể,…

- Khảo sát một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây bệnh PED trên đàn lợn của tỉnh Hưng Yên

2.2 Nguyên liệu

- Đàn lợn được nuôi trên địa bàn tỉnh Hưng Yên

- Số liệu điều tra tình hình bệnh PED theo phiếu điều tra một số ổ dịch tại địa phương

- Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu ruột và phân của lợn nghi mắc bệnh PED

- Trang thiết bị, dụng cụ cần thiết để mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm và các trang thiết bị để sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử của mầm bệnh như: Găng tay, khẩu trang, panh, kẹp, kéo, dao mổ, ống đựng mẫu, chày, cối, ống Eppendorf, micropipette, máy li tâm, máy trộn, máy PCR System 9700, hóa chất cần thiết khác,…

- Cặp mồi dùng trong chẩn đoán PEDV là cặp mồi P1/P2, trình tự cặp mồi như sau:

Mồi xuôi/ngược Trình tự mồi (5’ – 3’) Kích thước (bp) Tác giả

651 Kim và cs, 2001[20]

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: các huyện có cơ cấu đàn lợn lớn trên địa bàn tỉnh Hưng Yên Cụ thể, đề tài được tiến hành trên địa bàn 4 huyện: Tiên Lữ, Phù Cừ,

Ân Thi và Văn Giang Nội dung nghiên cứu được thực hiện tại địa bàn 4 huyện nêu trên

2.4 Phương pháp nghiên cứu.

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

a) Thu thập số liệu

Số liệu bệnh PED ở lợn, hộ chăn nuôi lợn có dịch năm 2014 - 2015 từ việc điều tra và tổng hợp Trong đó: Lợn mắc PED là lợn có các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh

b) Phân tích số liệu

Dữ liệu thu thập được xử lý bằng phầm mềm Excel 2007

2.4.2 Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

a) Lấy mẫu bệnh phẩm:

Mẫu bệnh phẩm là phân hoặc ruột của lợn nghi nhiễm bệnh tiêu chảy cấp PED từ các trại lợn được thu thập bảo quản trong các ống chứa mẫu đã được vô trùng Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng cho phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh PED Chỉ các mẫu dương tính với PEDV mới được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu tiếp theo

b) Phương pháp tách chiết RNA của PEDV từ các mẫu bệnh phẩm

Trizol (Invitrogen) được dùng để tách chiết RNA của PEDV, các bước được tiến hành theo sự chỉ dẫn cụ thể theo hướng dẫn chuẩn của nhà sản xuất Cụ thể, bổ sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex và sau đó bổ sung tiếp 200µl dung dịch Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Huyễn dịch trên được ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Sau khi ly tâm, chuyển pha trên có chứa RNA vào một ống Eppendorf mới (với lượng khoảng 500µl) Tủa RNA của virus bằng cách bổ sung 500µl dung dịch Isopropanol, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Rửa tủa RNA bằng 1ml dung dịch Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Hòa RNA

trong 30µl nước vô trùng đã loại Rnase và bảo quản ở -20oC

c) Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ Kit SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’- CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ Thành phần phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5µl RNA tinh sạch, 4.5µl nước

đã loại RNase, 3µl dNTPs (2.5 mM mỗi loại), 2µl mồi oligo dT (200 pM/µl), 1µl SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase (200 U/µl), 0.5µl RNase inhibitor (10 U/µl) và 4µl 5x first strand buffer Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút

d) Phương pháp PCR và giải trình tự gen (sequencing)

cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng Kit AccuPower PCR PreMix (BIONEER) Kit này chứa DNA taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình chuẩn như sau: 30 chu kỳ (94°C - 1 phút, 54°C - 1 phút, 72°C - 1 phút) và cuối cùng 8 phút ở 72°C Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose và được gửi sang công ty Macrogen của Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự gen Trình tự DNA thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit và DNAstar Hơn thế nữa, chúng tôi cũng tiến hành so sánh với trình tự genome của virus PED trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế bằng phần mềm MegAlign (DNASTAR, Madison, WI)

e) Phương pháp one-step RT-PCR để chẩn đoán và định type PEDV

RNA sau khi tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm PEDV sẽ được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng RT-PCR sử dụng kit Accupower RT-PCR premix (BIONEER, Hàn Quốc) Kit này chứa enzyme phiên mã ngược, taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình tạo cDNA và khuếch đại DNA Sau đó bổ sung cặp primer đặc hiệu được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen cấu trúc gai (S) của PEDV Phản ứng one-step RT-PCR được thực hiện theo chương trình như sau: 42o C trong 30 phút để tạo cDNA, tiếp đến là 5 chu kỳ (94o C trong 30 giây, 55o C trong 30 giây, 72o C trong

30 giây), tiếp theo là 30 chu kỳ (94o C trong 30 giây, 53o C trong 30 giây, 72o C trong 30 giây) và cuối cùng là 72o C trong 8 phút Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose

h) Phương pháp xây dựng cây phả hệ

Trên cơ sở trình tự gen của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp neighbor-joining algorithm Lịch sử tiến hóa và mối quan hệ họ hàng của các type PEDV phân lập được xác định bằng phương pháp neighbor-joining Tree topology được xác định bằng phân tích bootstrap từ dữ liệu neighbor-joining bằng chương trình SEQBOOT and CONSENSE

So sánh trình tự nucleotide và acid amin suy diễn của các chủng PEDV phân lập ở Việt Nam với trình tự công bố trên Ngân hàng Dữ liệu gen Quốc tế, chúng tôi sẽ tiến hành phân tích đánh giá được sự biến đổi di truyền, nguồn gốc tiến hóa của PEDV, đồng thời có thể dự báo nguy cơ xảy ra và chọn được chủng, biến chủng phù hợp cho việc sản xuất vaccine PED nhập khẩu vào Việt Nam

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh

3.1.1 Kết quả điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

Để tìm hiểu và đánh giá mức độ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi, chúng tôi tiến hành theo dõi tỷ lệ mắc bệnh trên từng độ tuổi của lợn Chúng tôi đã tiến hành theo dõi trên các đàn lợn với 804 con tại các hộ có bệnh ở các giai đoạn lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa, lợn choai và lợn trưởng thành trên địa bàn 4 huyện xuất hiện bệnh: Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi và Văn Giang Kết quả điều tra được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi với độ tin cậy

95% CI

Độ tuổi của lợn

Số con theo dõi

(con)

Số con mắc bệnh PED

(95% CI) (con)

Ở giai đoạn lợn con theo mẹ bộ máy tiêu hóa và hệ thống miễn dịch của lợn con đang bắt đầu phát triển, kháng thể và dinh dưỡng chủ yếu được tryền từ lợn mẹ