Khảo sát ảnh hưởng của nano berberine lên một số đặc tính sinh học của nguyên bào sợi nướu người nghiên cứu in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN VĂN VUI KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BERBERINE LÊN MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NGUYÊN BÀO SỢI NƯỚU NGƯỜI – NGHIÊN CỨU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRẦN VĂN VUI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BERBERINE LÊN MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

SINH HỌC CỦA NGUYÊN BÀO SỢI

NƯỚU NGƯỜI – NGHIÊN CỨU IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRẦN VĂN VUI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BERBERINE LÊN MỘT SỐĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NGUYÊN BÀO SỢI NƯỚU NGƯỜI –

NGHIÊN CỨU IN VITRO

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Trần Văn Vui

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ

chân thành và quý báu của các thầy cô, anh chị và bạn bè đồng nghiệp tại

cơ quan đang công tác

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa học là

TS.BS Nguyễn Quang Tâm đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình

thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn cô PGS.TS Trần Lê Bảo Hà và các thầy cô

tại Phòng thí nghiệm kỹ nghệ mô và vật liệu Y sinh, Bộ môn Sinh lý học và

Công nghệ sinh học động vật, Khoa Sinh học - Công nghệ sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn trung tâm nghiên cứu triển khai – Khu công

nghệ cao TP Hồ Chí Minh đã cung cấp vật liệu Nano Berberine làm nghiên

cứu Nhân đây tôi cũng cám ơn các bạn đồng nghiệp đã cung cấp hình ảnh,

tài liệu và số liệu cho tôi Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những sự

giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường, Phòng

sau đại học và Ban lãnh đạo khoa Răng Hàm Mặt cùng toàn thể các thầy cô

giáo giảng dạy lớp cao học và gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp

đỡ tôi hoàn thành khóa học

Xin chân thành cảm ơn,

Tác giả luận văn

Trần Văn Vui

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nguyên bào sợi và Nano Berberine 3

1.2 Thử nghiệm độc tính tế bào 12

1.3 Thử nghiệm đánh giá đặc tính tăng sinh và di cư của tế bào 14

1.4 Thử nghiệm co gel collagen 15

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 32

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Độc tính của Nano Berberine đối với tế bào nguyên bào sợi nướu người 33

3.2 Tác động của Nano Berberin lên sự tăng sinh và di cư của nguyên bào sợi nướu người 37

3.3 Tác động của Nano Berberine lên sự co gel collagen của nguyên bào sợi nướu người 46

Chương 4: BÀN LUẬN 50

4.1 Về độc tính của Nano Berberine đối với tế bào nguyên bào sợi nướu

người 51

4.2 Tác động của Nano Berberine lên sự tăng sinh và di cư của nguyên bào

sợi nướu người 51

4.3 Tác động của Nano Berberine lên sự co gel collagen của nguyên bào

sợi nướu người 57 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ECM Extracellular matrix

EDTA Ethylene diaminetetraacetid acid

EMT Epithelial mesenchymal transition

FBS Fetal bovine serum

PBS Phosphate buffered saline

PEG Polyethylene glycol

RER Rough endoplastic reticulum

RGR Relative cell growth rate

SMC Smooth muscle cell

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Phosphate buffered saline

Fetal bovine serum

Inverted microscope

Optical denity

Rough endoplastic reticulum

Danger-associated Molecular Pattern

Extracellular matrix

Human gingival fibroblast cells

Epithelial mesenchymal transition

Kính hiển vi đảo ngược Mật độ quang học

Mạng lưới nội chất thô

Mô hình phân tử gây hại Nền ngoại bào

Nguyên bào sợi nướu người

Sự chuyển dạng biểu mô – trung mô

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Mức độ độc tế bào dựa theo phần trăm RGR 20

Bảng 3.1 Kết quả các nghiệm thức đánh giá độc tính của Nano Berberin đối với tế bào hGF 34

Bảng 3.2 Phân loại độc tính Nano Berberine 2% theo nồng độ pha loãng 35 Bảng 3.3 Đánh giá tác động của Nano Berberine lên sự tăng sinh 37

Bảng 3.4 Tăng sinh tế bào của các mẫu nghiên cứu tại ngày 1 38

Bảng 3.5 Tăng sinh tế bào của các mẫu nghiên cứu tại ngày 3 39

Bảng 3.6 Tăng sinh tế bào của các mẫu nghiên cứu tại ngày 5 39

Bảng 3.7 Tăng sinh tế bào của các mẫu nghiên cứu tại ngày 7 41

Bảng 3.8 Tăng sinh tế bào của các mẫu nghiên cứu tại ngày 9 42

Bảng 3.9 Nghiệm thức đánh giá tác động của Nano Berberine lên sự di cư hGF 44

Bảng 3.10 Sự thay đổi diện tích vùng vô bào 45

Bảng 3.11 Nghiệm thức đánh giá tác động của Nano Berberine 2% x 10-4

lên sự co gel collagen của hGF 47

Bảng 3.12 Diện tích co gel collagen tại ngày 0 và ngày 7 48

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Độc tính Nano Berberine 2% theo các nồng độ pha loãng 36 Biểu đồ 3.2 Xu hướng tăng sinh của các mẫu nghiên thử nghiệm 43 Biểu đồ 3.3 Phần trăm diện tích vùng vô bào tại thời điểm 24 giờ 46 Biểu đồ 3.4 Phần trăm diện tích co gel collagen tại ngày 7 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nguyên bào sợi quan sát dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Berberine 8

Hình 1.3 Các con đường tác động của berberin đến Candida albicans 9

Hình 1.4 Tóm tắt con đường kháng viêm của Berberine 11

Hình 2.1 Một số dụng cụ được sử dụng 28

Hình 2.2 Một số thiết bị thường dùng 29

Hình 2.3 Buồng đếm tế bào 22

Hình 2.4 Mô hình thử nghiệm Scratch-test (“wound healing assay”) 25

Hình 3.1 Hình ảnh kết quả thử nghiệm độc tính Nano Berberine 33

Hình 3.2 Hình ảnh nghiệm thức âm, nghiệm thức dương và nghiệm thức thí nghiệm tại thời điểm 0 giờ và 24 giờ 44

Hình 3.3 Hình ảnh sự co collagen ngày 0 và ngày 7 47

MỞ ĐẦU

Với xu hướng phát triển của nha khoa thẩm mỹ và nha khoa phục hồi trong thời gian gần đây, một số tổn thương tại vùng răng miệng gây nên do vật bén nhọn như móc phục hình hàm giả, các khí cụ trong chỉnh nha, hay đơn giản chỉ là vết loét trong nướu cũng đối mặt với nguy cơ bội nhiễm bởi

vi khuẩn vì khả năng phơi nhiễm của vết thương trong thời gian dài Thúc đẩy sự lành thương là chìa khóa để hạn chế các nguy cơ nhiễm trùng Thông thường, sự lành thương ở mô nướu sẽ diễn ra do vai trò hoạt động tạo ra collagen của nguyên bào sợi nướu Để hỗ trợ cho quá trình này diễn

ra nhanh chóng, đã có nhiều kháng sinh được chỉ định [2]

Với tình trạng kháng thuốc cũng như lạm dụng thuốc kháng sinh như hiện nay, các dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên đã và đang được cân nhắc

sử dụng trong việc chăm sóc sức khoẻ nói chung và sức khoẻ răng miệng nói riêng [12]

Quá trình lành thương trong miệng bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau, vì thế vết thương niêm mạc miệng cần có nhiều thời gian để sửa chữa và phục hồi Nguyên bào sợi nướu người là loại tế bào chiếm ưu thế trong lớp đệm niêm mạc nướu và là loại tế bào chính trong các mô liên kết nha chu Ngoài ra nguyên bào sợi còn tham gia vào quá trình lành thương,

sự xâm nhập của các nguyên bào sợi vào vết thương là điều cần thiết cho

sự hình thành mô, sửa chữa mô, sản xuất và lắng đọng collagen

Hiện nay trên thị trường có khá nhiều sản phẩm nước súc miệng hỗ trợ sát khuẩn khoang miệng và làm nhanh tiến trình lành thương với nhiều thành phần như chlorhexidine, povidone –iod, berberine…

Berberin (BBr) là một alkaloid thuộc nhóm isoquinoline được chiết xuất từ các loại cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis với hàm lượng khoảng 1,5-3% [20] Berberine đã được sử dụng rộng rãi trong

y học cổ truyền, thường được dùng nhiều để trị các bệnh đường ruột, bệnh

gan mật, bệnh ngoài da… Berberine đã thu hút được sự chú ý trong những năm gần đây do có tác dụng dược lý như chống ung thư, kháng virus, kháng khuẩn và kháng viêm [7], [34] Trên thị trường có sản phẩm nước súc miệng có chứa Berberine chloride hỗ trợ điều trị nha chu và thúc đẩy nhanh lành thương sau phẫu thuật miệng

Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng Berberine lại bị hạn chế trong sử dụng lâm sàng do ít tan trong nước, khó hấp thu qua ruột và đặc biệt tính sinh khả dụng rất thấp (chỉ khoảng 5%) [48] Các nhà khoa học đã bào chế Berberine thành dạng kích thước hạt nano gọi là Nano Berberine có thể cải thiện độ tan, tốc độ hòa tan, từ đó nâng cao tính sinh khả dụng của nó [4]

Hiện nay trên thế giới chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng của hạt nano Berberine lên nguyên bào sợi nướu răng Vì thế chúng tôi muốn đi tìm những bằng chứng khoa học cho việc ứng dụng của Nano Berberine trong sự lành thương ở mô nướu miệng bằng việc khảo sát tác động của chúng lên tế bào trong phòng thí nghiệm

Chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của Nano Berberine lên một số đặc tính sinh học của nguyên bào sợi nướu

người – Nghiên cứu in vitro” với 3 mục tiêu:

1 Xác định nồng độ Nano Berberine không gây độc lên nguyên bào sợi nướu người

2 Đánh giá ảnh hưởng của Nano Berberine lên sự tăng sinh và di cư của nguyên bào sợi nướu người

3 Đánh giá ảnh hưởng của Nano Berberine lên đặc tính co gel collagen của nguyên bào sợi nướu người

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nguyên bào sợi

Nguyên bào sợi là loại tế bào thường gặp nhất trong các mô liên kết, có nguồn gốc từ những tế bào trung mô trong phôi thai và những tế bào nguyên bào sợi phân chia trong cơ thể trưởng thành [18]

Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những tế bào non, ít biệt hóa Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh ngắn, nhân

có hình bầu dục hoặc hình cầu, có một hoặc một vài nhân Nhân của nguyên bào sợi cô đặc kéo dài theo trục dọc của tế bào [18]

Nguyên bào sợi là kiểu tế bào khá đặc biệt trong mô liên kết Chúng phân tán khắp nơi trong mô liên kết của cơ thể và tiết ra chất nền ngoại bào một cách linh động, giàu collagen kiểu I và kiểu III Khi mô liên kết bị tổn thương, nguyên bào sợi di chuyển vào bên trong vết thương, tăng trưởng và tạo ra một lượng lớn chất nền collagen giúp cho việc cô lập và sửa chữa mô bị thương Nguyên bào sợi là loại tế bào linh hoạt nhất trong mô liên kết, có khả năng biệt hóa tạo ra các tế bào khác nhau trong mô liên kết Đây là một bằng chứng cho thấy nguyên bào sợi

ở các bộ phận khác nhau của cơ thể thực tế rất khác nhau Mô liên kết có thể chứa nhiều dòng nguyên bào sợi khác biệt, một vài trong số chúng có thể biệt hóa thành tế bào sụn, tế bào mỡ hoặc nhiều loại tế bào khác của

mô liên kết [2]

Hình 1.1 Nguyên bào sợi quan sát dưới kính hiển vi điện tử

( Nguồn: Sriam G, 2015 [43])

Nguyên bào sợi trong lành thương

Tổn thương trong vết thương cấp và mạn thường xảy ra khi có thất bại trong các giai đoạn lành thương bình thường Mặc dù tỉ lệ khả năng và

mô hình lành thương phụ thuộc vào yếu tố tại chỗ, toàn thân, và phẫu thuật của ký chủ, nhưng các giai đoạn của lành thương niêm mạc miệng cũng gần giống như lành thương ở da Tuy nhiên, lành thương trong miệng thường nhanh hơn và ít sẹo hơn so với vết thương ở da

Nguyên bào sợi đóng vai trò quan trọng trong điều hòa chu chuyển của khuôn ngoại bào (ECM) Trong mô bị tổn thương, nguyên bào sợi được hoạt hóa và biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ, với khả năng co và đặc biệt trong lành thương bởi vì nó giảm kích thước vết thương và tiết ra protein ECM Sự biệt hóa của nguyên bào sợi thành nguyên bào sợi cơ là việc quyết định trong lành thương mô liên kết

Về kiểu hình, nguyên bào sợi cơ là tế bào trung gian giữa nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn (SMC) Nguyên bào sợi cơ bắt đầu xuất hiện sớm

trong giai đoạn hình thành mô hạt, trở nên nhiều nhất trong giai đoạn tăng sinh của sự lành thương, và dần dần biến mất trong giai đoạn sau của sự lành thương, có thể do cơ chế chết lập trình [30]

Có nhiều nguồn nguyên bào sợi cơ để đáp ứng nhu cầu cao của tế bào có trong sửa chữa mô Nguyên bào sợi cơ trong vết thương da thường được cho là từ việc huy động nguyên bào sợi tại chỗ trong mô da và dưới

da xung quanh vết thương Tuy nhiên pericytes và cơ trơn mạch máu cũng

là nguồn tiềm năng cho nguyên bào sợi cơ, đặc biệt quan trọng trong lành thương mạch máu Có bằng chứng cho rằng nguyên bào sợi cơ bắt nguồn

từ tế bào biểu mô hình ống thông qua sự chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT) Ngoài ra, nguyên bào sợi cơ có thể đến từ tế bào sợi máu ngoại vi,

tế bào tiền thân tuần hoàn là quần thể con của bạch cầu có nguồn gốc tủy xương Một nguồn khác của nguyên bào sợi cơ có thể từ tế bào gốc chuyên biệt, với điều kiện thích hợp có thể biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ Tuy nhiên, vẫn còn chưa rõ nguồn gốc của nguyên bào sợi cơ hoặc đặc điểm khác nhau và chức năng trong lành thương [30]

Nguyên bào sợi nướu

Collagen là thành phần chính của nướu và nguyên bào sợi là tế bào sản xuất collagen chính trong nướu [31] Nguyên bào sợi từ nướu của con người có thể được nuôi cấy lâu dài và được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của tổng hợp collagen

Nguyên bào sợi nướu người có hình thái chung là hình thoi, trục chính nằm nghiêng Các hạt nhân thường có hình elip với màng nhân mịn, mặc dù một số dạng lõm Các hạt nhân thường chứa 2 đến 5 nucleoli, đây

là một đặc điểm đặc trưng cho các tế bào phát triển nhanh chóng với tỷ lệ tổng hợp protein cao [31] Tế bào chất chứa hầu hết bào quan tập trung ở các cực của trục chính tế bào, các vi chất và polyribosome chiếm ưu thế Ở

độ phóng đại lớn hơn, sự phân cực của hạt nhân dọc theo trục chính của

bào quan, bào tương như mạng lưới nội chất thô, bộ máy Golgi và ty thể rõ ràng hơn Ty thể được kéo dài, xoắn, và đôi khi phân nhánh Mạng lưới nội chất thô (RER) bao gồm một mạng lưới chặt chẽ bao xung quanh nhân và song song với trục tế bào Những túi chứa RER thường được tìm thấy trong các mặt phẳng tiếp tuyến và chứa điện tử dày đặc, vật liệu hạt mịn

Nguyên bào sợi nướu người có nhiều điểm tương đồng với nguyên bào sợi da người bao gồm hình dạng tổng thể của tế bào, sự sắp xếp phân cực của tế bào chất, ty thể dài, mỏng, số lượng lớn lybosome, autophagosome, và phân phối ribosome của RER Nguyên bào sợi nướu và nguyên bào sợi da có sự khác biệt cụ thể ở mô, chẳng hạn như tốc độ sao chép và tuổi thọ khác nhau

Một trong những đặc điểm nổi bật nhất của nguyên bào sợi nuôi cấy

là thành phần vi sợi dày đặc của chúng nổi bật hơn so với nguyên bào sợi trong mô Các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang sử dụng thuốc thử chống actin cho thấy các vi chất này bao gồm Actin Vai trò sinh học của các vi chất đã được nghiên cứu rộng rãi và các cấu trúc này được cho là quan trọng trong việc di chuyển tế bào, duy trì hình dạng tế bào Ngoài ra, nguyên bào sợi nướu người tổng hợp được collagen I và collagen III

Vai trò của nguyên bào sợi nướu trong lành thương

Ở mô nha chu, nguyên bào sợi tạo ra collagen một cách nhanh chóng và là trung gian gây suy thoái nội bào Mô nướu và mô liên kết nha chu bao gồm một số loại collagen có cấu trúc và chức năng khác nhau bám trên răng để chống đỡ cấu trúc và cung cấp tín hiệu, hình thức cho mô [33]

Sự nhận biết tế bào của collagen qua trung gian bởi một loạt các thụ thể bề mặt, chẳng hạn như integrin, thụ thể miền discoidin, và các thụ thể liên quan đến miễn dịch Khi collagen gắn kết, các thụ thể này có

thể kích hoạt các phân tử khác liên quan đến quá trình tu sửa, viêm và chữa lành vết thương, như các chất nền (MMP), cytokine và các yếu tố tăng trưởng [33]

Collagen loại I (COL-I) làm tăng sự giải phóng và hoạt động của interleukin-1β (IL-1β) trong máu ngoại vi của con người và đơn bào liên kết sau khi gắn trong phản ứng trung gian bởi integrin α2β1 (ITGA2B1)

và như một phần của cơ chế tu sửa COL-I có thể đóng vai trò như một

mô hình phân tử gây hại (DAMP) bằng cách tăng sự bùng phát hô hấp ở bạch cầu và mức mRNA mã hóa gen cho IL-1β và các phân tử gây viêm khác trong thực bào chuyên nghiệp

Việc điều chế sản phẩm của nguyên bào sợi do các phân tử ECM như collagen được coi là kích thích bởi cả kích thích cơ học và sinh hóa

Tổng quan về Berberine

Berberine (BBr) là một alkaloid thuộc nhóm isoquinoline được chiết xuất từ các loại cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis với hàm lượng khoảng 1,5-3% [20]

BBr đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền, thường được dùng nhiều để trị các bệnh đường ruột, bệnh gan mật, bệnh ngoài da… BBr đã thu hút được sự chú ý trong những năm gần đây do có tác dụng dược lý như chống ung thư, kháng virus, kháng khuẩn và kháng viêm [21], [36]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Berberine

(Nguồn: Hou, 2019 [20]) Berberine cũng đã được sử dụng trong Y học Trung Quốc để phòng ngừa và điều trị các bệnh răng miệng Berberine được chứng minh có tác dụng tăng sinh nguyên bào sợi có nguồn gốc từ dây chằng nha chu ở người (tế bào hPDL) [21]

Bệnh nha chu liên quan đến sự phá hủy mô do tương tác giữa các kháng nguyên vi khuẩn và các chất trung gian gây viêm bao gồm chất nền metalloproteinase (MMPs) [21] MMP là một họ enzyme chứa kẽm có khả năng phân hủy protein liên quan đến việc tạo hình lại chất nền ngoại bào Do đó, MMP góp phần vào việc phân hủy collagen, đồng thời ức chế

sự tổng hợp hình thành collagen mới Theo nghiên cứu của Hsiao-Pei Tu và cộng sự (2013), Berberine có thể ức chế hoạt động phân hủy của MMPs ngoại bào, và giảm sự suy thoái mô nướu in vivo ở chuột [21]

Tác dụng sinh học của Berberine

1.1.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn của Berberine

Berberine có khả năng gây ức chế sự nhân đôi DNA, phiên mã RNA

và sinh tổng hợp protein trong tế bào vi khuẩn do nó có thể liên kết chặt chẽ với DNA và RNA, làm thay đổi cấu trúc bình thường của chúng [36]

Berberine ức chế hoạt động của enzyme của tế bào vi khuẩn, theo cơ chế berberine có thể ức chế phiên mã mRNA và do đó ức chế enzyme sinh

tổng hợp protein [14]

Nghiên cứu của Jin JL và cộng sự năm 2010 cho thấy berberine có khả năng làm thay đổi nhanh chóng hoạt động trên màng tế bào vi khuẩn Sự giải phóng K+ và Ca2+ từ tế bào vi khuẩn tăng khi tế bào được tiếp xúc với berberine dẫn đến sự thay đổi về hình thái và cấu trúc của tế bào vi khuẩn [24]

1.1.6.2 Hoạt tính kháng nấm của Berberine

Cơ chế tác động và giết chết tế bào nấm Candida albicans của berberin là làm suy giảm chức năng của ty thể, tạo các phản ứng oxy hóa tái hoạt hóa, ảnh hưởng đến con đường toàn vẹn vách tế bào và các yếu tố phiên mã sốc nhiệt HSF [26], [16] từ đó ức chế và tiêu diệt nấm

Hình 1.3 Các con đường tác động của berberine đến Candida albicans

(Nguồn: Dhamgays S, 2014) [16]

1.1.6.3 Hoạt tính diệt virus của Berberine

Berberine nhắm vào các bước khác nhau trong vòng đời của virus và

do đó là một ứng cử viên sáng giá để sử dụng trong các liệu pháp và thuốc

kháng virus mới Các cơ chế tác động của BBr đối với virus:

- BBr làm giảm sự sao chép của virus và nhắm mục tiêu vào các tương tác cụ thể giữa virus và vật chủ của nó

- Berberine xen vào DNA và ức chế tổng hợp DNA và hoạt động của enzyme sao chép ngược Berberine ức chế sự sao chép của herpes simplex virus (HSV), cytomegalovirus ở người (HCMV), virus u nhú ở người (HPV) và virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV) [52]

- Berberine còn có khả năng điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu MEK-ERK, AMPK / mTOR và con đường NF-κB, cần thiết cho sự nhân lên của virus NF-κB là một protein liên kết DNA cần thiết trong quá trình phiên mã các gen khác nhau liên quan đến việc kiểm soát các quá trình tế bào, đặc biệt là các phản ứng viêm và miễn dịch MAPK có liên quan đến việc điều chỉnh các con đường tín hiệu quan trọng của tế bào, chẳng hạn như quá trình apoptosis, biệt hóa, tăng sinh và các phản ứng miễn dịch MAPK đóng một vai trò thiết yếu trong nhiễm trùng và stress tế bào Hơn nữa, chúng được biết là có tác dụng thúc đẩy sự tồn tại và tạo ra các thế hệ virion con Do đó, sự tác động của berberine lên các con đường truyền tín hiệu hiệu MEK-ERK, AMPK / mTOR, NF-κB ảnh hưởng trực tiếp đến sự nhân lên của virus [42], [55]

1.1.6.4 Hoạt tính kháng viêm của Berberine

Cơ chế của các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm của Berberine rất phức tạp, liên quan đến nhiều kinase tế bào và các con đường tín hiệu, chẳng hạn như kinase protein kích hoạt AMP (AMPK), con đường NF- κ B [55]

Hình 1.4 Tóm tắt con đường kháng viêm của Berberine

( Nguồn: Zou, K, 2017 [55]) NF-κB là một protein liên kết DNA cần thiết trong quá trình phiên

mã các gen khác nhau liên quan đến việc kiểm soát các quá trình tế bào, đặc biệt là các phản ứng viêm và miễn dịch

Berberine kích hoạt AMPK, ức chế NF- κ B, ức chế con đường

AP-1 Từ đó, ức chế sự biểu hiện của các cytokines tiền viêm như TNF-α, IL-6, IL-8, IL-13, IFN-γ, IL-β Do đó ức chế quá trình viêm

Một phản ứng viêm sẽ có lợi cho cơ thể nhưng nếu hiện tượng viêm

vượt trội sẽ gây xơ hóa mô tại chỗ và tái cấu trúc mô Hoạt động ức chế viêm sẽ giúp kích thích làm lành vết thương nhanh hơn so với một vết thương viêm nhiễm thông thường Do đó, với hoạt tính kháng viêm, berberine được xem là nhân tố có vai trò tiềm năng trong quá trình lành thương

Nano Berberine

Với những đặc tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và kháng viêm được trình bày ở mục 1.2.2, Berberine thực sự đã thu hút được sự chú ý trong những năm gần đây do có tác dụng dược lý của chúng [34], [49] Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng Berberine bị hạn chế trong sử dụng lâm sàng do ít tan trong nước, khó hấp thu qua ruột và đặc biệt tính sinh khả dụng rất thấp (chỉ khoảng 5%) [49] Hướng nghiên cứu bào chế Berberine thành dạng kích thước nano có thể cải thiện độ tan, tốc

độ hòa tan, từ đó nâng cao sinh khả dụng là hướng đi đang được quan tâm nghiên cứu hiện nay

Nghiên cứu của Wang và cộng sự, 2015 chỉ ra rằng khả năng hòa tan

và tính sinh khả dụng của BBr được tăng cường dưới dạng hạt nano Trong nghiên cứu của Wang cho thấy hoạt tính chống đái tháo đường của Nano BBr vượt trội trên các mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường Các hạt nano này cho thấy khả năng hạ đường huyết và giảm trọng lượng cơ thể vượt trội

so với chỉ dùng BBr, đồng thời nhóm được điều trị bằng Nano BBr có ít tác dụng phụ hơn so với nhóm điều trị BBr ở kích thước phân tử [50]

Việc điều chế BBr dưới kích thước nano nhằm giúp tăng khả năng phân tán của chúng, tạo điều kiện cho cơ thể hấp thụ tốt hoạt chất BBr để phát huy hết tác dụng dược lý của chúng

Thử nghiệm độc tính tế bào là một trong những phương pháp thử nghiệm in vitro đầu tiên được sử dụng để dự đoán độc tính của các chất

trên mô khác nhau [44] Trong nghiên cứu in vitro, các hóa chất như thuốc

có các cơ chế gây độc tế bào khác nhau chẳng hạn như phá hủy màng tế bào, ngăn chặn sự tổng hợp protein Để xác định tế bào chết do những tổn thương này gây ra, cần có các thử nghiệm độc tính tế bào có chi phí hợp lý, đáng tin cậy và có thể lặp lại Những thử nghiệm này dựa trên các chức năng khác nhau của tế bào Một loạt các thử nghiệm độc tính tế bào hiện đang được sử dụng trong lĩnh vực độc chất học và dược lý học Chọn phương pháp thích hợp trong số các thử nghiệm này là quan trọng để thu được kết quả đáng tin cậy Có nhiều cách phân loại khác nhau cho các thử nghiệm này: loại trừ thuốc nhuộm, đo huỳnh quang, đo phát quang và đo màu [11]

Trong đó, thử nghiệm MTT đo các tế bào sống sót thông qua hoạt động ti thể mà không cần mất nhiều thời gian đếm tế bào Đây là cách sử dụng phổ biến nhất để xác định độc tính tế bào của thuốc ở các nồng độ khác nhau, phù hợp với việc thử nghiệm nhiều nồng độ pha loãng của nano BBr trong nghiên cứu hiện tại [46] Thử nghiệm MTT theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009 đo lường khả năng tồn tại của các tế bào thông qua hoạt động trao đổi chất MTT tan trong nước có màu vàng và chuyển hóa nhờ enzyme succinate dehydrogenase trong ti thể của tế bào sống thành formazan không hòa tan màu xanh tím Số lượng tế bào sống tương quan với cường độ màu được xác định bằng phép đo quang trắc sau khi hòa tan formazan trong alcohol [22] MTT được sử dụng trong các thử nghiệm để

đo khả năng sống của các tế bào động vật có vú bám dính đĩa đa giếng và đây là một trong những xét nghiệm ghi nhận độc tính tế bào dễ thực hiện nhất Thử nghiệm MTT đơn giản, đặc trưng và được sử dụng thường xuyên như là một “tiêu chuẩn vàng” để so sánh các thử nghiệm khác trong quá trình phát triển phương pháp đánh giá độc tính tế bào mới [44]

Phân tích NRU (Neutral red uptake) là phương pháp xác định độc tính

dịch chiết khi tiếp xúc với tế bào Cách bố trí thí nghiệm tương tự như phương pháp MTT Phân tích NRU khác phương pháp MTT ở chỗ hoá chất

sử dụng trong phương pháp này là Neutral red Neutral red sẽ đi vào lysosome của tế bào sống nằm trong đó, sau đó Neutral Red trong tế bào sẽ được tiết ra, khi đó chúng ta tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 540nm [22]

MTT có thành phần hoá học là (2,3 – bis (2-methoxy -4- nitro -5- sulfophenyl) -5- ((phenylamino) carbonyl) - 2H - tetrazolium hydroxide) Phương pháp xác định độc tính dịch chiết khi tiếp xúc với tế bào Cách bố trí thí nghiệm tương tự như phương pháp MTT Nguyên tắc hoạt động tương tự MTT, nhưng sản phẩm tạo thành của phương pháp XTT dạng formazan tan trong nước, có sự tương quan giữa số lượng tế bào sống và cường độ màu [22]

Sự di chuyển của tế bào là quá trình cần thiết cho hoạt động sinh lý, bệnh lý chẳng hạn như hình thành và phát triển phôi, sửa chữa mô, hình thành mạch máu cũng như chữa lành vết thương của cơ thể [40] Khi mô bị tổn thương, nguyên bào sợi lập tức di chuyển vào vùng sang thương và tiết

ra chất nền ngoại bào cần thiết để chữa lành vết thương [13]

Trong số các phương pháp nghiên cứu sự di cư tế bào, thử nghiệm vết thương cơ học là phương pháp phổ biến nhất do tính đơn giản, hiệu quả chi phí và có thể quan sát tế bào trong quá trình di cư Vết thương cơ học

có thể được phân loại thành các thử nghiệm rạch và dập Một đường rạch được thực hiện bằng nhiều dụng cụ như pippet, kim, tăm bông… Thử nghiệm đường rạch thường được sử dụng để nghiên cứu sự lành thương liên quan tế bào bị tổn thương [40] Đây là phương pháp đơn giản và tiết

kiệm chi phí nhất để nghiên cứu tế bào di chuyển in vitro, không yêu cầu

thiết bị chuyên dụng và có thể được tiến hành trong hầu hết các phòng thí

nghiệm có khả năng nuôi cấy tế bào Thử nghiệm mô phỏng một số mức độ

di chuyển của các tế bào trong cơ thể sống Kết quả có thể quan sát bằng kính hiển vi và cho phép phân tích những tín hiệu nội bào [28]

Nguyên bào sợi có thể tu sửa nền ngoại bào để hình thành và co lại vết sẹo Bell (1979) tận dụng khả năng hòa tan của collagen loại 1 trong các dung dịch có tính axit để tạo ra gel collagen dưới tác dụng của nguyên bào sợi Cho đến nay, thử nghiệm co gel collagen vẫn còn được sử dụng để nghiên cứu sự co gel bởi tế bào Thử nghiệm co gel collagen được thực hiện bằng cách cấy tế bào vào collagen type I để tạo gel hình đĩa Collagen type I dễ trùng hợp để tạo mạng lưới sợi mô phỏng khung collagen trong

mô liên kết Trong thời gian nuôi cấy (vài giờ đến vài ngày), tế bào tạo lực

co lên sợi collagen làm giảm đường kính của đĩa collagen Mức độ đĩa collagen co lại được định lượng bằng cách đo đường kính hoặc diện tích của đĩa collagen Phép đo lường những thay đổi kích thước của đĩa gel collagen này cho phép đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ và mức độ co lại gel [35], [47]

hGF là thành phần chính của mô liên kết nướu, có vai trò quan trọng trong quá trình đóng vết thương và chức năng co gel collagen làm vết sẹo nhỏ hơn vết thương ban đầu Sự co lại của gel collagen dưới tác dụng của hGF có thể được sử dụng như là mô hình co rút vết thương in vitro [39]

Nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu của Peng Zhang và cộng sự thực hiện năm 2019 nhằm xác định khả năng lành thương của Nano BBr cũng như giải thích cơ chế lành thương trên chuột bị mắc bệnh đái tháo đường Kết quả nghiên cứu cho thấy Nano BBr có thể thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương ở chuột mắc bệnh tiểu đường Nghiên cứu cơ chế phân tử cho thấy Nano BBr có thể ức

chế sự biểu hiện của NF-κB, TNF-a và IL-6 bằng cách kích hoạt Sirt1, nhưng làm tăng sự biểu hiện của F VEGF, CD 31 và SMA có lợi cho việc chữa lành vết thương [37]

Theo nghiên cứu của Rui Zhou vào năm 2021 tiến hành nghiên cứu về khả năng lành thương nhanh của Nano BBr cho thấy việc điều trị bằng Nano BBr đã làm tăng đáng kể khả năng lành thương tăng cường tổng hợp chất nền ngoại bào Phân tích sâu hơn cho thấy Nano BBr đã kích hoạt TRxR1 ức chế tín hiệu JNK do đó protein này làm giảm thioredoxin cũng như các chất nền khác, và đóng vai trò trong chuyển hóa selen và bảo vệ chống lại stress oxy hóa và quá trình chết tế bào, từ đó thúc đẩy tăng sinh tế bào Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) bị giảm, yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β1 (TGF-β1) tăng và các chất ức chế mô của MMP 1 (TIMP1), giúp đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương [11]

Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của Đỗ Thanh Sinh và cộng sự thực hiện vào năm 2020 điều chế Nano BBr nhằm ức chế tăng sinh tế bào ung thư có kết quả vật liệu Nano BBr đã được chế tạo thành công với cấu trúc tinh thể bằng phương pháp nghiền quay, được kiểm định qua các phân tích DLS, FE-SEM, TEM và XRD Kết quả thu được hạt Nano BBr có kích thước trong khoảng 60 nm ở hàm lượng 1% tween 80 và 4% BBr Bằng phương pháp đông khô, mẫu Nano BBr được đưa về dạng bột vẫn giữ được kích thước nanomet và hàm lượng BBr có trong bột sau khi đông khô là 60,36% Vật liệu Nano BBr cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 và gan Hep G2 với giá trị IC50 lần lượt là 11,11 ± 0,48 µg/mL và 43,45 ± 3,39 µg/mL [5]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào nguyên bào sợi nướu người (hGF) ở thế hệ P3 (tế bào nuôi cấy đến lần chuyền thứ 3) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm kỹ nghệ

mô và vật liệu Y sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Nano Berberine được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu Triển khai – Khu công nghệ cao, Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Nguyên bào sợi nướu ở thế hệ thứ 3, đạt mật độ bám trải 80-90%

bề mặt chai nuôi, và không nhiễm vi sinh

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Tế bào bị tạp nhiễm vi sinh vật

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm kỹ nghệ mô và vật liệu Y sinh, Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ sinh học động vật, Khoa Sinh học - Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1/2022 đến 4/2022

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thử nghiệm in vitro có nhóm chứng

2.2.2 Cỡ mẫu

Mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần ở 3 dòng hGF

Thử nghiệm độc tính tế bào: có 7 thử nghiệm (chứng âm – môi

truòng nuôi cấy có dinh dưỡng đầy đủ, chứng dương – Môi trường nuôi cấy có bổ sung DMSO 20% gây độc tế bào và 5 nồng độ pha loãng Nano Berberine với các nồng độ 1/1, 1/10, 1/102, 1/103, 1/104), mỗi thử nghiệm tiến hành trên 3 dòng hGF và lăp lại 3 lần (7 thử nghiệm x 3 dòng hGF x 3 lần lặp lại = 63 mẫu)

Thử nghiệm tăng sinh: Có 4 thử nghiệm với 4 môi trường, môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn có dinh dưỡng đầy đủ (CM10); môi trường nuôi cấy cơ bản không có bổ sung dinh dưỡng (F12); môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn có bổ sung Nano BBr với nồng độ không gây độc (B-CM), môi trường nuôi cấy cơ bản có bổ sung Nano BBr với nồng độ không gây độc B-F12), mỗi thử nghiệm tiến hành trên 3 dòng hGF và lặp lại 3 lần ( 4 thử nghiệm x 3 dòng hGF x 3 lần lặp lại = 36 mẫu)

Thử nghiệm di cư: Có 3 thử nghiệm với 3 môi trường, môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn có dinh dưỡng đầy đủ (CM10), môi trường nuôi cấy cơ bản không có bổ sung dinh dưỡng (F12); môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn có

bổ sung Nano BBr với nồng độ không gây độc (B-CM), mỗi thử nghiệm tiến hành trên 3 dòng hGF và lặp lại 3 lần (3 thử nghiệm x 3 dòng hGF x 3 lần lặp lại = 27 mẫu)

Thử nghiệm co gel collagen: Có 3 thử nghiệm và môi trường thử nghiệm giống phần thử nghiệm di cư (3 thử nghiệm x 3 dòng hGF x 3 lần lặp lại = 27 mẫu)

Tổng số mẫu nghiên cứu: 63 + 36 + 27 + 27 = 153 mẫu

2.2.3 Biến nghiên cứu:

Tương ứng với các mục tiêu, các biến nghiên cứu bao gồm:

- Thử nghiệm độc tính tế bào:

Biến phụ thuộc: Bao gồm mật độ quang, tỉ suất tăng trưởng tương đối RGR%, mức độc và không gây độc

Biến độc lập: Các nghiệm thức

- Thử nghiệm tăng sinh:

Biến phụ thuộc: Số lượng tế bào

Biến độc lập: Các nghiệm thức, ngày đánh giá 1, 3, 5, 7, 9

- Thử nghiệm di cư:

Biến phụ thuộc: Phần trăm diện tích vùng vô bào

Biến độc lập: Các nghiệm thức, ngày giờ đánh giá (0 giờ, 24 giờ)

- Thử nghiệm co gel collagen:

Biến phụ thuộc: Diện tích mẫu trên đĩa collagen

Biến độc lập: Các nghiệm thức, ngày đánh giá (1, 7)

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

Chuẩn bị tế bào: Nguyên bào sợi nướu người hGF được cung cấp

bởi Phòng thí nghiệm kỹ nghệ mô và vật liệu Y sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Tế bào sau khi được giải đông sẽ được huyền phù trong môi trường dinh dưỡng DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và trải vào các flask

độ ẩm 95% Môi trường được thay mỗi 3 ngày Tiến hành cấy chuyền khi đạt số lượng tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi

2.2.4.1 Thử nghiệm MTT đánh giá độc tính của Berberine lên

nguyên bào sợi nướu người hGF

Thử nghiệm MTT là một phương pháp đo enzym trong ty thể, phản ứng thể hiện mức độ biến dưỡng của tế bào đang hoạt động qua đó phản ánh được số lượng tế bào sống sót sau thử nghiệm

Sự sống của tế bào sẽ được đánh giá bằng thí nghiệm MTT (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một loại tetrazole có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan màu xanh tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một

(3-loại enzym reductase trong ti thể

Tiêu chí đánh giá:

Đánh giá hình thái tế bào sau khi ủ trong dung dịch nano Berberine 24 giờ được ghi nhận bằng hình ảnh dưới kính hiển vi đảo ngược CKX53 (Olympus, Nhật) cùng phần mềm ghi nhận hình ảnh Cellsens và so sánh qua các nhóm chứng Số lượng tế bào sống được tỷ

lệ thuận với việc sản xuất formazan hòa tan với isopropanol, có thể được

đo bằng quang phổ ở bước sóng 570 nm Mức độ gây độc tế bào được xác định dựa vào tỉ lệ tăng trưởng tương đối (RGR)

Từ kết quả thử nghiệm độc tính tế bào, chúng ta lựa chọn được nồng độ pha loãng Nano Berberine 2% phù hợp cho những thử nghiệm tiếp theo

Chuẩn bị tế bào:

• Xác định số lượng tế bào trong Flask nuôi cấy:

- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ trong bình Flask

- Rửa với 3 ml dung dịch PBS, 2 lần

- Tách tế bào trong bình Flask với 1 ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ ở 37°C khoảng 1 phút

- Khi 80-90% tế bào trong bình Flask co tròn và tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy

- Bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy có huyết thanh để bất hoạt Trypsin

- Huyền phù đều dịch trong bình Flask

- Cho hết dung dịch vào ống falcon 15 ml, đem quay ly tâm với tốc độ

3000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào

- Bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy có huyết thanh, huyền phù đều

- Hút 20 μl dịch huyền phù có tế bào vào eppendorf 1,5 ml, pha loãng với trypan blue 0,4% theo tỉ lệ 1:1 và trộn đều

- Phủ buồng đếm với lamelle và cho 1 giọt huyền phù tế bào vào buồng đếm bằng cách nhỏ sát vị trí tiếp xúc giữa lamelle và buồng đếm Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt huyền phù sẽ tràn đầy buồng đếm

- Đếm số lượng tế bào tại 4 vùng đếm ở 4 góc (vùng 1, 2, 3, 4) Đếm tất cả các tế bào to, tròn, sáng rõ Đếm theo nguyên tắc cạnh trên - bên phải: nếu các tế bào nằm ở vạch ranh giới, đếm các tế bào nằm ở phía trên và bên phải của ô đang đếm, không đếm những tế bào nằm

ở phía dưới, bên trái

- Đếm 3 mẫu rồi lấy số lượng tế bào trung bình là A, xây dựng công thức tính mật độ tế bào

- Suy ra mật độ tế bào trung bình trong 1 ml dung dịch môi trường:

o (A/4) × 104 × độ pha loãng (tế bào/ml)

- Vì khi nhuộm với trypan blue theo tỉ lệ 1:1 nên độ pha loãng là 2 Vậy lượng tế bào trong 1 ml huyền phù (N) là: N = (A/4) × 104× 2 (tế bào/ml)

• Cấy chuyền từ bình Flask sang đĩa 96 giếng

Lấy ra một lượng huyền phù chứa 103 tế bào cấy vào mỗi giếng Cho

100 µl môi trường nuôi cấy có huyết thanh và nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2

cho đến khi đạt độ bao phủ > 80%

Thực hiện tổng cộng 7 nghiệm thức (NT):

- NT1: Nano Berberine 2% chưa pha loãng

- NT2: Nano Berberine pha loãng 1/10

- NT3: Nano Berberine pha loãng 1/102

- NT4: Nano Berberine pha loãng 1/103

- NT5: Nano Berberine pha loãng 1/104

- NT6: Môi trường nuôi cấy có huyết thanh (chứng âm)

- NT7: Môi trường nuôi cấy có huyết thanh bổ sung dung dịch DMSO 20% (chứng dương) đã được chứng minh gây độc cho hGF [10]

Tiến hành thử nghiệm

- Loại bỏ môi trường trong các giếng tế bào

- Cho vào mỗi giếng tế bào 100 µl dịch chiết đã chuẩn bị ở từng nghiệm thức, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 24 giờ

- Loại bỏ dịch chiết trong các giếng

- Cho vào mỗi giếng 10 µl dung dịch MTT (5 mg/ml) và 90 µl môi trường nuôi cấy có huyết thanh, sau đó đem đĩa ủ 4 giờ ở 370C, 5% CO2

- Quan sát, ghi nhận các tinh thể formazan màu xanh tím được tạo

ra

- Hút bỏ toàn bộ dung dịch trong các giếng

- Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch DMSO/Ethenol (tỉ lệ 1:1), huyền phù đều trong mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan tạo thành dung dịch đồng nhất và tiến hành đo độ hấp thụ quang học OD ở bước sóng 570 nm bằng máy đo

- Mỗi thử nghiệm được lặp lại 03 lần

2.2.4.2 Phương pháp đánh giá tác động của Nano Berberine lên sự tăng sinh và di cư của nguyên bào sợi nướu người hGF

Tăng sinh: Nguyên bào sợi nướu người hGF được nuôi trong đĩa 96 giếng với nồng độ ban đầu 103 tế bào/ giếng và được nuôi cấy trong tủ nuôi

ở điều kiện 370C, 5% CO2, độ ẩm 95% Môi trường nuôi cấy có bổ sung Nano Berberine với nồng độ được xác định an toàn ở nội dung 1 Số lượng

tế bào được kiểm tra bằng cách đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu sau

1, 3, 5, 7 và 9 ngày nuôi cấy Nano Berberine được pha trong môi trường tiêu chuẩn và môi trường không có huyết thanh để đánh giá tác động thực

sự của chất này lên sự tăng sinh của tế bào

Di cư: Để đánh giá tác động của Nano Berberine đối với sự di cư

hGF, thử nghiệm Scratch-test ( thử nghiệm lành thương in vitro) được thực

hiện Tế bào được nuôi trong đĩa 6 giếng (105 tế bào /ml, 2ml / giếng) Sau

24 giờ, sử dụng một pipet 200 μl vô trùng đầu nhọn để tạo một đường xước thẳng trên lớp đơn lớp của các ô hợp lưu ở phía dưới của đĩa nuôi cấy (mô phỏng vết thương) Các mảnh vụn đã được rửa sạch bằng PBS Các tế bào sau đó được nuôi trong môi trường có bổ sung nano berberine với nồng độ tối ưu được khảo sát ở nội dung 1, ở điều kiện nuôi cấy ở 370C, 5% CO2

Tế bào lớp đơn Tạo đường

rạch

Pipettetip

Ghi nhận tại 0 giờ, 24 giờ

Hình 2.2.Mô hình thử nghiệm Scratch-test (thử nghiệm lành thương in

vitro)

Tại thời điểm 0 giờ và 24 giờ các vùng “vết thương” được quan sát

và ghi lại bằng kính hiển vi quang học

Sự di cư của tế bào được đánh giá bằng máy chụp ảnh từ năm trường được chọn ngẫu nhiên (x100) mỗi giếng để đếm số lượng ô đã di chuyển và diện tích bám dính bằng phần mềm ImageAnalysis J 1.45S

2.2.4.3 Phương pháp đánh giá tác động của Nano Berberine lên đặc tính co gel collagen của nguyên bào sợi nướu người hGF

Sự co vết thương có thể được mô hình hóa in vitro bằng cách cấy nguyên bào sợi vào gel collagen dạng sợi trong môi trường có huyết thanh Collagen sẽ co lại trong vòng 1-2 ngày Sự co collagen làm co rút vết thương và thu hẹp vết sẹo Phương pháp nuôi cấy tế bào trong gel collagen

là trùng hợp mô phỏng môi trường sinh lý phù hợp hơn môi trường nuôi cấy tế bào bình thường vì tế bào có thể nhận những tín hiệu tương tự với điều kiện in vivo[13] Trong nghiên cứu của chúng tôi, nano berberine sẽ được đưa vào giếng có hGF và gel collagen, từ đó đánh giá ảnh hưởng của nano berberine lên khả năng co gel collagen của nguyên bào sợi nướu thông qua việc đo diện tích gel collagen

Chuẩn bị tế bào

Xác định số lượng tế bào trong Flask nuôi cấy (tương tự mục 2.3.2.2 của thử nghiệm đánh giá độc tính của nano berberine lên hGF) Xác định lượng huyền phù tế bào cần lấy để đảm bảo mật độ 104 tế bào/gel cho thử

nghiệm co gel collagen

Chuẩn bị nghiệm thức:

Thực hiện 6 nghiệm thức với 18 giếng:

- Nồng độ Nano BBr không gây độc được khảo sát trong nội dung 1

- Môi trường nuôi cấy có FBS 10% (nhóm chứng dương)

- Môi trường nuôi cấy không huyết thanh (nhóm chứng âm)

- Gel collagen không chứa hGF

Tiến hành thử nghiệm [39]

- Trộn 50 µl huyền phù tế bào vào 100 µl dung dịch collagen type I đảm bảo mật độ 104 tế bào/gel rồi cho vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng

- Đem ủ đĩa ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ

- Tách gel ra khỏi thành giếng bằng cách chạy nhẹ đầu tip pipet 100 μl dọc theo các mép gel cẩn thận để không bị cắt hoặc rách gel, đảm bảo không có gel bám vào đĩa

- Hút hết dung dịch ra khỏi giếng

- Bổ sung vào giếng 100 µl môi trường nuôi cấy có huyết thanh

- Đem ủ đĩa ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ

- Hút hết môi trường nuôi cấy và bổ sung 100 μl nghiệm thức đã chuẩn bị

- Đem ủ đĩa ở 37oC, 5% CO2 trong 30 phút

- Hút hết nghiệm thức và bổ sung 100 µl môi trường có huyết thanh

- Đem ủ đĩa ở 37oC, 5% CO2

- Thay môi trường 3 ngày/lần

- Chụp hình các giếng ở mốc 0 giờ và 7 ngày

Tiêu chuẩn đánh giá

Các mẫu gel collagen ở từng nghiệm thức được chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số có vị trí cố định Diện tích bề mặt gel được xác định từ hình ảnh thu được với phần mềm ImageJ (Viện y tế Quốc gia Mỹ) Để tiêu chuẩn hóa cho việc so sánh, mức độ co gel được xác định bằng phần trăm của diện tích gel ở thời điểm sau 7 ngày so với diện tích gel ban đầu (0 giờ) trong mỗi giếng Phần trăm diện tích gel collagen sau 7 ngày càng nhỏ thì khả năng co gel collagen càng cao, điều này đồng nghĩa với Nano berberine

có ảnh hưởng làm tăng co gel collagen Nếu phần trăm diện tích gel collagen của Nano berberine sau 7 ngày tương đương với nhóm chứng dương thì Nano berberine không ảnh hưởng co gel collagen [35]

2.2.5 Phương tiện và dụng cụ thu thập dữ liệu nghiên cứu

2.2.5.1 Chuẩn bị dụng cụ nghiên cứu

Hình 2.3 Một số dụng cụ được sử dụng

A: Bercher 250 mL; B: Micropipet (100 µl, 1000µl); C: Đĩa Transwell; D: Bình nuôi tế bào 25 cm2

2.2.5.2 Thiết bị nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất Quốc gia

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco Singapore

Kính hiển vi đảo ngược Olympus Nhật

Máy đọc đĩa 96 giếng Biochrom Anh

Hình 2.4 Một số thiết bị thường dùng

A: Máy ly tâm; B: Tủ an toàn sinh học cấp 2; C: Kính hiển vi đảo ngược;

D – Tủ ủ ấm

2.2.5.3 Vật liệu hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy tế bào hGF có huyết thanh 100 ml

Penicillin-streptomycin 100X (Sigma, Mỹ) 1 ml Môi trường nuôi tế bào hGF không có huyết thanh 100 ml

Penicillin-streptomycin 100X (Sigma, Mỹ) 1 ml Dung dịch Phosphate buffered saline (PBS) 1X 100 ml