Nghiên cứu thực nghiệm đặc tính sinh học và che phủ khuyết hổng xương của màng tim heo vô bào trên xương hàm thỏ bị tổn thương tại đại học quốc gia tp hồ chí minh, năm 2021 2022

Tái tạo xương có hướng dẫn là kỹ thuật sử dụng vật liệu thay thế xương để ghép vào vùng khuyết hổng, tạo thành một “khung sườn” để các tế bào mô xương đến hoạt động tạo ra xương mới, tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ RĂNG HÀM MẶT

Người hướng dẫn khoa học:

TS.BS LÊ NGUYÊN LÂM

Cần Thơ – Năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận văn

Bùi Cúc

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp

đỡ rất tận tình của các Thầy, Cô, anh chị, gia đình, bạn bè và các nhà khoa học

trong nghành

Trước hết, tôi xin cám ơn chân thành đến:

- Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

- Ban Chủ nhiệm khoa Răng Hàm Mặt – Trường Đại học Y Dược Cần

Thơ

- Phòng Đào Tạo Sau Đại học – Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

- Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc

Gia Thành phố Hồ Chí Minh

Đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình

học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Nguyên Lâm đã luôn ủng hộ,

hướng dẫn tận tình và cung cấp tư liệu cho tôi hoàn tất luận văn này

Xin cảm ơn quý đồng nghiệp, các bạn học viên đã giúp đỡ, động viên tôi

cố gắng học tập và hoàn thành luận văn

Tôi cũng không bao giờ quên sự giúp đỡ, chia sẻ của gia đình, bạn bè,

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình

học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

Xin gửi lòng biết ơn và chân thành nhất

Tác giả luận văn

Bùi Cúc

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các thuật từ

Danh mục các hình

Danh mục các bảng

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sống hàm sau mất răng 3

1.2 Các kỹ thuật điều trị thiếu xương trong cấy ghép implant 4

1.3 Đặc điểm của màng ngăn sử dụng trong ghép xương 6

1.4 Đại cương về màng tim vô bào 9

1.5 Một số nghiên cứu về màng ngăn và ứng dụng của màng tim vô bào 12 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 17

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 19

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 19

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 19

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu 19

2.2.5 Phương tiện và kỹ thuật thu thập số liệu 22

2.2.6 Biện pháp hạn chế sai số 32

2.2.7 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu 32

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Đặc tính sinh học của màng tim vô bào 33

3.2 Đánh giá sự xâm nhập tế bào nguyên bào sợi qua màng tim vô bào 40

3.3 Kết quả ghép màng tim vô bào trên mô hình thỏ 41

Chương 4 BÀN LUẬN 53

4.1 Đặc tính sinh học của màng tim vô bào 53

4.2 Đánh giá sự xâm nhập tế bào nguyên bào sợi qua màng tim vô bào 60

4.3 Kết quả ghép màng tim vô bào trên mô hình thỏ 62

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle

Medium/Nutrient Mixture F12 Ham

dPP Decellularized Porcine Pericardium

ePTFE Expanded Polytetrafluoroethylene FDA Food and Drug Administration

GTR Guided Tissue Regeneration

hGF Human Gingival Fibroblasts

TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh

DANH SÁCH CÁC THUẬT TỪ

Basal Cell Culture medium Môi trường nuôi cơ bản

Computerized Tomography Cắt lớp vi tính

Decellularized Porcine Pericardium Màng tim heo vô bào

Food and Drug Administration Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Guided Bone Regeneration Tái tạo xương có hướng dẫn

Guided Tissue Regeneration Tái tạo mô có hướng dẫn

Human Gingival Fibroblasts Nguyên bào sợi nướu người

Optical Density Mức độ quang học

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Thay đổi sống hàm sau mất răng 3

Hình 1.2 Kỹ thuật ghép xương khối 5

Hình 1.3 Kỹ thuật tái tạo xương có hướng dẫn 6

Hình 1.4 Kỹ thuật tái tạo xương theo chiều ngang có hướng dẫn 6

Hình 1.5 Màng tự tiêu từ collagen gân bò Miomend 7

Hình 1.6 Kỹ thuật tái tạo xương theo chiều ngang có hướng dẫn 8

Hình 1.7 Cấu tạo màng ngoài tim 10

Hình 2.1 Đối tượng thử nghiệm 18

Hình 2.2 Nguyên bào sợi nướu người 24

Hình 2.3 Mô hình nuôi trên đĩa transwell well 29

Hình 3.1 Hình dạng tế bào nguyên bào sợi nướu sau 1 ngày thử nghiệm độc tính (độ phóng đại 100 lần) 33

Hình 3.2 Kết quả nhuộm Giemsa tế bào hGF sau khi 1 ngày thử nghiệm độc tính (độ phóng đại 100 lần) 35

Hình 3.4 Mảnh ghép màng tim được ghép dưới da lưng chuột 37

Hình 3.5 Hình nhuộm mô học HE mảnh ghép sau 1 tháng ghép dưới da lưng chuột 40

Hình 3.6 Giếng transwell 40

Hình 3.7 Hình nhuộm Giemsa tế bào nằm ở lớp dưới màng đáy của giếng transwell (độ phóng đại 100 lần) 41

Hình 3.8 Quy trình ghép màng tim vô bào vào cơ thể thỏ 42

Hình 3.9 Vết thương thỏ sau 3 tháng 42

Hình 3.10 Kết quả chụp X-quang sau khi ghép 1 tháng của nhóm thỏ thử nghiệm trong 1 tháng 43

Hình 3.11 Kết quả chụp X-quang sau khi ghép 3 tháng của nhóm thỏ thử

nghiệm trong 3 tháng 45

Hình 3.12 Kết quả chụp CT xương hàm thỏ sau khi ghép xương và màng 46

Hình 3.13 Kết quả CT xương hàm thỏ 1 tháng khi ghép xương và màng 47

Hình 3.14 Kết quả CT xương hàm thỏ 3 tháng sau ghép xương và màng 48

Hình 3.15 Kết quả nhuộm HE xương hàm phủ bằng màng thương mại của 3 con thỏ sau khi ghép 1 tháng 51

Hình 3.16 Kết quả nhuộm HE xương hàm phủ bằng màng thương mại của 3 con thỏ sau khi ghép 3 tháng 51

Hình 3.17 Kết quả nhuộm HE xương hàm phủ bằng màng tim vô bào dPP của 3 con thỏ sau khi ghép 1 tháng 52

Hình 3.18 Kết quả nhuộm HE xương hàm phủ bằng màng tim vô bào dPP của 3 con thỏ sau khi ghép 3 tháng 52

Hình 4.1 Khử tế bào mô gan 54

Hình 4.2 Màng CoPios 56

Hình 4.3 Cơ chế phương pháp MTT 59

Hình 4.4 Mô hình đánh giá sự di cư tế bào trên mô hình đĩa transwell 62

Hình 4.5 Mô hình sử dụng vật liệu hình trụ để nghiên cứu tái tạo xương trên vùng xương sọ của thỏ 63

Hình 4.6 Cấu tạo xương sọ thỏ 63

Hình 4.7 Mô hình thỏ khuyết hổng xương hàm của Lundgen 64

Hình 4.8 Cấu trúc xốp xương Neobone với các lỗ lớn thông nhau 66

Hình 4.9 Kết quả nhuộm HE cấu trúc màng thương mại và dPP sử dụng trong nghiên cứu 67

Hình 4.10 Sự hình thành xương trên thỏ sau 1 tháng ghép xương và màng dPP (x40) 68

Hình 4.11 Sự hình thành xương trên thỏ sau 3 tháng ghép xương và màng dPP 69

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số ứng dụng màng ngoài tim trong vật liêụ y tế 15

Bảng 1.2 Ứng dụng màng ngoài tim trong y học 16

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn độc tính (định tính) theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 20

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá độc tính trong cơ thể chuột 26

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ngăn chặn tế bào in vitro 28

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm của thí nghiệm hỗ trợ lành xương trên thỏ 31

Bảng 3.1 Giá trị OD trung bình thu được bằng phương pháp MTT 36

Bảng 3.2 Kết quả tỉ lệ % khối lượng của màng tim vô bào dPP qua các mốc thời gian 37

Bảng 3.3 Kết quả quan sát tổng thể sức khỏe chuột nhóm thí nghiệm TN và nhóm đối chứng ĐC sau 1 tháng ghép dưới da chuột 38

Bảng 3.4 Kết quả nhuộm mô học mảnh ghép dưới da lưng chuột của cả 2 nhóm thí nghiệm TN và nhóm đối chứng 39

Bảng 3.5 Kết quả quan sát sức khỏe thỏ sau khi ghép màng 3 tháng (n=6) 48

Bảng 3.6 Tóm tắt kết quả nhuộm mô học hốc xương trên thỏ 50

Bảng 4.1 Tóm tắt kết quả thí nghiệm của Lundgren 65

Bảng 4.2 Tổng kết kết quả thu nhận sau 3 tháng ghép màng bằng các phương pháp chụp X-quang, CT và nhuộm mô học 70

Bảng 4.3 Tổng kết kết quả thu được về màng tim heo vô bào dPP 71

MỞ ĐẦU

Hiện nay mất răng vẫn là tình trạng tổn thương thường gặp trong thực hành lâm sàng nha khoa Mất răng làm suy giảm mạnh chức năng và thẩm mỹ, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống cá nhân cả về hoạt động sinh lý và tâm

lý, qua đó trực tiếp hoặc gián tiếp gây ra gánh nặng kinh tế xã hội [2], [51] Những bước ngoặc trong việc ứng dụng khoa học công nghệ vật liệu vào thực hành nha khoa ở những thập niên gần đây đã mở ra nhiều lựa chọn hiệu quả cho việc phục hồi răng đã mất, trong đó nổi bật là sự khẳng định ưu thế của implant nha khoa so với cách phục hình truyền thống, đưa implant trở thành tiêu chuẩn vàng mới trong điều trị mất răng [51] Quá trình tiêu xương xảy ra từ ngay sau thời điểm mất răng và kéo dài trong nhiều năm sau đó, dẫn đến việc mô xương

bị giảm thể tích đáng kể nếu mất răng lâu ngày Có nhiều phương pháp để khắc phục tình trạng khuyết hổng xương như tách chẻ xương, ghép nguyên khối, nâng xoang, tái tạo xương có hướng dẫn, v.v Mỗi phương pháp đều có chỉ định, chống chỉ định cụ thể và ưu khuyết điểm đặc thù, trong đó tái tạo xương có hướng dẫn (GBR) có chỉ định khá rộng rãi do không bị giới hạn về thể tích mô xương cần lấy và có thể linh động phối hợp với các phương pháp khác [1], [51]

Tái tạo xương có hướng dẫn là kỹ thuật sử dụng vật liệu thay thế xương

để ghép vào vùng khuyết hổng, tạo thành một “khung sườn” để các tế bào mô xương đến hoạt động tạo ra xương mới, trong khi đó khối vật liệu sẽ dần dần

bị tiêu đi, nhường chỗ cho mô xương mới tạo Để tạo ra và duy trì được không gian và điều kiện tối ưu cho hoạt động tái tạo xương của tế bào, kỹ thuật tái tạo xương có hướng dẫn thường đòi hỏi sử dụng một màng ngăn [8], [51] Mục tiêu của màng ngăn là để hạn chế sự xâm nhập của các nguyên bào sợi vào

“khung sườn”, không để chúng lấn chiếm không gian hoạt động của các tế bào

muốn Một màng ngăn lý tưởng thường phải có tính tương hợp sinh học, có hiệu quả trong việc ngăn chặn nguyên bào sợi, và có thể tự tiêu nhưng phải tồn tại đủ lâu để duy trì hợp lý thời gian cho việc tạo đủ xương mới [1]

Màng ngoài tim (màng tim) là túi chứa đầy chất lỏng bao quanh tim, có chức năng cố định và bảo vệ tim Màng tim có bản chất là collagen đặc và là sản phẩm bỏ trong quá trình sản xuất thịt gia súc nên có số lượng dồi dào Từ nhiều thập kỉ nay, màng tim được dùng rộng rãi trong lĩnh vực tim mạch như làm van tim, miếng vá mạch máu, v.v , khẳng định tính tương hợp sinh học với cơ thể người Trên thế giới đã có nhiều nhóm nghiên cứu thu nhận thành công tấm collagen từ màng tim bằng phương pháp khử tế bào, ứng dụng thử

nghiệm in vivo trong việc ghép mô xương [12], [23], [24] Tại Việt Nam cũng

đã có những nghiên cứu tiên phong in vitro và in vivo trong lĩnh vực tạo tấm collagen từ màng tim cho thấy triển vọng trong việc ứng dụng vào lĩnh vực tái tạo xương có hướng dẫn [37], [50] Chất lượng thành phẩm sau cùng của tấm collagen phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật và quy trình khử tế bào nói riêng và các khâu khác trong quá trình sản xuất nói chung Do đó, tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu thực nghiệm đặc tính sinh học và che phủ khuyết hổng xương của màng tim heo vô bào trên xương hàm thỏ bị tổn thương tại Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2021 - 2022” với các mục tiêu sau:

1 Khảo sát đặc tính tương thích sinh học của màng tim vô bào tại Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh năm 2021 - 2022

2 Đánh giá sự ngăn chặn nguyên bào sợi và sự tăng sinh tế bào tủy xương trên màng tim vô bào tại Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh năm 2021

- 2022

3 Đánh giá khả năng che phủ khuyết hổng xương của màng tim vô bào trên xương hàm thỏ tại Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh năm 2021 - 2022

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sống hàm sau mất răng

Ở vùng răng trước, vách xương vỏ mặt ngoài của các răng mỏng hơn nhiều so với vách mặt trong tương ứng Có nhiều nguyên nhân có khả năng gây tiêu một phần hay toàn bộ vách xương mặt ngoài như: bệnh nha chu, sự mọc răng, điều trị chỉnh nha, hoạt động cận chức năng, chấn thương, gãy dọc chân răng, phẫu thuật cắt chóp, bờ mão không khít sát, mài sửa soạn răng xâm phạm khoảng sinh học, nhổ răng Sau nhổ răng, chấn thương hay bệnh lí, vách xương ngoài thường là nơi đầu tiên bị tiêu hay tái cấu trúc và hiện tượng này xảy ra ở mức độ rộng hơn so với ở mặt trong [2], [51]

Ở vùng tiền hàm, sau khi mất răng, xương ổ được nhanh chóng tái cấu trúc, thậm chí khi mỏm xương ổ không hề bị tổn thương do can thiệp Trong 1 năm đầu tiên sau khi mất răng, thể tích xương ổ giảm khoảng 25%, và trong 3 năm đầu tiên sau khi mất răng, bề rộng xương ổ giảm từ 40% - 60% [2], [51]

Hình 1.1 Thay đổi sống hàm sau mất răng

(Nguồn: Cấy ghép nha khoa, 2016 [2])

Ở vùng răng sau, tỉ lệ tiêu xương thường nhiều hơn ở vùng răng trước, nhưng do sóng hàm ban đầu rộng hơn gấp đôi nên ngay cả khi 50% xương bị tiêu thì có thể vẫn còn đủ xương để đặt được một implant đường kính 4mm

Vì những lí do chủ yếu kể trên mà việc tái tạo và cải thiện tình trạng xương trở nên bắt buộc trong nhiều trường hợp cấy ghép implant nếu muốn đạt được một kết quả điều trị sau cùng thỏa đáng và ổn định lâu dài [2], [51]

Có nhiều kỹ thuật nhằm cải thiện thể tích xương ở vùng cấy ghép implant

đã được phát minh và áp dụng trên lâm sàng Sau nhiều năm nghiên cứu và thực hành, ngày nay hầu hết các bác sĩ đều công nhận việc áp dụng thường quy màng ngăn trong thủ thuật tái tạo xương, gọi là kỹ thuật tái tạo xương có hướng dẫn (GBR) Những tính chất và tác dụng đặc biệt của màng ngăn góp phần nâng cao tính ứng dụng lâm sàng của thủ thuật, cũng như làm cho thủ thuật tái tạo xương có tiên lượng ổn định hơn [51]

1.2 Các kỹ thuật điều trị thiếu xương trong cấy ghép implant

1.2.1 Ghép xương khối tự thân

Là kỹ thuật ghép xương tự thân với các mảnh xương được lấy từ vùng trong miệng hoặc ngoài miệng Vị trí mảnh ghép được lấy tùy thuộc vào kích thước vùng thiếu hỏng

Đối với các thiếu hỏng xương có diện tích nhỏ hoặc trung bình thường

áp dụng vị trí lấy xương trong miệng Đối với các thiếu hỏng xương có diện tích lớn thường áp dụng các vị trí lấy xương ngoài miệng [1], [8]

- Vị trí lấy xương trong miệng:

+ Lấy mảnh ghép từ vùng hai bên ụ cằm:

+ Lấy mảnh ghép từ vùng góc hàm

- Vị trí lấy xương ngoài miệng:

+ Xương mào chậu + Xương đỉnh

Hình 1.2 Kỹ thuật ghép xương khối

(Nguồn: Vertical and Horizontal Ridge Augmentation, 2017 [51])

1.2.2 Kỹ thuật tái tạo xương có hướng dẫn (GBR)

GBR, thường kết hợp với vật liệu ghép, là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong thực hành nha khoa hàng ngày nhằm làm tăng thể tích xương Một bất lợi trong thủ thuật ghép xương là, vì mô xương là mô có tốc độ tăng trưởng khá chậm nên khoảng không gian của vật liệu ghép dành cho sự hình thành xương dễ dàng bị xâm lấn nhanh chóng bởi các nguyên bào sợi và các tế bào biểu mô để tạo thành khối mô liên kết trước khi xương có đủ thời gian hình thành Vì vậy, nguyên lí sinh học đằng sau GBR là sử dụng một màng ngăn để loại trừ các tế bào không mong muốn ra khỏi vùng lành thương nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào của mô xương xâm nhập vào mảnh ghép

và có đủ thời gian phát huy hoạt động tái cấu trúc xương của chúng Có hai loại màng ngăn là màng không tiêu và màng tự tiêu được sử dụng trong kỹ thuật GBR [1], [14], [51]

Hình 1.3 Kỹ thuật tái tạo xương có hướng dẫn

(Nguồn: Vertical and Horizontal Ridge Augmentation, 2017 [51])

1.3 Đặc điểm của màng ngăn sử dụng trong ghép xương

Có nhiều loại vật liệu được sử dụng để làm màng ngăn trong phẫu thuật tái tạo xương Một màng ngăn lí tưởng có các đặc tính sau [1], [25], [27]:

- Tương hợp sinh học với mô cứng và mô mềm

- Có khả ngăn ngăn chặn các tế bào hay sự xâm lấn của những mô không mong muốn

- Có khả năng duy trì được khoảng trống dành cho sự tạo xương

- Dễ dàng trong thao tác điều chỉnh và đặt vào vùng ghép

- Giá cả hợp lí

Vạt niêm mạc màng xương

Hình 1.4 Kỹ thuật tái tạo xương theo chiều ngang có hướng dẫn

(Nguồn: Vertical and Horizontal Ridge Augmentation, 2017 [51])

Màng ngăn

Misch cho rằng một màng ngăn lí tưởng thì nên là loại tự tiêu (không cần phải thực hiện phẫu thuật thứ phát để lấy màng ngăn ra) nhưng phải tồn tại đủ lâu để sự tạo xương xảy ra như mong đợi Ngoài ra nó phải có khả năng làm giảm sự di động của mô, và có thể làm tăng bề dày của mô mềm khi cần thiết Mặc dù có nhiều loại màng ngăn thể hiện được gần đủ các đặc tính trên, nhưng không có một loại màng ngăn nhất định nào là lí tưởng Tuy vậy, có thể đạt được một kết quả ghép xương như mong đợi nếu có đủ các yếu tố then chốt hiện diện [8]

Garg đã đưa ra một bảng so sánh các loại màng ngăn phổ biến trên thị trường dựa trên tổng hợp y văn và trên kinh nghiệm lâm sàng của chính ông [21]

Đặc điểm số màng ngăn đang được sử dụng trên thị trường:

- Màng Collagen từ gân bò (BioMend Extend): che phủ cửa sổ xương trong phẫu thuật nâng xoang hàm, khuyết hổng nhỏ hoặc trung bình trên sóng

hàm (cố định bằng nút ghim) có hay không có implant cấy ghép đồng thời

Màng có thời gian tiêu khoảng 4 – 6 tháng với giá thành trung bình

Hình 1.5 Màng tự tiêu từ collagen gân bò Miomend

- Màng e-PTFE (Gore-Tex): một trong những màng ngăn kinh điển, không tiêu và có giá thành cao Tuy nhiên, hiện có nhiều sản phẩm hiệu quả

Hình 1.6 Kỹ thuật tái tạo xương theo chiều ngang có hướng dẫn

(Nguồn: Vertical and Horizontal Ridge Augmentation, 2017 [51])

- Màng từ da đồng loại đông khô không tế bào (AlloDerm): là lựa chọn tốt nhất nếu không thể đóng kín mô mềm hay có nguy cơ hở đường rạch Rách lớn màng xoang hàm Khuyết hổng 3 - 4 thành xương Khuyết hổng nhỏ trên sóng hàm có hay không có cắm implant đồng thời

Màng có thời gian tiêu khoảng 4 tháng và có giá thành trung bình

- Màng PLA lỏng (Atrisorb): dùng cho phẫu thuật nha chu kết hợp ghép

xương Vật liệu kết nối tốt với mặt gốc răng

Màng có thời gian tiêu khoảng 4 tháng và có giá thành trung bình

Màng e - PTFE

Màng e - PTFE Sườn titanium

- Màng PLA/PGA (Resolut XT): sử dụng cho các khuyết hổng nhỏ trên sóng hàm có hay không có cắm implant đồng thời Thời gian tiêu khoảng 3 – 4 tháng với giá thành trung bình và hiệu quả nâng đỡ thấp

- Màng Titanium: Tăng sóng hàm theo chiều ngang hay dọc cùng với vật liệu ghép dạng hạt và nút ghim cố định cho những khuyết hổng nhỏ hay lớn Tuy nhiên đòi hỏi nhiều kinh nghiệm vì có nguy cơ trong việc xử lý vật liệu và biến chứng khe hở mô mềm

Màng không tiêu nên cần phẫu thuật thì 2 Dễ lộ màng nên cần nhiều kinh nghiệm

- Calcium sulfate y tế (Capset): sử dụng cho các khuyết hổng 3-5 thành xương Phẫu thuật nha chu kết hợp ghép xương Vật liệu kết nối tốt với mặt gốc răng Thời gian tiêu khoảng 2 tháng

- Xương đông khô khử khoáng dạng miếng mỏng (Lambone): Tăng sóng hàm theo chiều ngang hay dọc cùng với vật liệu ghép dạng hạt và nút ghim cố định cho những khuyết hổng nhỏ hay lớn

1.4 Đại cương về màng tim vô bào

1.4.1 Định nghĩa màng tim

Màng tim là lớp màng mỏng bọc quanh tim, chứa đầy chất lỏng bao quanh tim Màng ngoài tim đóng vai trò là lớp bảo vệ bên ngoài của tim, một

cơ quan quan trọng của hệ tuần hoàn và hệ tim mạch

1.4.2 Cấu tạo màng tim

Về cấu trúc theo lớp, màng ngoài tim được chia thành 3 lớp: sợi màng ngoài tim, màng ngoài tim thành và màng ngoài tim [43]

- Ngoại tâm mạc sợi (Fibrous pericardium): là lớp bên ngoài cùng của màng tim, được cấu tạo bởi lớp protein dày đặc liên kết chặt chẽ với nhau, với mạch máu và khoang ngực Nó giúp tim cố định trong khoang ngực

- Màng ngoài tim thanh mạc (serous pericardium): phần tiếp giáp với ngoại tâm mạc sợi và cơ tim, bao gồm 2 lớp: lá thành, lá tạng

a Lá thành (parietal layer): là lớp giữa ngoại tâm mạc sợi và lá tạng Lớp này liên tục với màng ngoài tim dạng sợi và tạo thành một lớp cách nhiệt cho tim

Hình 1.7 Cấu tạo màng ngoài tim

(Nguồn: Atlas giải phẫu người, 2012 [3])

b Lá tạng (visceral layer): phủ ngoài lớp thành tim Lá tạng bao gồm lớp mesothelium và lớp collagen bên dưới để phân cách với thành tim Giữa 2 lớp

lá thành và lá tạng là khoang màng ngoài tim Khoang này thường chứa một lượng dịch nhỏ gọi là dịch màng ngoài tim (pericardial fluid) làm lớp đệm cho tim, giúp giảm ma sát giữa các lớp khi tim hoạt động

Về thành phần protein, màng ngoài tim bao gồm lượng lớn những protein cấu trúc và chức năng như collagen, elastin… Những thành phần này bao gồm collagen type I, III, VI, XII, fibronection, fibrillin, laminin, tenascin C Trong

đó, thành phần chính là collagen type I, những protein được cấu trúc thành dạng sợi, bó sợi và phiến Sợi collagen và elastin liên kết chặt chẽ với những thành phần xung quanh tạo thành glycosaminoglycan và proteoglycan

1.4.3 Một số phương pháp khử tế bào

Phương pháp hóa học

Quá trình khử hóa tế bào có thể đạt được bằng cách sử dụng chất hóa học

để phá vỡ tế bào và các thành phần ADN của chúng Các hóa chất được dùng phổ biến nhất bao gồm các chất tẩy rửa như Triton X-100, natri deoxycholate (SDC) và sodium dodecyl sulfate (SDS) SDS cho hiệu quả lớn nhất trong việc loại bỏ các tế bào và nhân của chúng khỏi tạng Các chất acid, bazơ, các dung dịch thẩm thấu, và cồn cũng có thể được sử dụng Những loại acid và bazơ khác nhau sẽ xúc tác cho quá trình phân hủy của các phân tử khác nhau Ví dụ, acid acetic phá hủy collagen - một trong những protein cấu trúc phong phú nhất trong ECM Tuy nhiên, nó không ảnh hưởng tới glycosaminoglycan sulfat (GAG) - phân tử sinh học có nhiều trong các mô liên kết Do đó, việc lựa chọn các acid hoặc bazơ sử dụng cho khử hóa tế bào phụ thuộc nhiều vào các cơ quan đích Dung dịch thẩm thấu có thể được sử dụng thay thế để ly giải tế bào thông qua hiệu ứng thẩm thấu Cồn với khả năng khử nước sẽ khiến tế bào phân hủy

Phương pháp vật lý

Các nhân tố vật lý thường được sử dụng trong khử hóa tế bào là nhiệt độ, lực cơ học, áp suất và kỹ thuật NTIRE (non-thermal irreversible electroporation) Những phương pháp liên quan đến sự thay đổi nhiệt độ như làm đông/ rã đông có thể được sử dụng để ly giải hiệu quả các tế bào liên kết với tạng Tuy nhiên, các thành phần trong tế bào như phân tử sinh học vẫn duy trì Những phân tử này cần phải được loại bỏ bằng các kỹ thuật khác như rửa bằng chất tẩy rửa Lực cơ học và áp suất có thể sử dụng cùng với các tác nhân hóa học hoặc sinh học khác để hỗ trợ cho việc loại bỏ các tế bào Lực cơ học chủ yếu bào mòn lớp tế bào trên Việc sử dụng của áp lực thủy tĩnh có thể có hiệu quả hơn so với việc sử dụng các hóa chất hoặc các enzyme

1.4.4 Qui trình tạo màng tim heo vô bào

Màng tim lợn được thu nhận và khử tế bào nhằm tạo ra giá thể nuôi cấy

tế bào gốc Quy trình khử tế bào sử dụng hóa chất: 10 mM Tris-HCl trong 8 giờ, 0,1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) trong 12 giờ, rửa bằng PBS (Phophate Buffer Saline) trong 3 giờ Màng tim lợn vô bào được làm khô và khử trùng chiếu xạ ở liều 25 kGy

Đặc điểm màng tim lợn vô bào đạt tiêu chuẩn sạch tế bào: không còn vết nhân tế bào trong tiêu bản nhuộm H&E, lượng DNA tồn dư dưới 50 ng/mg Độ bền kéo và biến dạng của giá thể màng tim lợn vô bào không khác biệt so với màng tim lợn tươi

1.5 Một số nghiên cứu về màng ngăn và ứng dụng của màng tim vô bào

1.5.1 Nghiên cứu về màng ngăn sinh học

Ý tưởng về việc sử dụng một màng ngăn trong thủ thuật tái tạo khuyết hổng xương đã được phôi thai từ những nghiên cứu thực nghiệm của nhóm Bassett và Boyne vào đầu những năm 1960 Những tác giả này đã thực hiện thử nghiệm tính hiệu quả của màng lọc cellulose acetate vi rỗ (microporous)

(Millipore) trong quá trình lành thương của phiến xương vỏ ở xương dài và trong việc tái cấu trúc xương mặt Tuy nhiên, những nghiên cứu này đã không

có ảnh hưởng gì đến quá trình phát triển của những kỹ thuật mới nhằm tái tạo những khiếm khuyết tại chỗ ở xương hàm vì người ta đã không nhận thấy tiềm năng ứng dụng của loại màng này [5]

Đến đầu những năm 1980, Nyman và cộng sự lần đầu tiên xuất bản những nghiên cứu về kỹ thuật tái tạo mô có hướng dẫn (GTR – Guided Tissue Regeneration) trong điều trị bệnh nha chu Những tác giả này sử dụng màng ePTFE (expanded polytetrafluoroethylene) như là một rào cản vật lí ngăn chặn

mô và các tế bào sợi xâm nhập và can thiệp vào quá trình lành thương của vùng xương ghép Những thành công trong kết quả điều trị của kỹ thuật GTR đã thu hút sự quan tâm của những bác sĩ cấy ghép nha khoa để giải quyết đòi hỏi cấp thiết của việc cải thiện xương Chẳng mấy chốc màng ePTFE đã được ứng dụng trong ngành cấy ghép nha khoa Sau đó, vật liệu lấp đầy được sử dụng kết hợp với màng ePTFE để khắc phục sự sụp của màng làm giảm thể tích xương được tái tạo Tuy nhiên, người ta cũng nhanh chóng nhận ra những nhược điểm của màng ePTFE và rằng cần phải có những cải tiến và thay thế thích hợp để kỹ thuật này có tính thân thiện hơn với bác sĩ lẫn bệnh nhân [51]

Vào những năm 1990, hội nghị của những chuyên gia trong lĩnh vực cấy ghép xương đã liên tục diễn ra để thảo luận về GBR Màng ngăn sinh học tự tiêu (màng polymeric và màng collagen) cũng được giới thiệu và dần dần được thử nghiệm và sử dụng trên lâm sàng [51]

Ngày nay, sau 20 năm phát triển, màng collagen được sử dụng thường quy cho kỹ thuật GBR trong thực hành hàng ngày Một tổng quan hệ thống do Aghaloo và Moy thực hiện chỉ ra rằng những implant được cấy ghép cùng với GBR có tỉ lệ tồn tại cao Cùng với phẫu thuật nâng xoang hàm, GBR là một

trong hai phương pháp phẫu thuật hiếm hoi được ghi nhận dữ liệu một cách đầy

đủ và khoa học

1.5.2 Ứng dụng của màng tim vô bào

Cấu trúc màng ngoài tim lợn có các sợi collagen sắp xếp đa định hướng (định hướng đa chiều) tạo thành một mạng lưới đan xen chặt chẽ với nhau, với

số lượng lớn các sợi định hướng chéo, khiến các sợi collagen không chỉ xếp chồng lên nhau mà còn tạo ra các cấu trúc lượn sóng hay các bó sợi xoắn chặt

Sự sắp xếp đa định hướng của màng ngoài tim sợi lợn làm tăng tính ổn định của cấu trúc trong trường hợp chịu các áp lực căng phồng, sự đa chiều trong cách sắp xếp của các sợi collagen giúp đảm bảo tính ổn định của màng ngoài tim trong các trường hợp này [7], [18]

Màng ngoài tim lợn vô bào là một mô dị loại đã được khử tế bào để loại

bỏ khả năng gây đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên quá trình khử tế bào có thể tác động đến cấu trúc khung nền ngoại bào, làm biến đổi tính chất cơ lý cũng như

độ bền cơ học của mô, gây ra sự phân hủy nhanh chóng sau khi cấy ghép vào trong cơ thể Do đó, khoảng 60% ECM bị suy thoái và phân hủy từ một đến ba

tháng sau khi cấy ghép in vivo [6]

Nhiều nghiên cứu xử lý loại tế bào trong mô bằng cách sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp nhiều loại phương pháp khác nhau như vật lí [39] (lực cơ học, rung cơ học, đông lạnh), hóa học (kiềm và acid [30], [16], [20], sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-200 [41], sodium deoxycholate, Triton X-100 [22], tri(n-butyl)phosphate [54], CHAPS [15], dung dịch ưu trương, nhược trương) hoặc enzyme (trypsin) hướng tới tạo các mảnh ghép dị loại vô bào ứng dụng trong y sinh học đã được thực hiện [10], [13], [42], [44] Màng ngoài tim bò, lợn và người được xử lý khử tế bào bằng dung dịch SDS với các nồng độ khác nhau đã được sử dụng để nghiên cứu, chế tạo các sản phẩm ứng dụng trong tim mạch (mảnh vá mạch máu, van tim sinh học) và kĩ nghệ mô tim [45], [46], [47]

Tiêu chuẩn vô bào: mô màng ngoài tim lợn phải sạch tế bào, đồng thời giữ nguyên được cấu trúc khung nền ngoại bào của chúng

Bảng 1.1: Một số ứng dụng màng ngoài tim trong vật liêụ y tế

-Peripatch®

Implantable surgical

tissue -TutoMesh®

Neovasc, Maverick Biosciences PTY Limited, Tutogen medical GmbH, RTI Biologics, Med&Care, Novomedics Sửa chữa màng -Lyolem ®r All BP National tissue Bank Màng ngoài tim là một mô sinh học được sử dụng rộng rãi như là một vật liệu sinh học cho các ứng dụng kỹ nghệ mô, bao gồm cả việc tạo ra một loạt các sản phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên ứng dụng trong sửa chữa và thay thế mô như các mảnh vá mạch máu dùng trong các phẫu thuật mạch máu, các bản vá tim, van tim sinh học dùng trong phẫu thuật tim [11], [9], [34], [49], các bản vá cho ổ bụng [31], bản vá sinh học dùng trong sửa chữa khiếm khuyết thành âm đạo [29]…

Ứng dụng lâm sàng đầu tiên của màng tim trong vật liệu sinh học vào năm 1971 Màng tim được sử dụng làm mảnh vá van tim, ca ghép được thực hiện bởi Ionescu Hiện nay, nhiều loại màng tim được chấp nhận bởi FDA để ứng dụng trong nhiều liệu pháp y học tái tạo

Bảng 1.2 Ứng dụng màng ngoài tim trong y học

Ứng dụng Sản phẩm màng tim

Phẫu thuật mắt Màng ngoài tim Lyolemb, Tutopatch,

OcugaurdKhiếm khuyết xương và nha

Tạo hình ngực Màng ngoài timTutomesh

Đặt van tim Màng ngoài tim CardioCel

Miếng vá mạch máu Màng ngoài tim Vascu-Guard

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Màng tim vô bào được sản xuất từ màng tim heo

- Màng tim vô bào thương mại XenoGide, Hàn Quốc

- Xương thương mại Neobone, Bồ Đào Nha

- 06 con chuột thực nghiệm

- 06 con thỏ thực nghiệm

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Màng tim vô bào: được sản xuất từ màng tim heo tại phòng thí nghiệm Vật liệu sinh học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh

- Màng tim vô bào thương mại: Màng tim vô bào: XenoGide, hãng NIBEC(Hàn Quốc) đã được cấp phép sử dụng và lưu thông trên thị trường

- Xương thương mại Neobone, Bồ Đào Nha

- Chuột thực nghiệm: Chuột bạch Mus musculus var Albino được chọn

là các con chuột khỏe mạnh, không mang các bệnh truyền nhiễm và có cùng độ tuổi phát triển từ 4 – 6 tuần, cân nặng trung bình từ 30 - 35 gram được nuôi riêng lẻ mỗi con một chuồng trong cùng một điều kiện môi trường và nuôi dưỡng giống nhau

- Thỏ thực nghiệm: Thỏ New Zealand được chọn vào nghiên cứu là các con thỏ không thuần chủng khỏe mạnh, không mang các bệnh truyền nhiễm và

có cùng độ tuổi phát triển từ 6 – 8 tháng, cân nặng trung bình ≥ 2,5 kí lô gram được nuôi riêng lẻ mỗi con một chuồng trong cùng một điều kiện môi trường

và nuôi dưỡng giống nhau

Hình 2.1 Đối tượng thử nghiệm

A: Màng tim vô bào dPP, B: Màng tim thương mại, C: hạt HA,

D: chuột Musmusculus var Albino, E: thỏ Newzealand

B

A

E

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Vật thí nghiệm (chuột, thỏ) trong thời gian nghiên cứu có biểu hiện của các bệnh truyền nhiễm không thể tiếp tục nghiên cứu

- Vật thí nghiệm (chuột, thỏ) chết trong thời gian thí nghiệm mà nguyên nhân không do nhiễm trùng vết mổ hay hoại tử vùng ghép

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Vật liệu sinh học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7/2021 đến tháng 8/2022

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả thực nghiệm mù đôi

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

3 con chuột thực nghiệm, 6 con thỏ thực nghiệm đạt tiêu chuẩn chọn mẫu

và tiêu chuẩn loại trừ

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên các đối tượng nghiên

cứu phù hợp tiêu chuẩn chọn mẫu

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Đặc tính sinh học của màng tim vô bào

- Độc tính của màng tim đối với nguyên bào sợi nướu

+ Định tính: các giếng nuôi cấy được nhuộm Giemsa và soi dưới kính hiển vi để xác định độc tính dựa trên tiêu chí

Số lượng tế bào không thay đổi hình thái được đếm bằng phương pháp thủ công áp dụng buồng đếm dưới kính hiển vi Tỷ lệ tế bào bị ly giải, co tròn hoặc chết được áp dụng công thức:

1 − Số lượng tế bào nhóm thí nghiệm

Số lượng tế bào nhóm đối chứng âmKết quả tham chiếu bảng độc tính tế bào để xác định mức độ độc tính của màng tim vô bào

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn độc tính (định tính) theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 Mức Ý nghĩa Dấu hiệu

0 Không độc Không có tế bào bị ly giải, co tròn, chết

1 Nhẹ Ít hơn 20% tế bào bị ly giải, co tròn

2 Trung bình Ít hơn 50% tế bào bị ly giải, co tròn

3 Khá Ít hơn 70% tế bào bị ly giải, co tròn

4 Nghiêm trọng Gần như toàn bộ tế bào bị ly giải, co tròn

+ Định lượng (phương pháp MTT assay): MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) là chất thường được dùng để đánh giá tỉ lệ sống của tế bào Trong tế bào sống, MTT sẽ được chuyển hóa thành dạng tinh thể là formazan Tinh thể được hòa tan và đo giá trị quang (optical density, OD) ở bước sóng 590 nm Công thức tính tỉ lệ sống của tế bào như sau:

RGR (%) = (OD590 TN/OD590 ĐC âm) x100%

Giá trị RGR lớn hơn 70% là không độc, dưới 70% là độc

- Tỷ lệ khối lượng còn lại sau khi phân hủy của màng vô bào trong điều

kiện in vitro: là cân khối lượng màng ban đầu và màng tim được ngâm vào

dung dịch PBS (phophate buffer saline) ở các mốc thời gian 1, 4, 8, 12 tuần

- Độc tính in vivo trong cơ thể chuột: ghép màng dPP dưới da lưng chuột

và đánh giá bằng cách quan sát sức khỏe chuột và nhuộm HE màng dPP sau khi cấy 1 tháng

+ Quan sát sức khoẻ: chuột được đánh giá suốt thời gian 1 tháng sau ghép

• Bình thường: chuột hoạt động bình thường, vết mổ không sưng, nóng, rỉ dịch

• Bất thường: chuột ít hoạt động, kém ăn, ngủ nhiều, vết mổ có biểu hiện sưng, nóng hoặc rỉ dịch

+ Nhuộm HE: phẫu thuật lấy màng tại vị trí ghép và đánh giá các biến

• Sự hình thành ổ viêm: có sự tụ tập của các tế bào viêm hình thành

ổ viêm hay không

2.2.4.2 Đánh giá sự xâm nhập tế bào nguyên bào sợi qua màng tim

vô bào

- Khả năng ngăn chặn nguyên bào sợi: màng tim vô bào dPP được sử dụng để phủ lên màng đáy của giếng transwell Tế bào nguyên bào sợi nướu được cấy lên màng tim vô bào dPP Sự xâm nhập tế bào nguyên bào sợi nướu qua màng tim vô bào dPP xuống mặt dưới của lớp màng đáy được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Giemsa Quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá:

+ Sự tồn tại của tế bào ở mặt dưới màng đáy

2.2.4.3 Kết quả ghép màng tim vô bào trên mô hình thỏ

Khuyết hổng được tạo trên xương hàm trên của thỏ Khuyết hổng sau đó được ghép bằng xương Neobone và phủ màng tim vô bào dPP Các phương pháp đánh giá như sau:

- Đánh giá X quang: chụp X quang vị trí ghép và che phủ bằng màng tại các thời điểm trước ghép, sau ghép 1, 2, 3 tháng và so sánh kết quả

- Đánh giá CT: chụp CT vị trí ghép và che phủ bằng màng tại các thời điểm trước ghép, sau ghép 1, 2, 3 tháng và so sánh kết quả

- Đánh giá về mô học: vùng xương sau sẽ được lấy nhuộm HE và soi dưới kính hiển vi ở các thời điểm 1 tháng và 3 tháng để thu kết quả:

• Không lành xương: Không có sự tạo thành xương mới quanh

• Một phần: xuất hiện sự xâm nhập mô tuỷ, sự tạo xương xuất hiện quanh các hạt xương ghép

• Hoàn toàn: Sự khoáng hoá diễn ra gần như hoàn toàn, các bè xương liên kết với nhau

+ Hình ảnh mô sợi: đánh giá mức độ xâm nhập của mô sợi

+ Hình ảnh viêm: đánh giá sự xuất hiện và số lượng các tế bào viêm

2.2.5 Phương tiện và kỹ thuật thu thập số liệu

2.2.5.1 Phương tiện nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu

- Dung dịch muối đẳng trương Phophate Buffer Saline (PBS)

- Thuốc gây mê Zoletyl và Xylezine

- Môi trường nuôi tế bào Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12 Ham (DMEM/F12)

- Hóa chất DMSO (dimethyl sulfoxide)

Phương tiện nghiên cứu

- Bộ dụng cụ thí nghiệm: ống nghiệm, ống nhỏ giọt, kẹp, giếng

- Bộ dụng cụ phẫu thuật: dao, kẹp mang kim, kẹp phẫu tích, chỉ khâu,…

- Chai nuôi tế bào flask 25 cm2 vô trùng

- Giếng transwell dùng cho đĩa 4 giếng

- Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II Naurie

- Tủ nuôi tế bào để tạo điều kiện 37oC, 5% CO2

- Máy đọc mẫu ELISA reader đo OD đĩa 96 giếng

- Kính hiển vi đảo ngược có kết nối camera

- Hệ thống nuôi chuột lọc khí tuần hoàn

2.2.5.2 Phương pháp thu thập số liệu

Thực nghiệm tiến hành với 3 mục tiêu với 5 thực nghiệm được tiến hành độc lập và song song nhau

Mục tiêu 1: Khảo sát đặc tính sinh học của màng tim vô bào: khả năng

phân hủy của màng tim vô bào trong môi trường in vitro, đánh giá độc tính của màng tim vô bào in vitro, in vivo

Thực nghiệm 1: Đánh giá khả năng phân hủy màng tim vô bào trong

môi trường in vitro

Mục tiêu: đánh giá hiện tượng tự phân hủy của mảnh ghép trong dung

dịch muối sinh lý

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành với 12 mảnh ghép ở 4 mốc thời gian, mỗi mốc thời gian tiến hành đánh giá 3 mảnh ghép Mảnh ghép được ngâm trong dung dịch sinh lý ở 37oC liên tục trong 1 hoặc 4 hoặc 8 hoặc 12 tuần, mỗi mốc thời gian tiến hành với 3 mảnh ghép Sau khi đạt tới mốc thời gian, mảnh ghép được cân lại khối lượng Tính tỉ lệ khối lượng mảnh ghép ở mốc thời gian so với ban đầu để xác định % còn lại ở từng mốc thời gian

Thao tác

- Mảnh ghép dPP 5x5 mm2 được ngâm trong ống ly tâm 50 ml chứa 10ml dung dịch PBS (phosphate buffer saline) (12 mảng/12 ống) Ống ly tâm được

ủ ở 37oC liên tục trong thời gian thí nghiệm

- Sau các mốc thời gian 1, 4, 8, 12 tuần, lấy 3 mảnh ghép ra, đông khô, cân khối lượng các mảnh ghép Công thức tính như sau:

Trong đó mT là khối lượng ở 1 mốc thời gian cố định (đơn vị mg), mO là khối lượng ban đầu (đơn vị mg)

Thực nghiệm 2: Đánh giá độc tính màng tim vô bào dPP trong môi

trường in vitro

Mục tiêu: Đánh giá tác động của màng tim vô bào dPP lên tỉ lệ sống của

tế bào nguyên bào sợi nướu theo tiêu chuẩn ISO 10993-5

Hình 2.2 Nguyên bào sợi nướu người

A: Chai nuôi tế bào flask T25 dùng để nuôi hF, B: tế bào hF chụp dưới kính hiển vi (x200)

Bố trí thí nghiệm:

Độc tính đối với tế bào in vitro được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn ISO

10993-5 theo phương pháp dịch chiết Thí nghiệm được chia thành 3 nhóm: nhóm đối chứng âm, nhóm đối chứng dương, nhóm thí nghiệm như bên dưới

- Nhóm đối chứng (ĐC) âm: tế bào nuôi trong môi trường nuôi cơ bản bCC (6 giếng)

- Đối chứng (ĐC) dương: tế bào nuôi trong môi trường nuôi cơ bản bCC được bổ sung với 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) (6 giếng)

A

B

- Nhóm thí nghiệm (TN): tế bào nuôi trong môi trường dịch chiết (6 giếng) Môi trường dịch chiết là môi trường nuôi cơ bản bCC đã ngâm màng tim vô bào trong 1 ngày ở 37oC

Sau thí nghiệm, sử dụng 3 giếng mỗi nhóm để nhuộm Giemsa, sử dụng

3 giếng mỗi nhóm thực hiện MTT

trong đó nhóm ĐC âm 6 giếng, TN 6 giếng và ĐC dương 6 giếng

Chuẩn bị dịch chiết: ngâm màng dPP trong môi trường nuôi cơ bản bCC

ở 37oC trong 24 giờ Sau 24 giờ, loại bỏ màng ra khỏi môi trường, môi trường

còn lại là môi trường dịch chiết

- Ngày 2: thay hết môi trường trong các giếng tế bào bằng môi trường từng nhóm thí nghiệm Sau đó tế bào hGF được tiếp tục nuôi ở 37oC, 5%CO2 trong

24 giờ

- Ngày 3: loại bỏ môi trường trong tất cả các giếng Tiến hành nhuộm Giemsa đối với 3 giếng mỗi nhóm và tiến hành phương pháp MTT cho 3 giếng

mỗi nhóm

- Thao tác nhuộm Giemsa: sử dụng bộ kit nhuộm Giemsa và thực hiện

theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đánh giá hình dạng và ly giải tế bào

- Thao tác phương pháp MTT: MTT diphenyltetrazolium bromide) là chất thường được dùng để đánh giá tỉ lệ sống của tế bào Trong tế bào sống, MTT sẽ được chuyển hóa thành dạng tinh thể là formazan Tinh thể được hòa tan và đo giá trị quang (optical density, OD) ở

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Phương pháp MTT được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Công thức tính tỉ lệ sống của tế bào như sau:

RGR (%) = (OD590 TN/OD590 ĐC âm) x100%

Tỉ lệ lớn hơn 70% có nghĩa là màng dPP không gây độc với tế bào

Thực nghiệm 3: Đánh giá độc tính màng tim vô bào trong môi trường in

vivo trên cơ thể chuột theo tiêu chuẩn ISO 10993-6

Mục tiêu: đánh giá đáp ứng viêm của cơ thể chuột đối với màng tim vô

bào khi ghép dưới da chuột giá theo tiêu chuẩn ISO 10993-6

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được tiến hành với 6 con chuột, chia làm 2 nhóm: nhóm đối chứng (chuột được ghép màng tim thương mại dưới da lưng), nhóm thí nghiệm (chuột được ghép màng dPP dưới da lưng)

Trong 4 tuần sau ghép, trong thời gian nuôi tiến hành quan sát sức khỏe chuột tổng quát và tại vị trí ghép Sau 4 tuần, thu nhận mảnh ghép để nhộm mô học HE (haematoxylin/eosin)

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá độc tính trong cơ thể chuột

Nhóm Đối chứng Thí nghiệm

Tính chất

Ghép màng thương mại dưới da lưng chuột Số lượng: 3 mảnh ghép trên 3 con chuột

Ghép màng tim vô bào dPP dưới da lưng chuột Số lượng: 3 mảnh ghép trên 3 con chuột

Thao tác Ghép da và quan sát trong

1 tháng

Ghép da và quan sát trong 1 tháng

Đánh giá

Quan sát hiện tượng viêm trên chuột

Sau 1 tháng, thu màng nhuộm HE

Quan sát hiện tượng viêm trên chuột

Sau 1 tháng, thu màng nhuộm HE

Thao tác: Độc tính cơ thể chuột được đánh giá theo tiêu chuẩn ISO

10993-6

- Thao tác ghép dưới da: Chuột được gây mê bằng zoletyl và xylazin theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi tiêm 5 phút, tiến hành cạo lông vùng lưng chuột và tạo vết cắt trên da lưng Tiếp theo, ghép miếng màng tim vô bào dPP (5x5 mm2) vào dưới da lưng Sau đó khâu miệng vết thương bằng chỉ phẫu thuật tự tiêu 5.0

Chuột được chăm sóc trong điều kiện vô trùng trong vòng 4 tuần Trong

4 tuần, quan sát hiện tượng viêm tại vị trí ghép và hoạt động của chuột Sau 4 tuần, thu mảnh ghép và nhuộm mô học HE để xác định cấu trúc mô học của mảnh ghép

Mục tiêu 2: Khảo sát sự xâm nhập của nguyên bào sợi qua màng tim vô

bào

Thực nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả ngăn chặn sự xâm nhập tế bào của

màng tim vô bào

Mục tiêu: Đánh giá được hiệu quả ngăn chặn sự xâm lấn tế bào nguyên bào sợi nướu qua màng đáy có cấu trúc vi lỗ trong điều kiện in vitro

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ngăn chặn tế bào in vitro

Cấy tế bào hF lên màng đáy của giếng transwell và nuôi tế bào trong 1 ngày

Đánh giá

Sau 1 ngày thu đĩa transwell và nhuộm Giemsa lớp dưới của màng đáy

Sau 1 ngày thu đĩa transwell và nhuộm Giemsa lớp dưới của màng đáy

- Ngày 2: tách tế bào hGF bằng trypsin/EDTA 0.25% và cấy tế bào vào tất

cả các giếng trong cả 2 nhóm với mật độ 1x106 tế bào/giếng Giếng tế bào được nuôi trong môi trường bCC ở 37oC, 5%CO2

- Ngày 3: thu giếng transwell, tiến hành nhuộm lớp đáy của màng vi lỗ để xác nhận sự hiện diện của tế bào