Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA polymerase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt trong nghiên B

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Lê Thanh Hòa

- Trưởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn TS.Lê Thị Kim Xuyến - phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn NCS.Tạ Hoàng Long - Giám đốc trung tâm kiểm nghiêm thuốc thú y trung ương 1 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Em xin cảm ơn sự hỗ chợ kinh phí của đề tài nhánh “Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của 5 chủng virus gia cầm quốc gia”

do PGS.TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dụng danh mục giống virus gia cầm quốc gia” năm 2011 do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì nằm trong “Chương trình công nghệ sinh học Nông nghiệp” của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Em xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng các thầy cô

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tất cả các cô chú, anh chị phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ trong

quá trình tiến hành thí nghiệm cũng như tạo mọi điều kiện để luận văn được

hoàn thiện

Trang 3

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người thân, gia đình và

bạn bè đã luôn khuyến khích, động viên cũng như chia sẻ những khó khăn

với em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình

Học viên

Hán Thị Hương

Trang 4

MỤC LỤC

Lời cảm ơn……….…….i

Mục lục……… iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ……… ….…iv

Danh mục các bảng……… …v

Danh mục các hình……… …vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh 3

1.1.1 Lịch sử và địa dư bệnh 4

1.1.2 Đường xâm nhập, cách lây lan và cơ chế gây bệnh 5

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 6

1.1.4 Bệnh tích 8

1.1.5 Vaccine phòng bệnh 9

1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11

1.2.1 Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt 11

1.2.2 Sự nhân lên của virus 16

1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt Nam 18

CHƯƠNG 2 20

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp tiếp truyền 21

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 22

2.2.3 Kỹ thuật PCR 23

2.2.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 24

2.2.5 Phương pháp giải trình tự 25

Trang 5

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học 26

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả tiếp truyền virus 28

3.2 Kết quả thu nhận chuỗi gen nghiên cứu 30

3.2.1 Kết quả thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase và giải trình tự 30

3.2.2 Kết quả thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) và giải trình tự 32

3.2.3 Kết quả thu nhận chuỗi gen kháng nguyên (UL32) và giải trình tự 35

3.3 Kết quả phân tích, so sánh thành phần gen của các chủng virus dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen UL5 và UL32 39

3.3.1 Kết quả phân tích gen UL5 40

3.3.2 Kết quả phân tích gen UL32 46

3.4 Bàn luận chung 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC……… ……… 63

Trang 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen

IRS short internal repeat vùng lặp ngắn trong

TRS short terminal repeat vùng lặp ngắn cuối

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt trong nghiên

Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) được sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.1 Kết quả tiếp truyền virus cường độc dịch tả vịt trên vịt 27

Bảng 3.2 Danh sách các chủng Dịch tả vịt của Việt Nam và thế giới sử

Bảng 3.3

Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và

tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen UL5

của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN

(Việt Nam) và 07 chủng DTV của thế giới

44

Bảng 3.4

Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và

tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen UL32

của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN

(Việt Nam) và 07 chủng DEV của thế giới

50

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Triệu chứng vịt bị bệnh dịch tả 8

Hình 1.2 Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt 9

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Herpesviruses 11

Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt 12

Hình 1.5 Chu trình nhân lên của Herpesvirus trong tế bào vật chủ 18

Hình 3.1 Triệu chứng và bệnh tích vịt bệnh dịch tả vịt 28

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch

Hình 3.3 Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVCDKN 30

Hình 3.4 Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN 31

Hình 3.6 Trình tự gen UL5 của chủng DTVCDKN 33

Hình 3.7 Trình tự gen UL5 của chủng DTVVXKN 34

Hình 3.9 Trình tự gen UL32 của chủng DTVCĐKN 36

Hình 3.10 Trình tự gen UL32 của chủng DTVVXKN 37

Hình 3.11 Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch

tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5)

42

Hình 3.12 Kết quả so sánh thành phần amino acid của các chủng

dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5)

43

Hình 3.13 Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch

tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen kháng nguyên (UL32)

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch tả vịt (duck plague) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trước hết là loài vịt, ngỗng, ngan, thiên nga, ở hầu hết mọi lứa tuổi từ vài ngày cho đến vài tháng tuổi, thậm chí

ở vịt giống nuôi hàng năm (Wobeser, 1997), gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi trên thế giới cũng như tại Việt Nam

Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) là thành viên của họ

Herpesviridae, có hệ gen là DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb giống như nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác Phân bố thành phần nucleotide

trong hệ gen thiên về G+C (Guanine và Cytosine), chiếm tỷ lệ 64,3%, cao hơn rất nhiều so với các Herpesvirus khác của gia cầm (Gardner và cs., 1993) Mặc

dù cho đến nay, virus gây bệnh dịch tả vịt được phân nhóm vào dưới họ Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002) nhưng do đặc tính sinh học và phân loại học của loại virus này còn gặp nhiều vấn đề, nên hiện nay Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chưa xác định cụ

thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet và cs., 2005; Liu và cs., 2008)

Về cấu trúc phân tử, hệ gen của DEV chia làm hai vùng gen quan trọng hay còn gọi là vùng độc nhất (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) và

US (vùng ngắn), và bao bọc hai đầu của vùng ngắn là hai vùng lặp ký hiệu IRS và TRS Vì hệ gen của virus dịch tả vịt tương đối lớn nên đến nay mới chỉ có một vài hệ gen được giải mã (Wang và cs., 2011), tuy nhiên một số hợp phần gen quan trọng đã được giải mã và phân tích Trong số các gen của hệ gen virus dịch tả vịt, người ta thường sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trước hết là gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hoá cho glycoprotein vỏ hay còn được coi là gen kháng nguyên (Hansen và cs., 2000)

và gen UL5 (Pan và cs., 2008)

Trang 10

Cho đến nay virus dịch tả vịt vẫn diễn biến hết sức phức tạp và gây nhiều ổ dịch ở khắp các địa phương trong cả nước Tuy nhiên, tại Việt Nam lại chưa có một nghiên cứu đầy đủ nào về đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính tương đồng giữa các chủng virus cường độc và các chủng virus vaccine

Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase”

- Đối tượng nghiên cứu:

- Chủng virus cường độc dịch tả vịt do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương cung cấp, được kí hiệu là DTVCDKN

- Chủng virus nhược độc vaccine do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú

y Trung ương cung cấp, được kí hiệu là DTVVXKN

- Mục tiêu của đề tài là: Giải mã các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase

của chủng virus cường độc và nhược độc vaccine tại Việt Nam; phân tích và

so sánh đặc điểm sinh học phân tử với các chủng của thế giới

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh

Dịch tả vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan mạnh của loài

thuỷ cầm do một loại Herpesvirus thuộc họ Herpesvirideae gây ra với đặc

điểm là xuất huyết nội tạng và ỉa chảy nặng nề (Nguyễn Đức Hiền, 1999; Pritchard và cs., 1999)

Dịch tả vịt (duck plague) còn có tên gọi khác như viêm ruột truyền nhiễm ở vịt (duck enteritis), nhiễm herpes loài vịt (anatid herpes) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, rất ít khi xảy ra mãn tính, lây lan nhanh gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trước hết là loài vịt, ngỗng, ngan, thiên nga và hầu hết các loài thuộc bộ

Anseriformes, họ Anatidae, ở hầu hết mọi lứa tuổi từ vài ngày cho đến vài tháng

tuổi, thậm chí ở vịt giống nuôi hàng năm (Wobeser, 1997) Tác nhân gây bệnh là

một loại Herpesvirus, thuộc dưới họ Alphaherpesvirinae, nằm trong họ Herpesviridae

Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) hay anatid herpesvirus 1

(AnHV-1), là thành viên của họ Herpesviridae, trong đó có nhiều loại Herpesvirus gây bệnh trên người, điển hình là Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) Về hình thái và cấu tạo tất cả mọi Herpesvirus đều giống nhau, đều

có lớp vỏ bọc ngoài cùng mẫn cảm với ether và chloroform Herpesvirus là

loại virus DNA, có hệ gen là DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb giống

như nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác Phân bố thành phần

nucleotide trong hệ gen thiên về G+C (Guanine và Cytosine), chiếm tỷ lệ

64,3%, cao hơn rất nhiều so với các Herpesvirus khác của gia cầm, ví dụ như

virus gây bệnh Marek chẳng hạn, hay virus gây bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm (Gardner và cs., 1993)

Trang 12

Virus gây bệnh dịch tả vịt gồm duy nhất một serotype, nhưng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên, một số chủng có độc lực cao, một số có độc lực trung bình và còn lại là các chủng có độc lực thấp (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

Mặc dù cho đến nay, virus gây bệnh dịch tả vịt được phân nhóm vào

dưới họ Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002), nhưng do đặc tính sinh

học và phân loại học của loại virus này còn gặp nhiều vấn đề, nên hiện nay Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chưa

xác định cụ thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet và cs., 2005)

1.1.1 Lịch sử và địa dư bệnh

Bệnh dịch tả vịt xuất hiện từ rất sớm vào năm 1923 tại Hà Lan ở một đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày (Baudet, 1923) khi nghiên cứu về bệnh này không tìm thấy vi khuẩn nhưng đã gây được bệnh cho vịt khỏe bằng nước chiết phủ tạng của vịt ốm sau khi qua nến lọc

thành công Ông kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus (Trần Minh Châu, 1987)

Năm 1930, bệnh xảy ra tại Hà Lan ở một đàn vịt 150 con Năm 1942, dịch lại tái phát ở Hà Lan làm chết 2600 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, cuống mề, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt Lần này, (Boss, 1943) đã phân lập ra virus, cấy truyền 18 đời trên vịt và giữ được chủng virus này Năm 1949, Jansen và Kunst đã đề nghị gọi tên bệnh là dịch tả vịt, tên tiếng anh là duck enteritis hay duck plague và virus gây bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000)

Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt đã được phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm

1970, phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp, Anh Tiếp theo, Bela Toth và Voxapeer công bố bệnh dịch tả vịt ở Đức (Trần Minh Châu, 1980)

Trang 13

Tại Mỹ, bệnh dịch tả vịt cũng được phát hiện năm 1967 và 1984 (Leibovitz và Hwang, 1967 ; Brand và Docherty, 1984; Janson, 1968)

Tại Châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn Độ và tái phát năm 1963 Năm 1968, bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Trung Quốc Năm 1976 - 1977, bệnh đã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại lớn tới 650.000 vịt (Vorapee, 1978)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Cao Bằng vào năm

1963 làm thiệt hại trên 3000 vịt Bệnh tiếp tục lan rộng và có mặt ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước Theo thống kê của OIE (2006): Việt Nam là một trong những nước bị bệnh dịch tả vịt hoành hành dữ dội nhất Năm 1999, bệnh đã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt và năm 2002 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 15.680 Năm 2008, bệnh tả ở vịt đang bùng phát mạnh và lan ra diện rộng ở nhiều địa phương của tỉnh Phú Yên như Tuy An, Tây Hòa, Phú Hòa

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy trong những năm gần đây bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều và trầm trọng hơn ở các nước châu Á, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế và đời sống của người chăn nuôi

1.1.2 Đường xâm nhập, cách lây lan và cơ chế gây bệnh

Trong tự nhiên, đường xâm nhập chủ yếu của virus dịch tả vịt là đường tiêu hoá Vịt bệnh bài xuất căn bệnh theo phân, nước mắt, nước mũi làm ô nhiễm thức ăn nước uống và bệnh lây lan sang vịt khoẻ và các động vật cảm nhiễm khác (Jansen,1964) Bệnh lây lan rất nhanh và mạnh theo phương thức truyền lây gián tiếp nhưng phương thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess và Yuill, 1981)

Trong phòng thí nghiệm có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp

thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi hỗn dịch có chứa virus cường độc dịch tả vịt

Phương thức truyền lây của virus dịch tả vịt:

Trang 14

- Lây qua thức ăn, nước uống bị nhiễm mầm bệnh

- Lây qua đường hô hấp do hít thở

- Lây qua trứng (chủ yếu ở vịt trời) Còn vịt ta do độc lực virus cao nên phôi bị chết trước khi nở

- Vịt trời và ngỗng đều mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Nhưng cơ thể có sức

đề kháng cao nên không bị chết Mầm bệnh có ở trong cơ thể vịt trời tồn tại tới 4 năm Vì vậy nó là nguồn dịch lưu cữu và lây lan khắp nơi do sự di chuyển của nó

- Vịt ta khi khỏi bệnh đều có miễn dịch, nhưng vẫn mang mầm bệnh

Do vậy dễ lây lan sang đàn mới nhập về

Cơ chế sinh bệnh:

Ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất ở gan, lách và óc Tại Việt Nam đã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt bị gây nhiễm nhân tạo: Sau khi gây nhiễm virus 24 giờ, vịt còn đang trong thời kỳ mang bệnh thì virus đã nhân lên, xâm nhập vào máu nhưng số lượng còn ít Đến 48 giờ, khi vịt chảy nước mắt, nước mũi thì virus đã xuất hiện trong các dịch này Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì

tế bào niêm mạc đường tiêu hoá do virus tác động bị huỷ hoại, tróc ra cùng với dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987)

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng

Thời gian nung bệnh đối với bệnh dịch tả vịt là 3 - 4 ngày, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần đầu tiên xảy ra hay đã từng xảy ra đối với đàn vịt Sau khi xuất hiện triệu chứng vịt chết nhanh, đột ngột, tỉ lệ chết cao Ở đàn vịt con bệnh thường bắt đầu bằng những dấu hiệu: Nhiều con

tự nhiên lờ đờ, không thích vận động, đi lại khó khăn, không muốn xuống nước Ở vịt lớn khi lùa ăn một số con rớt lại sau đàn, uể oải, nằm bẹp trên mặt đất, cánh sã, đi lại chậm chạp, không bơi lội theo đàn, chân có dấu hiệu liệt,

Trang 15

thân nhiệt cao Ở đàn vịt đẻ tỉ lệ đẻ giảm, có khi ngừng đẻ hẳn Vịt bệnh thường ủ rũ, bỏ ăn, đứng một chân, đầu rúc vào cánh Vịt rụng lông và trong đàn vịt nhiều con có tiếng kêu khản đặc (do vòm họng bị tổn thương) Vịt thường sưng mi mắt, niêm mạc mắt đỏ Lúc đầu chảy nhiều nước mắt làm ướt

cả vùng lông dưới mi mắt Sau nước mắt đặc lại có màu vàng như mủ đóng đầy khoé mắt và có khi làm 2 mi mắt dính lại với nhau, không mở mắt được, vịt có thể bị mù Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi, lưỡi bị loét (Hình 1.1) Nhiều con đầu sưng to, sờ nắn có cảm giác đầu mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh, hậu môn bẩn, lông dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) Vịt bệnh lông

xù, ỉa chảy, phân vàng xanh nhạt, đôi khi lẫn máu Con vật bỏ ăn nhưng rất khát nước

Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt cũng có một số triệu chứng khác đáng chú ý như: Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh Vịt tì mỏ xuống đất Vịt đực bị

sa dương vật, niêm mạc có những vết loét, có khi phủ lớp màng trắng đục Vịt đẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm Quang Hùng, 2003) Sau khi xuất hiện triệu chứng được 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy rạc, tứ chi liệt, nằm một chỗ,

rũ cánh, thân nhiệt giảm dần rồi chết Vịt đẻ mắc bệnh thì sản lượng giảm từ 30-60%

Trang 16

cổ thuỷ thũng, có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng Mổ khám các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ tim thì thấy ở các cơ quan này đều biểu hiện bệnh tích sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những điểm màu trắng đục, to bằng đầu đinh ghim hoặc to hơn (Hình 1.2) (Trần Kim Anh, 2004) Đường tiêu hoá bị xuất huyết nặng, niêm mạc thực quản cuối lưỡi có màng giả trắng đóng bựa thành mảng, khi gạt lớp bựa trắng ra, phía dưới loét hoặc xuất huyết lấm tấm (Hình 1.2) (Trần Minh Châu 1996)

Các biến đổi bệnh lý cũng thấy ở mắt, mũi, hậu môn, phù nề dưới da vùng ngực, trong xoang bụng có chứa nhiều dịch thẩm xuất Các cơ quan phủ tạng khác đôi khi cũng xuất huyết như màng bao tim, cơ tim, lách, gan, thận

và tuyến tụy Tuy nhiên, ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những đặc trưng

Trang 17

riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết mô và tổn thương bộ máy sinh sản Còn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các lymphoid (Nguyễn Đức Hiền, 2005)

Hình 1.2 Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt

A:Thực quản xuất huyết phủ màng giả ; B: Ruột bị xuất huyết

C: Gan bị xuất huyết ;D: Tim bị xuất huyết

(Nguồn:www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=287&detail=16)

1.1.5 Vaccine phòng bệnh

Biện pháp quan trọng nhất để khống chế dịch bệnh là dùng vaccine tạo miễn dịch cho đàn vịt Vaccine phòng bệnh dịch tả vịt có 2 loại: vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt

- Vaccine nhược độc:

B

Trang 18

Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vaccine Có hai cách để sản xuất vaccine nhược độc, bao gồm: tiếp truyền giống virus trên phôi và nuôi cấy virus trên môi trường

tế bào xơ phôi gà một lớp Cả hai loại vaccine trên đều có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài sau khi tiêm vaccine (9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch) Vaccine sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vaccine được chế biến dưới 2 dạng vaccine tươi và vaccine đông khô

- Vaccine vô hoạt:

Để vô hoạt virus dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC (Beta propiolactore) Tại Việt Nam đã chế thử vaccine vô hoạt như: vaccine dịch tả vịt gan máu glyxin tím, vaccine formol gan Theo OIE, (2000) vaccine vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vaccine nhược độc, hiện nay vaccine vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất

Những vaccine dịch tả vịt hiện đang được lưu hành ở Việt nam:

1 Vaccine dịch tả vịt nhược độc đông khô do phân viện thú y miền trung - Viện thú y sản xuất

2 Vaccine dịch tả vịt nhược độc do Công ty TNHH một thành viên

thuốc thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất

3 Vaccine dịch tả vịt nhược độc do Công ty TNHH một thành viên

thuốc thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất trên

môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp

4 Vaccine dịch tả vịt nhược độc đông khô Nobilis Duck Plague nhập

khẩu từ Hà Lan

5 Vaccine dịch tả vịt đông khô Vaxiduk chủng Jansen nhập khẩu từ Pháp

Trang 19

1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt

Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) hay anatid herpesvirus 1

(AnHV-1), là thành viên của họ Herpesviridae Tuy nhiên do đặc tính sinh học và

phân loại học của loại virus này còn chưa thống nhất, nên Tổ chức phân loại thế giới (ICTV) đã tạm thời xếp virus dịch tả vịt vào nhóm virus chưa xác định

(unclassified), thuộc họ Herpesviridae (Fauquet và cs., 2005) và cho đến nay vẫn

chưa thể xếp virus dịch tả vịt vào một chi nào cụ thể (Wang và cs., 2011)

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Herpesviruses

(Nguồn:www.scribd.com/doc/ /Vectơ-liệu-phap-từ-Herpes-Simplex-Virus-H )

Virus dịch tả vịt có chứa hệ gen là DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb phân bố thành phần nucleotide trong hệ gen thiên về G+C (Guanine và Cytosine),

chiếm tỷ lệ 64,3%, cao hơn rất nhiều so với các Herpesvirus khác của gia cầm

(như virus gây bệnh Marek, hay virus gây bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm (Gardner và cs., 1993) Mặc dù cho đến nay, virus gây bệnh dịch tả vịt được phân

nhóm vào dưới họ Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002)

1.2.1 Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt

Virus dịch tả vịt có kích thước khoảng 160.000bp (Li và cs., 2009; Wu

và cs., 2012), bao gồm hai vùng gen là vùng gen dài (UL) và vùng gen ngắn (US) với tổng số 78 khung đọc mở (ORF)

Trang 20

Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt

Ngoài cùng là các protein vỏ, hệ gen là DNA nằm bên trong capsid; chiều mũi tên chỉ

hướng sao chép của gen (Liu và cs., 2007; Lian và cs., 2010)

Ở hai đầu hệ gen là hai vùng không mã hóa 5’UTR và 3’UTR Vùng không mã hóa 5’UTR có độ dài 5.686 bp, chứa 25 hộp gen TATA, 8 hộp gen CAAT, một hộp gen GC và 8 trình tự poly A; trong khi vùng không mã hóa 3’UTR chứa 3 hộp gen TATA, 13 hộp gen CAAT, 7 hộp gen GC và 4 trình

tự poly A (Wu và cs., 2012) Các cấu trúc này có vai trò trong việc điều hòa quá trình phiên mã (Richard và cs., 2008; Wiley và cs., 2009)

Ở hai đầu của vùng gen US có chứa hai vị trí lặp IRS và TRS, tạo nên cấu trúc hệ gen của DEV là: UL-IRS-US-TRS giống với đặc điểm hệ gen của

các virus thuộc chi Varicellovirus và Iltovirus (Li và cs., 2009) Vùng UL

chứa 65 khung đọc mở, vùng US chứa 11 khung đọc mở, trong khi hai khung đọc mở còn lại nằm tại hai vùng cấu trúc lặp IRS và TRS (Wu và cs., 2012)

Một trong số các hệ gen được giải mã toàn bộ là hệ gen của virus dịch

tả vịt chủng Clone-03 Kết quả phân tích cho thấy nó chứa 67 gen có sự tương

đồng cao với hầu hết các thành viên của họ Alphaherpesvirinae, nhưng lại có

03 gen không giống bất kỳ một Herpesviruses nào (Li và cs., 2009) Trật tự

sắp xếp các gen trong hai vùng gen cũng mang những đặc trưng riêng Các

Trang 21

gen trong vùng gen UL có tính chất bảo tồn, giống với các virus khác thuộc

Alphaherpesvirinae, trong khi sự sắp xếp của các gen trong vùng US lại tương

tự như virus gây bệnh Marek và Herpesviruses ở ngựa (Spatz và cs., 2007; Li

và cs., 2009) Kết quả trên đưa ra phỏng đoán rằng virus dịch tả vịt (DEV)

thuộc về một chi mới trong phân họ Alphaherpesvirinae (Lee và cs., 2007; Li

và UL41 được chứng minh là vùng có nhiều thay đổi và quyết định tính độc lực của virus (Wu và cs., 2012) Các protein sản phẩm của virus dịch tả vịt được chia làm hai nhóm chính: nhóm protein cấu trúc tạo nên vỏ capsid của virus và các protein nền, các protein liên quan đến quá trình sao chép hoặc các protein xúc tác (Wu và cs., 2012) Các sản phẩm gen liên quan đến quá trình trao đổi DNA virus và các protein chức năng có sự tương đồng cao về trình tự

giữa các chủng trong liên họ Alphaherpesvirinae (Li và cs., 2009)

Glycoprotein đóng vai trò quan trọng đối với sự xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ cũng như góp phần quyết định mức độ lây nhiễm của vật chủ (Jarosinski và cs., 2010; Li và cs., 2009; Osterrieder, 1999)

Một số hệ gen của virus dịch tả vịt đã được giải trình tự trong những năm gần đây, bao gồm 3 chủng virus nhược độc vaccine và một chủng cường độc (Wang và cs., 2011) Các tổ hợp gen và protein của từng vùng gen dựa trên phân

tích đối chiếu với tổ hợp gen tương tự của virus Herpes simplex virus type 1

Trang 22

(HSV-1) đã được giải mã và phân tích khá đầy đủ (McGeoch và cs., 1988; Ngân hàng gen số NC001806) Trật tự sắp xếp các gen trong DEV tương tự như trong

HSV-1 và các Herpesvirus khác Bằng phương pháp phân tích phả hệ sử dụng

hợp phần gen có độ dài 25.625 bp chứa 16 khung đọc mở của virus dịch tả vịt, Liu và cs (2008) đã chính thức công bố DEV vẫn thuộc phân họ

Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae, nhưng có xu hướng đứng riêng ra thành một nhóm virus mới, có vẻ gần với các virus thuộc chi Mardivirus (Liu và

cs., 2008; Wu và cs., 2012) Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2011) cũng đã chỉ ra có sự khác nhau rõ rệt về nguồn gốc giữa các chủng của Châu Á và châu

Âu (Wang và cs., 2011)

Trong số các gen của hệ gen virus dịch tả vịt, người ta thường sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trước hết là gen DNA-polymerase (DNA- pol), gen Thymidine kinase (TK), gen UL5 và gen UL32 (Pritchard và cs., 1999; Hansen và cs., 2000)

Gen UL5 chứa một khung đọc mở gồm 2568bp với thành phần hệ gen chứa 29.9% Adenine, 21.65% Cytosine, 20.76% Guanine và 27.65% Thymine,

mã hóa cho việc tổng hợp 855 amino acid UL5 là một trong ba tiểu đơn vị của phức hợp Helicase-primase Các tiểu đơn vị của Helicase - primase gồm UL5/UL8/UL52, là những enzyme hoạt động, bao gồm một helicase từ đầu 5' - 3', một DNA đơn có chức năng như một NTPase và mồi hoạt động Helicases đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh học quan trọng của virus như quá trình sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp, sao mã và dịch mã DNA của

Herpesvirus (Marintcheva và Weller, 2001) UL8 không có khả năng quyết

định hoạt tính của enzyme nhưng có khả năng làm tăng tỷ lệ tổng hợp mồi của phức hợp UL5/UL52 thông qua việc làm tăng tỷ lệ mồi gốc ban đầu (2NTPs – pppNpN) Phức hợp UL5/UL52 chứa cấu trúc và chức năng chính cho các hoạt

Trang 23

tính enzyme của helicase, mặc dù nếu đứng riêng rẽ, thì cả UL5 hoặc UL52 đều không có khả năng biểu hiện hoạt tính enzyme (Pan và cs., 2008) UL5 chứa bảy motif bảo tồn được tìm thấy trong tất cả các thành viên của trên họ helicase UL5 chịu trách nhiệm cho việc tháo xoắn chuỗi cũng như quá trình sao chép DNA và hoàn thiện chu kỳ sống của virus (Zhu và Weller, 1992) Các thay đổi nhỏ về cấu trúc trong tiểu đơn vị UL5 cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt động của primase (Biswas và Weller, 2001)

Gen UL5 tương đối ổn định trong tiến hóa phân loại và có thể được sử

dụng là một chỉ thị di truyền tin cậy cho phân tích phả hệ nguồn gốc (Pan và cs., 2008)

Helicases đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh học quan trọng của virus như quá trình sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp, sao mã cắt ghép

và dịch mã DNA của Herpesvirus.(Marintcheva và Weller, 2001) Bên cạnh

gen UL5, gen UL32 cũng đóng vai trò quan trọng, liên quan đến việc phân cắt DNA và bao gói virus (An và cs., 2008; Chang và cs., 2009; Zhu và cs., 2011), tuy nhiên những nghiên cứu về gen này chưa nhiều Việc bổ sung các thông tin

về gen này đối với quần thể virus dịch tả vịt hiện nay là điều cần thiết

DNA-polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp DNA Những enzyme này xúc tác cho quá trình polymer hóa các deoxiribonucleotid nhờ sự hỗ trợ của các mồi, là các đoạn oligonucleotide gồm các base của RNA

và DNA Các mồi này được tổng hợp nhờ hoạt động của một loại enzyme khác, gọi là primase

Tất cả DNA-polymerase đều tổng hợp DNA theo hướng từ đầu 5' đến đầu 3' của DNA Cho đến nay không có enzyme DNA-polymersae nào có khả năng tổng hợp chuỗi mới mà không cần nhóm OH ở đầu 3' có sẵn (tính chất này chỉ

có ở RNA-polymerase) Vì lý do này mà DNA-polymerase cần đến sự có mặt của các primer, từ đó enzyme DNA-polymerase có thể gắn các nucleotid tiếp

Trang 24

theo Các primer này chính là các đoạn oligonucleic gồm các base của RNA và DNA trong đó 2 base đầu tiên luôn là base của RNA Các primer này được tổng hợp nhờ hoạt động của một loại enzyme khác gọi là primase

Các DNA-polymerase thường có tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc, nghĩa là cấu trúc bộ phận tham gia xúc tác của enzyme này nhìn chung thay đổi rất ít giữa các loài Nó còn được xem như là holoenzyme vì nó cần có một ion Mg làm vai trò một Co-factor giúp cho hoạt động chuẩn xác Khi không có nguyên tử Mg này thì phần còn lại của enzyme gọi là apoenzyme

Chỉ có một vài DNA-polymerase có khả năng sửa chữa những sai hỏng trên sợi DNA mới tổng hợp trong quá trình nhân đôi Khi phát hiện một cặp base liên kết không đúng theo nguyên tắc bổ xung DNA-polymerase sẽ trượt ngược trở lại và thực hiện hoạt tính exonuclease để cắt bỏ base ngoài cùng của chuỗi nucleic acid theo hướng 3' - 5' cho đến vị trí của cặp base sai hỏng (hoạt động này được gọi là hoạt tính đọc sửa) Sau khi cắt bỏ cặp base sai, enzyme DNA-polymerase sẽ thay thế bằng base thích hợp và quá trình sao chép lại được tiến hành

Một vài loại virus cũng mã hoá những phân tử DNA-polymaerase đặc biệt có khả năng sao chép chọn lọc DNA của vius thông qua nhiều cơ chế khác nhau, các retrovirus mã hoá một loại DNA-polymerase sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp những chuỗi phân tử DNA đó là các enzyme phiên mã ngược (reverve trancriptase)

Các DNA-polymerase thường có tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc, nên được lựa chọn để phân tích phả hệ nguồn gốc

1.2.2 Sự nhân lên của virus

Quá trình nhiễm virus vào tế bào vật chủ diễn ra khi virus bám vào thụ thể của tế bào chủ, sau đó có sự dung hợp giữa vỏ của virus vào màng của tế bào vật chủ Qua đó, capsid nhân của virus được lọt vào bên trong tế bào rồi

Trang 25

chuyển tới nhân của tế bào Lúc này quá trình mất vỏ của capsid nhân diễn ra Các thành phần của virus sẽ ức chế các quá trình tổng hợp các thành phần cao phân tử của tế bào chủ Có 3 dạng mRNA:

- Dạng α: Xuất hiện sớm, chúng mã hóa 5 protein điều hòa

- Dạng β: Dạng chậm của dạng sớm, chúng mã hóa protein cho sự sao chép DNA ( Thymidine kinaza, DNA-polymase)

- Dạng γ: Mã hóa protein cấu trúc của virus

Quá trình tổng hợp DNA Herpesvirus của xảy ra trong nhân Sau khi nhiễm, hệ gen của Herpesvirus chuyển sang dạng vòng (giống Bacteriophage

λ) và phiên mã theo cơ chế vòng quay

Herpesvirus sinh sản ở trung ương thần kinh của tế bào vật chủ Khi tế

bào vật chủ bị nhiễm các vỏ ngoài virion hấp thụ, lúc màng sinh chất tế bào vật chủ hòa hợp với vỏ thì virion chui vào trong tế bào chất, sau đó DNA chuyển dịch vào nhân Ở đây xảy ra phiên mã để tạo thành mRNA Sau đó RNA đi đến

tế bào chất đến lưới nội chất Ở đây nhờ ribosome của tế bào vật chủ, nó tạo thành các mạch polypeptide cho virus DNA ở trong nhân được nhân lên Các nucleocapsid được tạo thành ở trong nhân và giải phóng từ nhân qua màng nhân ra ngoài Các virion tập trung ở giữa lớp ngoài và trong của màng nhân và

ở lưới nội chất Như vậy tế bào nhiễm virus này có quá trình tổng hợp DNA ở ngoài nhân, điều đó thường không xảy ra, nếu có thì trong các bào quan như ty thể mà thôi (Nguyễn thị Chính, Ngô Tiến Hiển, 2001)

Trang 26

Hình 1.5 Chu trình nhân lên của Herpesvirus trong tế bào vật chủ

( Nguồn: Nguyễn thị Chính, Ngô Tiến Hiển, 2001 ).

1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt Nam

Virus dịch tả vịt được Dardiri và Hwang tập trung nghiên cứu vào năm

1968, (Dardiri, Gailunas, 1968; Hwang, 1968) Tiếp theo khoảng thời gian đó, nhiều nghiên cứu về virus dịch tả vịt được công bố nhưng chỉ tập trung vào việc phát hiện bệnh, tình hình nhiễm bệnh và triệu chứng lâm sàng, bệnh tích

và một số phương pháp đối phó với bệnh này (Friend và Franson, 1999; Hansen và cs., 2000; Sandhu và Shawky, 2003) Những năm tiếp theo, mặc

dù bệnh dịch tả vịt vẫn xuất hiện và gây bệnh ở nhiều quốc gia song những công bố về virus dịch tả vịt không nhiều (Friend và Franson, 1999; Osterrieder, 1999)

Hiện nay, với sự phát triển của sinh học phân tử, các nghiên cứu sâu hơn về gen/hệ gen của virus dịch tả vịt đã được tiến hành (Cheng, 2006 ; Liu

và cs., 2008; Li và cs., 2009; Xiang và cs., 2011; Wang và cs., 2011; Liu và cs., 2010; Wu và cs., 2012) Các nghiên cứu trước hết tập trung về đặc điểm

sinh học phân tử của các gen/hợp phần gen quan trọng trong hệ gen của virus

Trang 27

dịch tả vịt: UL1-UL7 (Li và cs., 2009), UL5 (Pan và cs., 2008; Zhu và cs., 2011), UL6 (Nellissery và cs., 2007), UL13 (Asai và cs., 2007) UL16 (He và cs., 2011), UL24 (Jia và cs., 2009), US6, US7 and US8 (Zhao Y, Wang J, 2010), UL 26 (Liu và cs., 2010), gen UL31 (Schnee và cs., 2006;, UL34 (Neubauer và cs., 2002), UL38 (Xiang và cs., 2011), UL44 (Jarosinski và cs.,2010), UL49 (Jarosinski và cs.,2010); UL51 (Shen và cs., 2009), gen UL53 (Zhang và cs., 2010; 2011), gen UL55 (Wu và cs., 2012) và một số phân đoạn khác

Cho đến nay, đã có 4 hệ gen của virus dịch tả vịt được giải mã toàn bộ

hệ gen, bao gồm 3 chủng vaccine và một chủng cường độc (Wu và cs., 2012) Các nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử đã chứng minh virus dịch tả vịt

là thành viên của họ Herpesviridae, mang những đặc điểm đặc trưng của họ

này Tuy nhiên do đặc tính sinh học và phân loại học của loại virus này còn chưa hoàn toàn sáng tỏ, nên Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chưa được xác định cụ thể, thuộc họ Herpesviridae (Liu và cs., 2008;; Nicole, Keith, 2009; Olsson và cs., 2009; Wang và cs., 2011)

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về virus dịch tả vịt còn chưa nhiều và chỉ mới tập trung ở việc công bố tình hình dịch bệnh và các biểu hiện bệnh tích, triệu chứng lâm sàng (Nguyễn Ngọc Điểm, 2005) Một số công bố về kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vaccine và giới thiệu một số vaccine có nguồn gốc từ nước ngoài (Lê Văn Lãnh, 1991; Nguyễn Đức Hiền, 1999) Đặc biệt chưa có công bố nào về sinh học phân tử virus dịch tả vịt ở mức độ gen

và so sánh phân tích hệ gen tại Việt Nam Chính vì vậy mà việc bắt đầu và đẩy mạnh nghiên cứu về virus dịch tả vịt ở Việt Nam là một điều rất cần thiết hiện nay

Trang 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

- Các loại máy móc bao gồm: Tủ lạnh thường, tủ lạnh âm sâu -80 o C

lạnh, máy PCR (PTC-100 thermal cycler) của MJ Research Inc (Mỹ), máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Fermentas và Bio-Rad, máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ), kèm theo máy vi tính, máy ổn nhiệt, máy Vortex, Laminair cấy vô trùng, máy giải trình tự tự động ABI Avant Genetic Analyzer 3100, máy giải trình tự tự động Applied Bionsystems (ABI) Model 3730XL, bộ pipetman (10  l, 20  l, 100  l, 200  l, 1000  l và

5000  l), máy tính và các phần mềm sinh - tin học

- Các dụng cụ thường qui trong phòng thí nghiệm

2.1.3 Hóa chất

- Bộ kit tách chiết DNA tổng số, “AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc)

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp

- Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ PCR Purification Kit của hãng BIONEER

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự

Trang 29

- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

- Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu:

Để đạt được mục tiêu của đề chúng tôi tài tiến hành giải quyết những nội dung chính sau:

1 Tiếp truyền và bảo quản giống virus dịch tả vit cường độc và nhược độc vaccine

2 Tách chiết DNA tổng số của mẫu virus cường độc và mẫu virus nhược độc dịch tả vịt nghiên cứu

3 Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để thu các gen: DNA-polymerase; gen UL5 và gen UL32

4 Giải mã gen DNA-polymerase, UL5, UL32 của chủng cường độc và chủng vaccine nghiên cứu

5 So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino aicd giữa chủng cường độc và nhược độc vaccine của Việt Nam với các chủng của thế giới dựa vào dữ liệu các gen nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tiếp truyền

Chủng virus DTV cường độc đông khô được pha thành huyễn dịch với nước sinh lý ở nồng độ 10 -3 (theo tiêu chuẩn ngành của trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y tw1), Đây chính là dịch chứa virus để sử dụng cho tiếp truyền Dùng hỗn dịch chứa virus đã thu được ở trên tiêm vào bắp cho 10 vịt mẫn cảm ở lô thí nghiệm 1ml/vịt Theo dõi triệu chứng lâm sàng sau 24h tiêm

và mổ khám vịt chết 72 đến 96h sau tiêm để kiểm tra bệnh tích

Chủng virus nhược độc vaccine tiêm với tỷ lệ 10 liều cho 5 vịt trưởng thành để kiểm tra tính an toàn của vaccine Theo dõi 14 ngày sau tiêm

Trang 30

Tiêm nước sinh lý cho 5 vịt đối chứng liều 1ml/vịt theo dõi 14 ngày sau tiêm

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm “AccuPrep ® Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc)

* Nguyên lý tách chiết DNA tổng số:

Mẫu DTV khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa Để tách chiết được hệ gen của nhân và hệ gen của ty thể cần phải phá vỡ mô Huyễn dịch thu được gồm thành phần chính là protein hoặc có thể có RNA nên cần phải loại bỏ chúng Loại bỏ protein bằng cách bổ sung enzym proteinase K có tác dụng phân huỷ protein, bổ sung RNase H có tác dụng phá huỷ RNA Sau đó phá vỡ màng tế bào ngoài DNA còn có các thành phần khác của nguyên sinh chất nên cần phải tách riêng DNA bằng isopropanol rồi thu DNA khi cho lọc trên màng lọc tích điện dương

* Cách tiến hành:

Bước 1: Mẫu vật sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa Bước 2: Thêm 200µl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền cho đến khi thành dung dịch đồng nhất Bổ sung 20µl Proteinase K

Bước 3: Bổ sung 4µl RNase-A (100mg/ml) và 200µl dung dịch

C trong 30 phút

trong 15 giây Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch cặn

Bước 6: Thêm 500µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA bám vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới

Trang 31

Bước 7: Thêm 500µl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa DNA bám vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới Ly tâm lại 13000 vòng/phút trong 1 phút (để làm khô màng)

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5 ml mới, thêm 60µl dung dịch Elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2 - 5 phút Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút Bỏ cột, giữ dịch bên dưới

DNA tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 0,8% Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin - Doc (WEALTEC, USA)

H 2 O: 18,5µl

Tổng số: 50 µl

Thiết kế mồi dựa trên nguyên tắc cặp mồi nhân vùng gen cho sản phẩm

có độ dài chênh lệch nhau giữa các đối tượng chẩn đoán, để đánh giá sử dụng phương pháp điện di, có trình tự như sau:

Trang 32

Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) được sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’) Hướng mồi Gen thước Kích

DTVF 5’-CAAGGCTCTATTCGGTAATG-3’ Mồi xuôi DNA-pol 446bp DTVR 5’-GAAGGCGGGTATGTAATGTA-3’ Mồi ngược

HELIF 5’-TGTCCATCAACACCACCTAC-3’ Mồi xuôi

UL5

2568bp HELIR 5’-ATCATCGCACAATGCTCC-3’ Mồi ngược

DTVUL5F 5’-CCTTGGTTCATCATATTCATCTGCG-3’ Mồi xuôi

DTVUL5R 5'-TGGGCAAGGTACCAGTTCTT-3' Mồi ngược

DTVUL32F 5’-GGTCTTCATTGGGTATGGCATC-3’ Mồi xuôi UL32 1962bp DTVUL32R 5’-TCGTAGTCAGACATAGGTGCCG-3’ Mồi ngược

Các trình tự tương ứng với đoạn DNA nghiên cứu từ một số chủng thuộc

virus dịch tả vịt đã được đăng ký tại Ngân hàng gen và công bố trên các tạp chí quốc tế, được sử dụng để so sánh đối chiếu

2.2.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

DNA sản phẩm PCR cần được tinh sạch để loại bỏ các thành phần khác,

chỉ giữ lại DNA

Bước 2: Sau đó chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút Rồi bỏ dịch ở dưới, giữ cột

Bước 3: Thêm 500μl WB lên màng của cột lọc Sau đó ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ phần nước ở dưới, giữ cột Ly tâm lại 13,000 vòng/phút trong 1 phút thêm một lần nữa, để làm khô màng

Bước 4: Chuyển cột sang một ống Eppedorf 1,5ml mới, thêm 30μl EL, để

ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Sau đó ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1,5 phút

Trang 33

Lúc này, DNA của sản phẩm PCR được tách ra khỏi màng lọc cùng với

C Sản phẩm sau khi tinh sạch, được đông khô và đọc trình tự trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) càng tinh khiết càng tốt

2.2.5 Phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại Đặc trưng của phương pháp này là dùng

ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một

cách ngẫu nhiên Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau

và chỉ sai khác nhau một nucleotide

Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao

gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các điều kiện

thích hợp Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20-24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên) Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình

tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin-sinh học Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5’→3’ Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide; thông thường là 500-2000 nucleotide nếu được giải trình trên máy giải trình trình tự tự động

Trang 34

Quá trình giải trình tự trực tiếp đoạn DNA sản phẩm thu nhận sau tinh

sạch được tiến hành hoặc với một loại mồi, hoặc mồi xuôi (hoặc với mồi ngược) là các chuỗi oligonucleotide được thiết kế bám vào các trình tự đầu

tiên của sản phẩm, mà các mồi này cũng chính là các mồi tham gia thực hiện phản ứng PCR/RT-PCR

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học

2.2.6.1 Nguyên tắc chung

Trong quá trình sao chép, các chuỗi DNA luôn luôn có thành phần nucleotide giống với chuỗi khuôn bố mẹ ban đầu Nếu có sai khác, thì sai khác đó có thể là do lỗi ngẫu nhiên của sao chép tổng hợp hoặc do áp lực di truyền của tự nhiên mà hình thành (Grauer, Li, 2000) Những nucleotide sinh

ra thế hệ sau khác với thế hệ ban đầu thường được gọi là các đột biến, đó chính là nguồn gốc của sự đa dạng và sự đổi mới trong tiến hóa (Lê Quang Huấn, 2007) Đột biến có thể xảy ra trong một gen, một vùng DNA hay toàn

bộ hệ gen, có thể ở vùng DNA mã hóa cho protein hoặc ở vùng không mã

hóa Các đột biến tác động lên một nucleotide gọi là các đột biến điểm, hay tác động lên một số nucleotide cạnh nhau gọi là các đột biến đoạn

Phân tích chuỗi gen (sequence analysis) là xác định các cấu trúc của chuỗi gen và so sánh thành phần của chuỗi gen (bao gồm trình tự nucleotide, amino acid), cấu trúc gen/hệ gen, khung đọc mở (ORF) và nhiều đặc tính phân

tử khác So sánh đối chiếu chuỗi gen (comparative analysis of sequences) là thao tác thực hiện với hai hay nhiều chuỗi gen khác Trong nghiên cứu thuộc lĩnh vực sinh học phân tử, phân tích chuỗi gen được thực hiện nhờ sự trợ giúp của các chương trình tin-sinh học

Nhiều phương pháp xây dựng cây phả hệ (hay còn gọi là cây phát sinh loài), được sử dụng trong nghiên cứu phân tử mà chủ yếu dựa trên số liệu về trình tự DNA, nhưng cũng có thể áp dụng với các số liệu về trình tự amino acid (Lê Quang Huấn, 2007; Lê Thanh Hòa, 2006a)

Trang 35

2.2.6.2 Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen GeneDoc

GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở

dạng msf (multiple sequence file) (Nicholas và cs., 2009) GeneDoc cho phép

xác định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể, đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho phân tích phả hệ

2.2.6.3 Xử lý số liệu trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEd v1.03, sau đó so sánh các chuỗi sử dụng chương trình AsemblyLIGN v1.9 và phân tích thành phần nucleotide và amino acid hoặc các đặc tính gen và polypeptide bằng hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh Trên máy tính PC, các chuỗi nucleotide hay amino acid được sắp xếp và tính toán

mức độ tương đồng bằng chương trình GeneDoc v2.5 (Nicholas và cs., 1997)

Các chuỗi gen UL5, UL32 và DNA-polymerase và toàn bộ khung đọc mở (ORF) được sử dụng để phân tích, so sánh về thành phần nucleotide và amino acid, cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng của Việt Nam và thế giới

Định dạng
Số trang	71
Dung lượng	1,41 MB

Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA polymerase

Phƣơng phỏp nghiờn cứu