Luận văn nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản(PRRS) phân lập tại vùng phụ cận hà nội

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ HOA

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH

SẢN (PRRS) PHÂN LẬP TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN THỊ LAN

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2011

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hoa

người ựã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Tôi

xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn bệnh lý, Khoa Thú y, Viện đào tạo sau ựại học Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ựình, bạn bè, các anh, chị em phòng thắ nghiệm Trung tâm Khoa Thú y những người luôn ựộng viên, giúp ựỡ tôi ựể tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Hoa

MỤC LỤC

1 MỞ ðẦU i

1.1 ðặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 3

2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn 4

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới 4

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam 6

2.2 Căn bệnh 13

2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 13

2.2.2 Phân loại virus PRRS 15

2.2.3 Sức đề kháng của virus PRRS 16

2.3 Truyền nhiễm học 16

2.3.1 Lồi vật mắc bệnh 16

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây 16

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh 18

2.4 Triệu chứng và bệnh tích 20

2.4.1 Triệu chứng của lợn mắc PRRS 20

2.4.2 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 21

2.5 Chẩn đốn và phịng trị bệnh 22

2.5.1 Chẩn đốn 22

2.5.2 Các biện pháp phịng trị bệnh 22

2.6 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 23

2.6.1 Nguyên lý của phản ứng PCR 23

2.6.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR 25

2.7 Kỹ thuật giải trình tự gen 25

2.7.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert 26

2.7.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 27

2.7.3 Giải trình tự DNA bằng máy tự động 28

3 ðỐI TƯỢNG - ðỊA ðIỂM - NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 ðối tượng 30

3 2 ðịa ñiểm 30

3.3 Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 30

3.3.2 Nguyên liệu 31

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 31

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 41

4.2 Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các chủng virus PRRS 54

4.2.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số của các chủng virus PRRS 54

4.2.2 Kết quả phản ứng RT- PCR 55

4.2.3 Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các chủng virus PRRS 56

4.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin 58

4.4 Kết quả so sánh trình tự axit amin của ñoạn gen ORF5 của các chủng PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin 63

4.5 Sự tương ñồng về nucleotide và axit amin giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu 68

4.6 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 70

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 72

5.1 Kết luận 72

5.2 ðề nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 74

II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 75

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium

EAV : Equine arteritis virus

EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetat Acid

ELISA : Enzyme linked immunosorbent Assay

IPMA : Immunoperoxidase Monolayer Assay

LDHV : Lactate dehydrogenase-elevating virus

OIE : Organisation of International Epidemiology

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RT-PCR : Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction SHFV : Simian hemorrhagic fever virus

SLS : Sample loading solution

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tại các tỉnh phía Bắc 7

Bảng 2.2 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tại các tỉnh miền Trung 8

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đốn RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS 48

Bảng 4.3 Kết quả phân lập PRRSV trên mơi trường tế bào Marc 145 51

Bảng 4.4 Hồ sơ các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu 53

Bảng 4.5 Sự tương đồng về nucleotide và axit amin giữa các chủng virus

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 5

Hình 2.2 Dịch PRRS tại Việt Nam - 2007 9

Hình 2.3 Hình thái virus PRRS 14

Hình 2.4 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS 14

Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý 20

Hình 2.6 ðại thực bào bình thường 20

Hình 2.7 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 24

Hình 4.1 Triệu chứng tím tai 44

Hình 4.2 Lợn bị phát ban 44

Hình 4.3 Lợn bị sưng mí mắt 44

Hình 4.4 Lợn mệt mỏi, chán ăn 44

Hình 4.5 Lợn ủ rũ, tím tai,phát ban 44

Hình 4.6 Lợn nái bị sảy thai 44

Hình 4.7 Phổi viêm, hoại tử 47

Hình 4.8 Hạch lâm ba sưng, tụ máu 47

Hình 4.9 Thận xuất huyết ñiểm 47

Hình 4.10 Phổi xuất huyết 47

Hình 4.11 Lách nhồi huyết 47

Hình 4.12 Tử cung viêm 47

Hình 4.13 Phế nang ñứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm (HE x10) 50

Hình 4.14 Dịch phù trong lòngphế nang (HE x40) 50

Hình 4.15 Hạch lâm ba hoại tử(HE x10) 50

Hình 4.16 Hạch lâm ba xuất huyết(HE x40) 50

Hình 4.17 Lách xuất huyết(HE x10) 50

Hình 4.18 Lách xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm (HE x40) 50

Hình 4.19 CPE-36 giờ sau gây nhiễm 52

Hình 4.20 CPE-48 giờ sau gây nhiễm 52

Hình 4.21 CPE-60 giờ sau gây nhiễm 52

Hình 4.22 CPE-72 giờ sau gây nhiễm 52

Hình 4.23 Tế bào Marc145 chưa gây nhiễm virus 52

Hình 4.24 Hình ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 54

Hình 4.25 Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 56

Hình 4 26 Giản ñồ giải trình tự tự ñộng thành phần nucleotide của ñoạn gen nghiên cứu 57

Hình 4.27 So sánh trình tự nucleotide của ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 60

Hình 4.28 So sánh trình tự axit amin của ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 65

Hình 4.29 Cây sinh học phân tử của các chủng virus PRRS nghiên cứu 70

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) hay còn gọi là bệnh tai xanh là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi PRRS do một loại virus có nhân RNA với ñích tấn công là các ñại thực bào dẫn ñến hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạo ñiều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công [3] Bệnh tai xanh gây thiệt hại nặng nề ñối với ngành chăn nuôi lợn, ñối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con

sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh/ổ, tình trạng bệnh kéo dài âm ỉ, rối loạn sinh sản, ñộng dục kéo dài, chậm ñộng dục trở lại ðối với ñực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng ñến tỷ lệ thụ thai

và chất lượng ñàn con, các nhóm lợn khác PRRS thường gây rối loạn hô hấp kết hợp với các mầm bệnh khác làm cho lợn chết nhanh chóng [6] Bệnh xuất hiện ñầu tiên ở Mỹ năm 1987 rất nhanh chóng năm 1988 bệnh lan sang Canada và sau ñó lan sang các nước Châu Âu [17] Năm 1998, bệnh ñược phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á Từ năm 2005 trở lại ñây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới trong ñó có Việt Nam

Thế kỷ XXI là thế kỷ của công nghệ sinh học cùng với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật sinh học phân tử ñã mở ra những triển vọng nghiên cứu

vô cùng to lớn và ñã có những thành tựu ñáng kể trong việc phát hiện cấu trúc phân tử của virus PRRS Genome của PRRSV là một sợi ñơn RNA và virus ñược xếp vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus [36] Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế giới [32] PRRSV

có thể ñược phân biệt thành hai kiểu gien: loại I, European genotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, ñại diện là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtyp ñã

được xác định và loại II: Northern American genotype gồm những virus thuộc dịng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332 Hệ gen của virus gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hĩa cho 7 protein của virus gồm GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, protein màng M và protein cấu trúc capxit N Trong số đĩ protein GP5 (Envelope glycoprotein) cĩ trọng lượng phân tử từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen, các kháng thể trung hịa chủ yếu liên kết trực tiếp với các Epitop cĩ trên bề mặt của protein này đây là protein vỏ bọc nhân, cĩ tính kháng nguyên cao

Việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của PRRSV hiện

nay là thực sự cần thiết giúp cho nghiên cứu chẩn đốn chính xác bệnh cũng như nghiên cứu sản xuất các loại vacxin thế hệ mới phù hợp với PRRSV đang lưu hành tại Việt Nam và cịn cho phép xác định mức độ tiến hĩa của virus đương nhiễm với các chủng trước đĩ tại Việt Nam và trên thế giới ðặc biệt giải trình tự thành cơng các đoạn gen quyết định kháng nguyên của PRRSV sẽ

mở ra triển vọng nghiên cứu tiếp theo cho việc sản xuất kit chẩn đốn, vacxin phịng bệnh, kháng thể đơn dịng…gĩp phần vào cơng cuộc khống chế dịch bệnh trên đàn lợn

Vì vậy chúng tơi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus gây hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản (PRRS) phân lập tại vùng phụ cận Hà Nội”

- Xây dựng ñược cây sinh học phân tử cho biết mối quan hệ di truyền của các chủng virus PRRS phân lập ñược ở vùng phụ cận Hà Nội

về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ [33] Tại các ổ dịch

có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS ñã ñược báo cáo ở Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỉ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết trong ñiều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn [13] Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng [4],[5],[7] Khi ñó ñã có nhiều giả thuyết ñược ñặt ra, người ta cũng bắt ñầu kiểm tra sự bất thường ở ñường sinh sản của lợn giống nhưng vào thời ñiểm ñó vẫn chưa thể biết ñược mối liên hệ của nguyên nhân gây ra tình trạng nêu trên Bệnh vẫn còn là một

bí ẩn Hàng năm ước tính tiêu phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là

560 triệu USD cho bệnh tai xanh [24]

Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh tai xanh ñã lan sang nước láng giềng Canada và tiếp tục hoành hành trong khi ñó bí ẩn về căn bệnh vẫn chưa ñược giải mã

Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự ñã ñược báo cáo ở CHLB ðức (1990) Năm năm sau kể từ khi có báo cáo ñầu tiên về bệnh, năm 1991 virus ñược tìm thấy lần ñầu tiên tại Hà Lan Các tác giả người Hà Lan ñã xác ñịnh ñược ñặc tính của virus sau khi thực nghiệm thành công các chỉ tiêu của ðịnh ñề Koch và virus ñược ñặt tên virus là Lelystad ñể

kỉ niệm phát hiện này [44] Sau ñó không lâu, virus PRRS ñược Mỹ ñặt tên là ATCC VR – 2332) [35] ðứng trước những thiệt hại cũng như diễn biến phức

tạp của bệnh Năm 1992, trong cuộc họp chuyên ñề quốc tế về triệu chứng hô hấp và còi cọc ở lợn tại Minesota, Mỹ tổ chức Thú y thế giới (OIE) ñã chính thức ñặt tên cho bệnh này là hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Tính từ năm 2005 trở lại ñây, 25 nước vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (trừ châu ÚC và New Zealand) trên Thế giới ñã báo cáo phát hiện có PRRS lưu hành Con số thực tế sẽ còn khác rất nhiều Trong số các nước nêu trên có cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển mạnh như Mỹ, Hà Lan, ðan Mạch, Anh, Pháp, ðức…

Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

Tại Trung Quốc, dịch bệnh PRRS ñã xuất hiện trong những năm gần ñây và hiện ñang còn tồn tại Trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus PRRS ñộc lực cao ñã gây ra ñại dịch lây lan ở các tỉnh phía Nam, làm hơn 2 triệu con ốm, trong ñó có hơn 400.000 lợn mắc bệnh ñã chết [45] Tính

từ ñầu năm ñến tháng 7/2007, dịch bệnh ñã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con chết ðiều ñáng chú ý là virus gây ra ñại dịch PRRS vào năm 2006 ở Trung Quốc ñã cho thấy những thay ñổi, tăng tính cường ñộc so với các chủng virus PRRS cổ ñiển ñược phân lập tại nước

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam

Lần ñầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS ñược phát hiện trên ñàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này ñã ñược xử

lý vào thời gian ñó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% [2]

ðiều tra huyết thanh học của các tác giả Akemi Kamakawa và Hồ Thị Viết Thu từ năm 1999-2003 cho thấy tỷ lệ lợn có kháng thể kháng virus PRRS tại Cần Thơ là 7,7% (37/478 mẫu dương tính với virus PRRS)

Như vậy có thể thấy virus PRRS ñã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác ñịnh ñược lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở ñàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt Nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra

+ ðợt dịch ñầu tiên

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam ñược bắt ñầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt ñàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường Ngày 23/3/2007, cơ quan thú y tại tỉnh này ñã báo cáo cho Cục Thú

y, ngay sau đĩ ngày 26/3/2007, Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương - Cục Thú y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương tính với virus PRRS Do lần đầu tiên dịch PRRS xuất hiện tại Việt Nam và do khơng quản lý được việc buơn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh

và phát triển mạnh tại 6 tỉnh thành khác nhau thuộc ðồng bằng Sơng Hồng gồm: Hưng Yên, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Giang và Hải Phịng làm hàng ngàn con lợn mắc bệnh (bảng 2.1)

Lợn con

Lợn thịt

Tổng

số

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

Ngồi các tỉnh được xác định là cĩ dịch tại bảng 2.1, Cục thú y cũng đã

cĩ kết quả chẩn đốn dương tính với PRRS tại một số đàn lợn thuộc các tỉnh, thành: Thanh Hố, Hà Nội, Sơn La và Lào Cai Tuy nhiên, do chỉ xuất hiện ở các đàn riêng lẻ cùng với các biện pháp xử lý triệt để nên đã khơng cĩ dịch PRRS phát triển tại các địa phương này

Do thực hiện kiên quyết các biện pháp phịng chống dịch nên sau hơn một tháng dịch PRRS đã được khống chế

+ đợt dịch thứ 2

Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam rồi lan sang một

số tỉnh khác như: Thừa Thiên Huế, đà Nẵng và Quảng Ngãi làm trên 30 ngàn

lợn mắc bệnh, hàng ngàn lợn chết và phải tiêu hủy như tổng hợp ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tại các tỉnh miền Trung

Số lợn mắc bệnh Số lợn chết và xử lý T

T Tỉnh

Số huyện Số xã Tổng

số

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

Tổng

số

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

ốm ra khỏi vùng dịch

Như vậy chỉ trong 4 tháng dịch PRRS ựã xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam với 324 xã thuộc 65 huyện của 19 tỉnh với số lợn chết và phải tiêu hủy là trên 20.000 con Tình hình dịch PRRS vẫn ựang diễn biến phức tạp vào không có chiều hướng lắng xuống

Hình 2.2 Dịch PRRS tại Việt Nam - 2007

+ ðợt dịch thứ 3

ðầu năm 2008 dịch tái xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh và chỉ 1 tháng sau (tháng 4-2008) dịch ñã bùng phát ở 775 xã, phường thuộc 57 huyện, thị của 10 tỉnh: Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Quảng Nam, Nghệ An, Lâm ðồng, Thừa Thiên Huế, Thái Bình, Thái Nguyên, Ninh Bình và Nam ðịnh với tổng

số lợn mắc bệnh khoảng 255.250 con, số chết và phải tiêu hủy là 254.242 con ðây là ñợt dịch lớn nhất từ trước ñến nay

Cho ñến tháng 7 năm 2008 tổng số lợn mắc bệnh là 16.677 con, số chết

và buộc phải tiêu hủy là 14.799 con Tình hình cho thấy virus gây bệnh ñã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời

B¾c Giang Qu¶ng Ninh H¶i Phßng Th¸i B×nh 13/7: TT- HuÕ

§µ N½ng Qu¶ng Ng·i

Năm 2009

Sau một thời gian dài khống chế thành công, ngày 18-2-2009 dịch PRRS trên lợn ñã xuất hiện trở lại tại tỉnh Quảng Ninh, dịch bùng phát tại huyện Yên Hưng, Quảng Ninh với tổng số 76 con ốm, trong ñó có 23 lợn nái

và 53 lợn thịt Ngày 28-2-2009 dịch tái xuất hiện tại Duy Xuyên, Quảng Nam, cho ñến nay tình hình diễn biến của bệnh vẫn ñang vô cùng phức tạp chưa thể thống kê ñầy ñủ các thiệt hại do bệnh gây ra

Dịch PRRS xảy ra tại 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành gồm: BR- Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bắc Giang, Bình Dương, ðắc Lăk, ðồng Nai, Gia Lai, Hưng Yên, Quảng Ninh, Tiền Giang và Vĩnh Long với 7.030 con lợn mắc bệnh va 5.847 con lợn buộc phải tiêu hủy

Năm 2010

ðợt 1- tại miền Bắc: dịch PRRS ñã xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải

Dương Tính ñến tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch PRRS tại 461

xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm: Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam ðịnh, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con, trong số ñó tiêu hủy là 65.911 con

ðợt 2- tại miền Trung và miền Nam

Theo kết quả ñiều tra, ñợt dịch này bắt ñầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau ñó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Quảng Trị (ngày 1/7)

Trong ñợt dịch thứ 2 này, dịch chủ yếu tập trung ở miền Trung và miền Nam, ngoài ra dịch còn xảy ra ở một số tỉnh phía Bắc: Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh Tính ñến hết năm 2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dich PRRS tại 39.588 hộ chăn nuôi của 1498 xã, phường, thị trấn thuộc 202

quận, huyện của 34 tỉnh, thành phố Tổng số lợn trong ñàn mắc bệnh là 932.715 con, số con mắc bệnh là 516.555 con, trong ñó số chết và tiêu hủy

là 348.732 con Ngoài ra trong ñợt này cũng có thêm một số tỉnh phía Bắc

Bảng 2.3.a Tình hình dịch PRRS cuối năm 2010

Tổng ñàn lợn (con)

Số lợn

ốm (con)

Số lợn tiêu hủy (con)

Bảng 2.3.b Tình hình dịch PRRS cuối năm 2010

STT Thời gian Tỉnh/Tphố Số

huyện Số xã

Số HCN

Tổng ñàn lợn (con)

Số lợn

ốm (con)

Số lợn tiêu hủy (con)

phải tiêu hủy nhiều nhất trong 3 năm dịch bùng phát từ năm 2007 trở lại ñây Dịch tai xanh ñã gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn nói riêng và kinh tế nước nhà nói chung

Năm 2011: ðến nay, nửa ñầu năm 2011 theo công bố của Cục Thú Y thì dịch tai xanh hiện giờ tạm lắng Nhưng dịch bệnh vẫn ñang xảy ra ở một

số tỉnh trong cả nước: Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thái Bình, Bắc Ninh, Hải Dương

+ Ngày 25/2/2011 Dịch tai xanh bắt ñầu xảy ra ở Hà Tĩnh tại 1 trại chăn nuôi lợn ở xã ðức Long- ðức Thọ trên ñàn lợn 23 nái hậu bị mới nhập

về trại Ngày 27/3 chúng ñã bị tiêu hủy toàn bộ

+ Ngày 8/4/2011: Nghệ An thông báo có dịch

+ ðến ngày 29/5/2011: Trong cả nước dịch tai xanh vẫn còn xảy ra tại

4 tỉnh: Nghệ An, Thái Bình, Bắc Ninh, Hải Dương

2.2 Căn bệnh

2.2.1 Cấu trúc virus PRRS

PRRSV là một virus ARN chuỗi ñơn dương, virus ñược xếp vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus [15] Virus có cấu trúc gần giống với virus gây viêm khớp ở ngựa (EAV), Lactic dehydrogennase virus của chuột (LDHV) và virus gây sốt xuất huyết trên khỉ (SHFV)[38]

Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi ñiển tử thấy virus có dạng hình cầu, có vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45 - 80nm và chứa nhân nucleocapxit kích thước 25- 35nm

Hình 2.3 Hình thái virus PRRS

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp DNA là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2-deoxyuridin và mitomycin C chứng tỏ acid nucleic ñó là RNA Sợi RNA này có khối lượng khoảng 15.1 kb

Hình 2.4 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Virus PRRS có các loại protein cấu trúc bao gồm:

• Nucleocapsid protein (N, ORF7) (ORF: open reading frame) khoảng 14-15kDa, ñây là protein vỏ bọc nhân

• Membrane protein (M, ORF6) khoảng 18-19 kDa là protein liên kết vỏ bọc

• Envelope glycoprotein (E, ORF5) từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen

Ngoài ra còn có 3 loại glycoprotein cấu trúc ít thấy hơn và ñược kí hiệu

là ORF 2, 3 và 4

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính ña dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở châu

Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332)[9], [30] Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta ñã chứng minh ñược có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, ñược khẳng ñịnh qua phân tích trình tự nucleotide và axit amin của các khung ñọc mở (ORFs) của LV và VR-2332 Trình tự axit amin của VR-2332 so với LV là 76%(ORF2), 72%(ORF3), 80%(ORF4&5), 91%(ORF6) và 74%(ORF7) Phân tích trình tự cho thấy các virus ñang tiến hóa do ñột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen [27], [28] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các chủng virus này gây bệnh trên ñộng vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại ñại diện cho 2 genotyp khác biệt [14][34][39]

Những nghiêm cứu gần ñây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus ñược phân lập từ các vùng ñịa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay ñổi về chuỗi nucleotide khá cao ñến 20% Chủng bắc Mỹ có 3 subtyp: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada Chủng châu Âu có 2 subtyp: I10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự ña dạng về tính khánh nguyên, khả

năng biến ñổi cấu trúc kháng nguyên của virus ñã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng

2.2.3 Sức ñề kháng của virus PRRS

PRRSV là một virus có vỏ bọc ngoài, sự sống sót của PRRSV bên ngoài vật chủ chịu tác ñộng của nhiệt ñộ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng [18]

PRRSV có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở nhiệt ñộ dao ñộng trong khoảng -70oC ñến -20oC, 20 phút ở 56oC, 24 giờ ở

30oC và 6 ngày ở 21oC [9] Tuy nhiên khả năng sống của virus PRRS giảm nhanh khi nhiệt ñộ tăng lên [21]

PRRSV bền vững ở pH dao ñộng trong khoảng 6,5 ñến 7,5, tuy nhiên tính gây nhiễm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 [20]

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

2.3 Truyền nhiễm học

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

PRRSV gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi, nòi giống nhưng mẫn cảm nhất vẫn là lợn con và lợn nái mang thai [42] Thông thường virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn không gây bệnh cho người và các ñộng vật khác Tuy nhiên, một số loại gia cầm như vịt trời (Mallard duck) ñã ñược chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này [34] Do ñó, vấn ñề phát tán virus này ra diện rộng là khó tránh khỏi

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn ñực giống cũng ñược xác ñịnh là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sang bào thai Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ

giai ñoạn giữa thai kỳ trở ñi và virus cũng ñược bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi ñó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1-2 tháng

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể ñi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng

cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số chim hoang dã

Sự truyền lây qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus PRRS Ở Anh, vận chuyển lợn làm lây lan virus làm cho chính phủ phải ñề ra những hạn chế nghiêm ngặt trong việc vận chuyển lợn bệnh Các thống kê ñưa ra thang bậc sau ñể biểu thị khả năng truyền qua không khí xung quanh ñàn bị nhiễm:

- 57% các trại trong vòng 1 km bị nhiễm

từ những nguồn chưa xác ñịnh ñược

Các nghiên cứu ñã gây bệnh qua ñường miệng cho vịt trời, ngan, gà lôi với khoảng 104 TCID50/ml virus PRRS Qua thí nghiệm có khả năng phân lập virus ở phân gà 5 ngày sau khi gây bệnh, gà lôi 5 ngày và 12 ngày, vịt trời khoảng 5 ngày Trong các thí nghiệm này triệu chứng lâm sàng không thấy ở bất kỳ loài chim nào và chúng không có sự thay ñổi phản ứng huyết thanh ñối với virus PRRS Nhưng có những nghiên cứu chứng minh rằng chim di trú

(như vịt trời) có thể bị nhiễm, bởi vậy chúng có khả năng truyền virus ñi xa [31]

Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản trong khi lợn con bị viêm ñường hô hấp phổ biến [19]

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí ñược coi như

là phương tiện truyền lây phổ biến nhất

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh

“Giống cơ chế của virus HIV”

Virus có ñặc ñiểm rất thích hợp với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào vùng phổi ðây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này

và phá huỷ nó Virus nhân lên ngay bên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết ñại thực bào (tới 40%) ðại thực bào bị giết chết nên sức ñề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng

bị nhiễm khuẩn kế phát

Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở ñàn lợn trong ổ dịch PRRS, ñặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan ñến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (PRV), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus [1]

Các nhà nghiên cứu ñã phân lập virus từ phổi, gan, lách và huyết thanh hoặc dịch cơ thể lợn con sinh ra cả sống và chết [8], nhưng không phân lập ñược từ thai chết khô, họ cũng phát hiện kháng thể chống virus PRRS ñặc hiệu trong dịch xoang ngực hoặc sữa ñầu Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền

bệnh qua nhau thai là phổ biến trong giai đoạn cuối kỳ chửa, nhưng cơ chế của giảm sinh sản cịn chưa được hiểu biết

Lợn nái cĩ virus trong huyết thanh sớm lúc 1 ngày sau khi tiêm truyền,

cĩ thể đốn là sau đĩ virus nhân lên ở đại thực bào phế nang Virus huyết kéo dài (lên tới 14 ngày) là điển hình ở lợn nái; vì vậy chúng cĩ đủ thời gian để tuần hồn máu đưa virus tới nhau thai Virus vượt qua nhau thai và nhiễm vào thai như thế nào? Terpstra và cs gợi ý rằng đại thực bào cĩ thể đi qua nhau thai, nhưng tính cơ học cần thiết đưa ra liệu virus cĩ liên quan đến đại thực bào cao trong máu hay khơng cịn chưa biết rõ Liệu virus giết thai như thế nào? Những bệnh tích cịn ít được quan sát trong thai bị bệnh Cĩ thể đốn là virus nhân lên trong mơ sống làm chết thai Virus PRRS đã được tiêm vào trong tử cung cĩ thai 45- 49 ngày tuổi đã chứng minh rằng ở giai đoạn giữa thời kì mang thai giúp virus nhân lên nhưng chúng ít khi vượt qua nhau thai ở giai đoạn này [40], [41]

Người ta đã phân lập virus từ đại thực bào phế nang, phổi, tim, thận, não, lách, hạch lâm ba, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi, huyết tương và huyết thanh Virus huyết cĩ thể phát hiện ngay 1 ngày sau khi tiêm truyền, tuy nhiên 28 ngày phổ biến hơn Cịn chưa biết rõ rằng liệu các cơ quan trên cĩ phải là nơi nhân lên của virus hay khơng hay chỉ đơn thuần do kết quả dịng máu đưa vào các mơ Các nghiên cứu đã báo cáo rằng nồng độ virus cao hơn trong phổi, hạch lâm ba phế quản và tuyến ức so với nồng độ trong huyết thanh, nhưng sự cơng bố vẫn chưa quyết định vì trong invitro chỉ cĩ tế bào lợn sơ cấp được báo cáo là để giúp virus sinh sơi là đại thực bào phế nang

Hình 2.5 ðại thực bào bệnh lý Hình 2.6 ðại thực bào bình thường

2.4 Triệu chứng và bệnh tích

2.4.1 Triệu chứng của lợn mắc PRRS

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn các nhà khoa học ñã cho rằng: triệu chứng lâm sàng của lợn rất thay ñổi và phụ thuộc vào các chủng virus, trạng thái miễn dịch của ñàn cũng như ñiều kiện quản lý chăm sóc [43]

• Ở lợn nái

Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 40-41oC, một

số con tai chuyển màu tím trong thời gian ngắn, tím ñuôi, tím âm hộ, sảy thai

ở giai ñoạn ñầu Lợn nái trong giai ñoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước, viêm vú, mất sữa, ñộng dục lẫn lộn (5-10 ngày sau khi sinh) nái chậm lên giống nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn ñến tử vong [29] ðỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, ñẻ non, thai chết lưu, thai gỗ hàng loạt Lợn con ñẻ ra yếu ớt tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

• Lợn ñực giống

Khi bị nhiễm bệnh lợn thường bỏ ăn, sốt cao, ñờ ñẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tượng tai chuyển thành màu tím ðặc biệt xuất hiện

hiện tượng viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém Lợn ñực giống rất lâu mới hồi phục ñược khả năng sinh sản

• Lợn con theo mẹ

Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chóng rơi vào tình trạng tụt ñường huyết

do không bú ñược, mắt có dử màu nâu, sưng mí mắt và các màng quanh mắt, trên da xuất hiện những ñám phồng rộp, tiêu chảy, chân choãi ra, ñi run rẩy, lợn con rất dễ mắc các bệnh kế phát và tỷ lệ tử vong cao

• Lợn con cai sữa và lợn choai

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ Trong những trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp

xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt,

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử

và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

• Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ ñỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện ñối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám ñỏ, rắn, chắc Mô phổi lồi ra và có màu ñỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như ñá granito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi ñã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách cĩ màu thẫm hơn so với bình thường, bệnh tích khơng đặc trưng tuỳ thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bĩn thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn bị tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt

cĩ phủ một lớp nhầy màu nâu

• Lợn con theo mẹ

Thể xác gầy, ướt Các biến đổi ở phổi giống như các loại lợn khác Ruột chứa nhiều nước, thành ruột mỏng và đơi khi thấy cĩ một số cục sữa vĩn khơng tiêu

2.5 Chẩn đốn và phịng trị bệnh

2.5.1 Chẩn đốn

Dựa vào những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh Trong phịng thí nghiệm cĩ thể dùng phản ứng Immunoperoxidase (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm, phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5 -28 ngày sau khi nhiễm [37]

và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm, phản ứng ELISA phát hiện kháng thể 3 tuần sau khi tiếp xúc Ngồi ra cĩ thể dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạn đầu của pha cấp tính)

để xác định sự cĩ mặt của virus, đây là phản ứng tương đối nhạy và chính xác

2.5.2 Các biện pháp phịng trị bệnh

Hiện nay chưa cĩ thuốc đặc trị với PRRS, điều trị chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuơi, chữa các triệu chứng lâm sàng và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát

ðể phịng bệnh cần thực hiện nghiêm ngặt những quy trình phịng bệnh trong thú y:

• ðảm bảo chất lượng con giống

• Vệ sinh môi trường chăn nuôi, ñảm bảo ngăn ngừa sự xâm nhập các chủng virus vào trang trại

• Vệ sinh, làm khô các phương tiện vận chuyển sẽ giảm ñược sự lây nhiễm PRRSV

• Tiêm phòng vacxin ñịnh kỳ theo hướng dẫn của cơ quan chức năng

• Năng cao năng lực của cán bộ thú y và ý thức của người chăn nuôi

Một số chế phẩm vacxin PRRS ñược dùng ñể phòng bệnh hiện nay

Vacxin BSL-PS1000

Là vacxin nhược ñộc ñông khô thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc họ Châu Mỹ, một liều chứa ít nhất 105TCID50/ml Có ñộ an toàn rất cao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều

Vacxin Amervac-PRRS (nhà sản xuất Laboratorias HIPRA, Tây Ban Nha)

Là vacxin nhược ñộc dạng ñông khô, chứa virus PRRS chủng Châu Âu VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103,5TCID50/ml

2.6 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

2.6.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ñược Kary mullis và cộng

sự phát minh ra vào năm 1985 Kỹ thuật này tiếp tục ñược hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzym tổng hợp DNA

chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy

chu kỳ nhiệt cho phép thay ñổi nhanh chóng và chính xác nhiệt ñộ cho từng giai ñoạn phản ứng Trong PCR thông thường sau 20 – 30 vòng có tới hàng

triệu phân tử được copy từ một phân tử DNA (1 đoạn gen)

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase -Polymerase Chain Reaction) trước khi tiến hành PCR thơng thường RNA cần được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (enzym sao mã ngược) Phương pháp PCR như vậy được gọi là RT-PCR Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong chẩn đốn nhanh và định type virus cĩ nhân di truyền là RNA

Hình 2.7 Mơ hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), cần cĩ enzym DNA polymerase và một số điều

kiện cần thiết cho sự tổng hợp như Mg2+

Tuy nhiên khác với sự tổng hợp trong cơ thể, việc mở xoắn kép vốn

được thực hiện nhờ enzym helicase nay được thay thế bằng xử lý nhiệt độ cao kết hợp với sử dụng enzym DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt

thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng với những đoạn mồi được thiết kế hồn tồn chủ động, dẫn đến sự tạo thành số lượng sản phẩm (đoạn DNA được nhân) rất lớn trong khoảng thời gian ngắn và phục vụ hiệu quả mục đích của con người

2.6.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ được lặp đi lặp lại mỗi chu

kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Phân tử DNA được biến tính ở 94 - 95 0C trong khoảng thời gian

từ 30 giây đến 1 phút, trong quá trình biến tính DNA sợi kép được dãn xoắn thành 2 đoạn DNA mạch đơn

Bước 2: Là giai đoạn mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuơn hay cịn gọi là giai đoạn lai Nhiệt độ để mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuơn thường từ 400C – 70 0C, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút tuỳ thuộc vào mồi và DNA sợi khuơn tương ứng

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp nên đoạn DNA mới ở giai đoạn này nhiệt độ được nâng lên 72 oC đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt động để tổng hợp nên sợi ADN mới trên cơ sở mồi đã được bắt cặp bổ xung với DNA sợi khuơn Thời gian cho bước này cĩ thể kéo dài từ 30 giây cho tới nhiều phút tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Bước 4: Hồn thiện sản phẩm DNA dưới dạng sợi đơi

2.7 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Giải trình tự bộ gen người, động vật

và vi sinh vật giúp chẩn đốn bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản

xuất, phục vụ lợi ắch con người Có 3 nhóm phương pháp giải trình tự gen chủ yếu: phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự ựộng

2.7.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert

Nguyên lý:

Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự theo phương pháp hóa học Tạo mạch khuôn DNA trên cơ sở ựánh dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗvà biến tắnh phân tử DNA thành các mạch ựơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch ựơn ựã ựánh dấu phóng xạ ựược phân vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học ựặc hiệu ựể phân cắt các mạch ựơn thành các ựoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotide Cuối cùng, ựiện di sản phẩm phân giải DNA thu ựược trong gel polyacrylamide Di ựộng của các ựoạn DNA trong ựiện trường phụ thuộc vào

ựộ dài của chúng, nhờ ựó xác ựịnh ựược trình tự nucleotide Phương pháp này hầu như không còn ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác

Các bước thực hiện

Bước 1: đánh dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗcủa mạch khuôn, biến tắnh và ựiện di tách lấy 1 mạch DNA làm mạch khuôn ựể xử lý hóa học

Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu

Có thể sử dụng 4-5 ống nghiệm ựể thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu khác nhau

Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất ựịnh các mạch ựơn DNA

khuôn ñã ñánh dấu phóng xạ và ñược xử lý hóa học ñặc hiệu khác nhau tạo ra các ñoạn DNA bị cắt dài ngắn khác nhau

Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm ñem chạy ñiện di, hiện hình phóng xạ và xác ñịnh kết quả

Bước 4: Tập hợp kết quả thu ñược ở tất cả các ống nghiệm, thu ñược các ñoạn polynucleotide dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide từ ñó xác ñịnh ñược trình

tự của mạch DNA khuôn

2.7.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy

Nguyên lý

Xác ñịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith

và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong

cơ thể sinh vật F sanger ñã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kí sinh vi khuẩn E.coli (1977), là bộ gen ñầu tiên ñược xác ñịnh trình

tự Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ñặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp Nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA ñang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphotphas nhưng lại không tiếp tục kết hợp ñược với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo Như vậy khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzyme polymeraze Kết quả sẽ cho một loạt các ñoạn DNA ñược kết thúc một cách ñặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotid và sẽ thu ñược các ñoạn DNA có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide Chạy ñiện

di các ñoạn ta có thể xác ñịnh ñược trình tự ñoạn DNA nghiên cứu

Các bước thực hiện

Bước 1: Biến tính DNA khuôn, ñiện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) thu các mạch ñơn DNA

Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA

lấy 4 ống eppendorf cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống ( DNA khuôn, mồi có ñánh dấu phóng xạ, enzyme DNA polymeraze và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch ñệm thích hợp) Bổ sung vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (1%) một loại ddNTP nhất ñịnh (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)

Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt Bước 4: ðiện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch ñơn DNA ñược tổng hợp ñể xác ñịnh trình tự của mạch khuôn

Phương pháp giải trình tự gen do F Sanger và cộng sự phát minh có ñộ chính xác tương ñối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự ñộng

2.7.3 Giải trình tự DNA bằng máy tự ñộng

Máy thực hiện tổng hợp các mạch ñơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, ñồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính ñể xử lý kết quả giúp kiểm soát ñược các sai sót, ñảm bảo ñộ chính xác cao

Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị DNA khuôn

Bước 2: Chuẩn bị các ñiều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA và

thực hiện nhân DNA bằng thiết bị PCR

Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy Trong quá trình hoạt ñộng của máy các nucleotide ñược kiểm soát nhờ detecter báo

về bộ phận xử lý của máy, phần mềm xử lý kết quả và vẽ ñồ thị của các loại nucleotide ñi qua detecter

Bươca 4: Phân tích kết quả từ các dự liệu do máy tính cung cấp, so sánh kết quả xác ñịnh trình tự ở cả 2 mạch ñơn mới, ñồng thời căn cứ vào ñồ thị ñể sửa các sai sót và chọn kết quả ñúng nhất

3 ðỐI TƯỢNG - ðỊA ðIỂM - NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng

Nghiên cứu ñược tiến hành trên ñối tượng là các lợn mắc PRRS, các chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ñược phân lập ở vùng phụ cận Hà Nội

3.3 Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lựa chọn mẫu virus PRRS cho nghiên cứu

- Thực hiện giải trình tự ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu

- Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin

- Tiến hành so sánh trình tự axit amin của ñoạn gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng virus vacxin

- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của các nhóm virus PRRS ñang lưu hành tại vùng phụ cận Hà Nội