Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus care (canine distemper) phân lập từ chó nuôi tại hà nội và vùng phụ cận

So sánh trình tự nucleotide của ñoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu .... So sánh trình tự axitamin của ñoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu .... Thống kê các nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-
-

ðÀO THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN

TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-
-

ðÀO THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN

TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ựược sử dụng ựể bảo vệ một học vị nào Tôi xin cam ựoan rằng, mọi sự giúp ựỡ cho việc hoàn thành luận văn này ựã ựược cảm ơn, các thông tin trắch dẫn trong luận văn ựã ựược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

đào Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, tôi ñã trưởng thành và nâng cao về nhân cách, trình ñộ chuyên môn Tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo ñặc biệt

là các Thầy, Cô Khoa Thú y ñã truyền dạy kiến thức chuyên môn cũng như tư cách ñạo ñức của người Bác sỹ thú y, của một tri thức trẻ trong thời ñại mới Nhân dịp hoàn thành luận văn cao học cho phép tôi ñược bày tỏ hơn nữa lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo

Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan - Bộ môn

Bệnh Lý, Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, người hướng dẫn khoa học - người ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn ðồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn ñến các anh chị Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ sinh học Thú y; các Thầy, Cô trong Bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam ñã tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn này

Xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè - những người

ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

1 MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu của ñề tài 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu 4

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước 5

2.2 Căn bệnh học 6

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care 6

2.2.2 Hình thái của virus Care 7

2.2.3 Cấu trúc của virus Care 7

2.2.4 Sức ñề kháng của virus Care 8

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh 9

2.3 Dịch tễ học 11

2.3.1 Loài vật mắc bệnh 11

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh 11

2.3.3 Mùa vụ thường xảy ra bệnh 11

2.4 Truyền nhiễm học 12

2.4.1 Chất chứa virus 12

2.4.2 ðường xâm nhập và phương thức lây lan 12

2.4.3 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết 12

2.5 Triệu chứng bệnh tích 13

2.5.1 Triệu chứng lâm sàng 13

2.5.2 Bệnh tích 15

2.6 Chẩn đốn bệnh 17

2.6.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh 17

2.6.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng 17

2.6.3 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm 18

2.7 Phịng và điều trị bệnh 21

2.7.1 Phịng bệnh 21

2.7.2 ðiều trị 23

2.8 Kỹ thuật giải trình tự gen 24

2.8.1 Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert 24

2.8.2 Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy 26

2.8.3 Giải trình tự gen bằng máy tự động 27

3 ðỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 ðối tượng nghiên cứu 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả lựa chọn mẫu nghiên cứu 37

4.2 Kết quả giải trình tự đoạn gen H (Heamaglutinine) của các chủng virus Care 45 4.2.1 Kết quả phản ứng RT-PCR 45

4.2.2 Kết quả giải trình tự đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 46

4.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 48

4.4 Kết quả so sánh trình tự axit amin của ñoạn gen H của các chủng virus

nghiên cứu với chủng virus vacxin 55

4.5 Sự tương ñồng về nucleotide và axit amin của ñoạn gen H giữa các chủng virus Care nghiên cứu 58

4.6 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 59

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 ðề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

I.TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62

II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp RT-PCR các chĩ nghi mắc bệnh Care 42

Bảng 4.5 Sự tương đồng về nucleotide và axit amin của đoạn gen H giữa các chủng virus Care nghiên cứu (%) 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc của virus Care 7

Hình 4.1 Chó nghi mắc bệnh Care có biểu hiện mệt mỏi, ủ rủ 38

Hình 4.2 Chó nghi mắc bệnh Care có nhiều rử mắt 38

Hình 4.3.Chó tiêu chảy phân màu cafe 38

Hình 4.4 Xuất hiện nốt sài ở vùng da mỏng 38

Hình 4.5 Xoang ngực tích nước 41

Hình 4.6 Dạ dày, ruột chứa ñầy hơi 41

Hình 4.7 Phổi bị hoại tử, gan hóa 41

Hình 4.8 Lách hoại tử ñen 41

Hình 4.9 Gan, mật sưng 41

Hình 4.10 Dạ dày chứa dịch màu vàng 41

Hình 4.11 CPE do CDV gây ra sau 24 giờ gây nhiễm 44

Hình 4.12 CPE do CDV gây ra sau 36giờ gây nhiễm 44

Hình 4.13 CPE do CDVgây ra sau 48 giờ gây nhiễm 44

Hình 4.14 Tế bào Vero –DST bình thường 44

Hình 4.15: Kết quả phản ứng RT- PCR 45

Hình 4.16 Giản ñồ giải trình tự tự ñộng thành phần nucleotide của ñoạn gen Haemagglutinin của virus Care 47

Hình 4.17 So sánh trình tự nucleotide của ñoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 52

Hình 4.18 So sánh trình tự axitamin của ñoạn gen H của các chủng virus Care nghiên cứu 56

Hình 4.19 Cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus Care nghiên cứu 59

DNA : Deoxyribonucleic acid

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium

EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetat Acid

PBS : Dung dịch muối ñệm Phot phat

PPRV : Peste des Petits Ruminants Virus

FBS : Foetal Bovine Serum

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

RT-PCR : Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction SLS : Sample loading solution

TBE : Tris Borate EDTA

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Bệnh Care hay còn gọi là bệnh sài sốt chó là một bệnh truyền nhiễm cấp

tính nguy hiểm của loài chó, do virus Care (Canine Distemper Virus–CDV) gây

ra Virus Care ở chó ñược phát hiện từ thế kỷ XVIII, ñược tìm thấy ở Peru thuộc Châu Á, bệnh phân bố khắp thế giới Năm 1905, căn bệnh ñược bác sĩ thú

y người Pháp tên là Henri Carré phân lập ñược từ nước mũi của chó bệnh lọc qua giấy lọc vi khuẩn sau ñó gây bệnh thực nghiệm cho chó Vì vậy, bệnh này ñược gọi là bệnh Care (theo tên nhà khoa học) (David T Swith, 1979)

Bệnh Care xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, không những ở chó nuôi

mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care mà không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn

Ở Việt Nam, bệnh Care ñược phát hiện từ năm 1920 ðến nay, bệnh xảy

ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao Canine distemper virus (CDV) là nguyên nhân gây nên bệnh Care CDV thuộc họ Paramixoviridae, giống Morbillivirus và có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên và ñặc tính sinh học với virus gây bệnh sởi ở người và virus dịch tả trâu bò CDV có kích thước tương ñối lớn, ñường kính từ 150 - 250 nm, với cấu trúc xoắn, nhân là một RNA sợi ñơn, có vỏ Lipoprotein Virus Care chỉ

có một serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng ñược phân lập từ chó nuôi ở nhiều khu vực ñịa lý khác nhau trên thế giới và có những ñặc trưng riêng ðể ñối

phó với căn bệnh này, nhiều nước trên thế giới trong ñó có Việt Nam ñã sử dụng vacxin nhằm khống chế bệnh Tuy nhiên, bệnh Care vẫn xảy ra và gia tăng ở nhiều nước Tỷ lệ chó ñã ñược tiêm vacxin phòng bệnh Care nhưng vẫn mắc bệnh này ngày càng tăng ở các nước như: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, một số nước châu Âu Ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường xuyên ở những chó chưa tiêm phòng và một số chó ñã tiêm phòng Vì thế vấn ñề ñặt ra là liệu có phải ñã xuất hiện các virus Care biến chủng mới có ñặc tính khác với virus vacxin khiến việc

sử dụng vacxin phòng bệnh kém hiệu quả hay không? Hay là do một nguyên nhân khác? Vì vậy, việc tìm hiểu các ñặc tính sinh học phân tử của virus Care phân lập ñược trong thời gian gần ñây là cơ sở cho việc chọn chủng virus chế vacxin phòng bệnh hiệu quả, ñồng thời ñưa ra các biện pháp khống chế bệnh nhằm làm giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra, giảm thiệt hại cho người chăn nuôi

Bộ gen của virus Care là sợi RNA ñơn gồm khoảng 15,7 kb, mã hóa cho 6 loại protein bao gồm: L large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M)

Trong ñó protein H giữ vai trò quan trọng trong việc gắn virus vào tế bào ñích, có nhiệm vụ là kênh protein màng tế bào và cũng có thể giữ vai trò

là protein kháng nguyên màng của virus (Bolt et al., 1997) Thêm vào ñó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng H protein là một trong những protein dễ biến ñổi nhất của virus vì vậy mà người ta thường sử dụng ñoạn gen này ñể ñánh giá những biến ñổi di truyền giữa các chủng virus Care (Hashimoto et

al, 2001; Lednicky et al, 2004) ðoạn gen H chứa một khung ñọc mở mã hóa cho khoảng 607 axit amin (Hyoko Hirama et al., 2004) Do ñó việc nghiên cứu ñặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care dựa trên trình tự nucleotide của ñoạn gen H là cần thiết ñể hiểu về mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus nghiên cứu Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên

cứu ñề tài: “Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học phân tử của virus Care (Canine distemper) phân lập từ chó nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận”

1.2 Mục tiêu của ñề tài

Làm rõ một số ñặc tính sinh học phân tử chủ yếu, sự tương ñồng về trình

tự nucleotide, axit amin và mối quan hệ di truyền của virus Care phân lập từ chó nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới

Bệnh Care hay bệnh sài sốt chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao ðây là một căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa ñầu thế kỷ XIX Tỷ lệ mắc bệnh lớn nhất ở chó con 3 - 6 tháng tuổi, khi miễn dịch chủ ñộng từ mẹ truyền sang ñã giảm thì tỷ lệ mắc bệnh từ 25% tới trên 30% và tỷ lệ chết ở chó mắc bệnh thường cao từ 50% - 90% Chó mắc bệnh này thấy tổn thương lớn ở hệ tiêu hoá ñặc biệt ở dạ dày và ruột, hệ thần kinh trung ương và hệ hô hấp (Vương ðức Chất và cs, 2004) Bệnh Care ñược báo cáo lần ñầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie,1972) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh ñã ñược mô tả

từ năm 1809 bởi EdwardJenner (Appel and Gillespie, 1972) Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré ñã phân lập ñược mầm bệnh từ nước mũi của chó

bị bệnh Ông ñã ñem lọc mẫu bệnh phẩm qua màng lọc vi khuẩn và ñem gây bệnh thực nghiệm cho chó khỏe mạnh khác thì thấy vẫn gây ñược bệnh Vì thế, ông kết luận nguyên nhân của bệnh là do virus Sau này, người ta lấy tên ông ñể ñặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David and Martin, 1979)

Sau ñó năm 1923, Putoni lần ñầu tiên chế vacxin nhược ñộc, tuy nhiên

VR vacxin này ñộc lực vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học nhiều vacxin phòng bệnh Care có hiệu quả ra ñời Các công trình nghiên cứu về sự liên quan kháng nguyên giữa virus Care và virus sởi ở người, giữa virus Care và virus dịch tả trâu bò, của J.M Dams Pgoret

ñã mở rộng ra ñược nhiều triển vọng cho việc phòng bệnh Care bằng cách

dùng virus dịch tả trâu bò và virus sởi theo nghiên cứu của Merchant trong giai ñoạn 1961 – 1969

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi

mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care nhưng không biểu hiện triệu chứng rõ ràng ñã trở thành mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Qua thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005) Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư

tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn (Timothy và cs, 2009)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước

Ở Việt Nam, bệnh ñược phát hiện từ năm 1920 Cho ñến nay, bệnh xảy ra

ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Ở nước ta, bệnh Care cũng ñược nhiều nhà thú y quan tâm Các nghiên cứu của họ nhận thấy chó mắc bệnh Care sẽ xuất hiện các triệu chứng ñặc trưng: sốt, viêm phổi, viêm ruột và các nốt sài ở vùng da mỏng Cuối thời kỳ của bệnh thường có triệu chứng thần kinh Sự kế phát của vi khuẩn ký sinh sẵn

có ở ñường tiêu hóa, hô hấp thường làm cho bệnh trầm trọng thêm Bệnh thường thể hiện ở hai dạng: viêm phổi và viêm ruột Khi mắc bệnh Care con vật có biểu hiện sốt rất cao trên 400C Tất cả các giống và lứa tuổi ñều mẫn cảm với bệnh Care tuy nhiên giống chó ngoại và chó non thì mẫn cảm hơn…( Tô Du và Xuân Giao, 2006) Nguyễn Thị Lan và cs ñã nghiên cứu thành công ñặc tính sinh trưởng

cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Qua ñó tác giả cũng chỉ ra tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng ñể phân lập và xác ñịnh hiệu giá virus (Lan et al., 2005)

Như vậy các công trình nghiên cứu ở nước ta mới cho thấy cái nhìn tổng quát về bệnh, còn những nghiên cứu về gen và trình tự ñoạn gen của virus Care gây bệnh trên chó rất ít

2.2 Căn bệnh học

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care

Canine Distemper Virus là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc

họ Paramixoviridae Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây bệnh sởi trên người (MV), virus dịch tả trâu bò (RPV), virus gây bệnh trên ñộng vật nhai lại nhỏ (PPRV), virus gây bệnh trên ñộng vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999) Virus Care cũng gây bệnh ở ñộng vật hoang

dã ăn thịt và hổ (Appel and Summer, 1995; Frolich et al., 2000; Martella et al., 2002)

Morbillivirus là một virus tương ñối lớn (ñường kính 150 – 250nm) với cấu trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy et al, 1989)

Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV khác nhau nhưng nó thường ñược chấp nhận là chỉ có một serotype Tuy nhiên,

có sự khác biệt ñáng kể về khả năng gây bệnh của các chủng virus phân lập và các type ở các khu vực ñịa lý khác nhau ñã ñược nói tới Các type của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, ñộng vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ ñiển (Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas et al., 1997; 1999; Harder and Osterhaus, 1997; Martella et al., 2006; 2007; Yoshida et al, 1998) Bên cạnh ñó, dựa trên trình tự nucleotide của ñoạn gen mã hóa cho protein H, người ta ñã chia ra thành 5 type virus lớn ñược phân lập từ những vùng ñịa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ ñiển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA (Lan NT

et al., 2006)

2.2.2 Hình thái của virus Care

Hình thái virus quan sát ñược thấy dưới kính hiển vi ñiện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành Dạng tròn này có ñường kính ño ñược 115nm ñến 230nm Màng cuộn kép có ñộ dày 75 ñến 85Aovới bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al, 1989)

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc của virus Care

2.2.3 Cấu trúc của virus Care

Nucleocapside chứa một sợi ñơn RNA không phân ñoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide mã hóa cho 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein cấu trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

Protein không cấu trúc (C) ñược mã hóa từ một khung ñọc mở khác ở gen

P (Lamb and Kolakofsky, 2001) Chức năng của protein C chưa ñược xác ñịnh

rõ ràng

N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho hệ gen của virus Protein này rất nhạy cảm với những chất phân giải protein

P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, ñóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu

et al, 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, ñóng vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 –

62 kDa, ñóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn ñến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, ñóng vai trò gắn virus vào tế bào ñích Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu

L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do có kích thước lớn, nó thể hiện phần lớn các hoạt ñộng của RNA polymerase (Diallo,

1990)

2.2.4 Sức ñề kháng của virus Care

Virus Care là một virus không ổn ñịnh và nhạy cảm với nhiệt ñộ, tia UV, dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Grone và et al, 1998) mặc

dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài

Năm 1954, Celiker và Gillespie dùng virus Care ñã thích nghi trên môi trường phôi trứng ñể nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến tính cảm nhiễm của virus

và tác giả ñã nhận thấy: Virus Care cực kỳ mẫn cảm với sức nóng Virus bị phá hủy

ở 50 - 600C trong 30 phút Trong mô cô lập nó tồn tại ñược ít nhất một giờ ở 370C và

3 giờ ở 200C (nhiệt ñộ phòng) Thời tiết ấm áp virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó sau khi chó bị bệnh ñược chuyển ñi

Thời gian sống và duy trì ñộc lực của virus sẽ lớn hơn trong ñiều kiện nhiệt

ñộ lạnh Ở nhiệt ñộ dưới 00C, nó có thể tồn tại trong môi trường vài ngày nếu

ñược bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ (Greene và Appel, 2006) Dưới nhiệt ñộ ñóng băng virus ñược ổn ñịnh Virus tồn tại ñược ở nhiệt ñộ -650C ít nhất là 7 năm Việc bảo quản virus ở dạng ñông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất vacxin và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

ðộ pH: virus ổn ñịnh ở pH = 4,5 – 9

Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, chloroform, fomalin loãng (<0.5%), phenol (75%) Do vậy, khi dùng những chất này ñể tiêu ñộc chuồng nuôi mang lại hiệu quả cao

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh

Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho niêm mạc và

mô thần kinh ðầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp Sau ñó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết Virus tác ñộng ñến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày Virus theo máu vào hệ

hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác Virus tấn công vào hệ bạch huyết (hệ thống phòng vệ quan trongjcuar cơ thể) ñã làm suy giảm khả năng miễn dịch của cơ thể, tạo ñiều kiện cho các vi khuẩn như: Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, gây bệnh Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng

Theo Carter và cs, 1992, trong quá trình phơi nhiễm tự nhiên, CDV lây lan qua ñường khí dung vào biểu mô ñường hô hấp trên Trong 24 giờ nó sẽ nhân lên trong ñại thực bào và lan rộng ra nhờ hệ lympho cục bộ ñến hạch amidal và các hạch lympho phế quản Sau 2 - 4 ngày số lượng virus tăng ở hạch amidal và hạch sau hầu, hạch lympho khí quản Nhưng chỉ có một số ít tế bào ñơn nhân bị nhiễm CDV Sau 4 - 6 ngày virus nhân lên trong tế bào lympho ở lách, biểu mô

dạ dày và ruột non, màng treo ruột và trong tế bào Kuffer ở gan Sự lây lan của

virus trong các hệ lympho là nguyên nhân gây pha sốt ñầu tiên và virus ñã phá huỷ các tế bào lympho (lympho B, lympho T) dẫn tới chứng giảm bạch cầu Ngày thứ 8 và 9 sau khi nhiễm, virus theo máu tới thần kinh trung ương, chó có biểu hiện thần kinh hay không, phụ thuộc vào miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Quá trình bài thải ra ngoài bắt ñầu khi virus có mặt ở biểu mô và thông qua chất bài tiết của cơ thể thậm chí khi chó chỉ mắc bệnh nhẹ

Ngày thứ 14 sau nhiễm, với chó có hàm lượng kháng thể cao và tế bào T ñộc sẽ giúp loại bỏ virus khỏi cơ thể chó vì vậy chó sẽ không có triệu chứng lâm sàng Kháng thể IgG-CDV sẽ trung hoà hết CDV và ức chế lây lan của CDV giữa các tế bào

Với chó có khả năng ñáp ứng miễn dịch bị suy giảm thì lượng kháng thể sẽ giảm sau 9 - 14 ngày sau nhiễm, sau ñó virus sẽ lây lan tới các biểu mô làm cho chó có các biểu hiện lâm sàng Các triệu chứng này có thể sẽ bị loại bỏ khi hàm lượng kháng thể tăng trở lại Tuy nhiên, thời gian khỏe mạnh của chó không kéo dài lâu khi virus xâm nhập vào mô thần kinh và da như da bàn chân Sự hồi phục của các chó sau khi bị nhiễm sẽ có miễn dịch lâu dài Khi phơi nhiễm lại với virus ñộc lực cao, số lượng lớn các chó này ở trong tình trạng stress

Với chó có sức ñề kháng kém, từ ngày 9 - 14 sau nhiễm, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội, ngoại tiết, trong mô dạ dày, ruột, ñường hô hấp, niệu quản Triệu chứng lâm sàng của bệnh thường nặng và virus tồn tại lâu dài trong các mô tới khi con bệnh chết Trình tự lây lan của virus phụ thuộc vào chủng virus và có thể ngừng lại sau 1 - 2 tuần

Nghiên cứu về huyết thanh học cho thấy, chỉ có những chó tạo ra ñược kháng thể kháng vỏ của virus mới có khả năng tránh ñược virus tồn tại trong cơ thể và ñặc biệt là ở hệ thần kinh trung ương Hậu quả của nhiễm trùng thần kinh trung ương phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể IgG trong tuần hoàn do kháng nguyên H-glyco tạo nên Các chó mắc bệnh mà kế phát vi khuẩn thì thường có

các biểu hiện khác nhau ở thần kinh trung ương và gây nên các biến chứng khác

ở ựường hô hấp, tiêu hoá

2.3 Dịch tễ học

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên tất cả các giống chó ựều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội (Trần Thanh Phong, 1996) Virus Care cũng gây bệnh ở ựộng vật hoang dã ăn thịt (Appel và cs, 1995; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002) Năm 1987, người ta phát hiện virus Care ở hải cẩu (Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt ựược ựặt tên PDV1

và PDV2 (Phocin Distemper virus) Năm 2006, người ta thấy bệnh Care trên khỉ nâu châu Âu nuôi trong trại Quảng đông Trung Quốc Qua phân tắch trình tự axit amin của virus tại thực ựịa cho thấy ựây là chủng virus cường ựộc (Wei Qiu và cs, 2011)

Trong phòng thắ nghiệm, có thể gây bệnh cho chó con và chồn Ngoài ra,

có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ ựể gây nhiễm

2.3.3 Mùa vụ thường xảy ra bệnh

Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó ựều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là chó lai, chó cảnh, chó nội ắt mẫn cảm hơn Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi

có sự thay ựổi thời tiết ựặc biệt là những ngày mưa, ựộ ẩm cao Ở Việt Nam, bệnh thường xảy ra vào thời ựiểm giao mùa, từ xuân sang hè

2.4 Truyền nhiễm học

2.4.1 Chất chứa virus

Trong cơ thể chó mắc bệnh Care, virus thường có trong máu, phủ tạng, các chất bài tiết, ựặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus Các cơ quan tập trung nhiều virus ở chó mắc Care như: não, lách, phổi, hạch lympho, tuỷ xương theo nghiên cứu của Lan và cs (2005)

2.4.2 đường xâm nhập và phương thức lây lan

Chó mắc bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết của cơ thể như phân, nước tiểu, nước mũi, các dịch tiếtẦ và khuếch tán vào không khắ trong các giọt nước nhỏ Từ ựó, virus dễ dàng xâm nhập vào thức ăn, nước uống Bệnh Care có tắnh chất lây lan rất cao, các chó tiếp xúc trực tiếp với chó mắc bệnh, với chất bài tiết chứa virus hay thông qua thức ăn, nước uống có nhiều mầm bệnh thì dễ mắc bệnh đặc biệt, virus còn có thể xâm nhập vào cơ thể qua da (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978)

Mặc dù virus ựược bài tiết ra ngoài môi trường qua hầu hết những dịch tiết của cơ thể nhưng ắt khi tìm thấy virus trong nước tiểu của chó bệnh Theo

Hồ đình Chúc (1993) dịch tiết ở ựường hô hấp do chó mắc bệnh ho bắn ra có thể gây bệnh cho các con chó khác

Trong phòng thắ nghiệm, có thể ựưa virus vào cơ thể của ựộng vật thử nghiệm theo con ựường tiêm, uống, bôi vào niêm mạc mũi ựều gây ựược bệnh

làm cho tỷ lệ chết càng cao (Vương đức Chất và Lê Thị Tài, 2004; Tô Du và Xuân Giao, 2006)

2.5 Triệu chứng bệnh tắch

2.5.1 Triệu chứng lâm sàng

Theo Greene và Appel (1987), biểu hiện của bệnh thường rất ựa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khoẻ, chế ựộ chăm sóc nuôi dưỡng và ựộc lực của mầm bệnh

Sốt thường xảy ra từ 3 ựến 6 ngày sau khi chó nhiễm virus Care Thời kỳ nung bệnh cho tới khi bắt ựầu xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh Care cấp tắnh thường từ 14 ựến 18 ngày Sau khi nhiễm bệnh, một cơn sốt ngắn xảy

ra từ ngày thứ 4 tới ngày thứ 7 nhưng không có triệu chứng rõ rệt của bệnh Care Thân nhiệt trở lại bình thường sau ựó từ ngày 7 ựến ngày 14, sau ựó thân nhiệt lại tăng cao kèm theo viêm kết mạc và viêm mũi Tiếp theo là ho, ỉa chảy, nôn mửa, biếng ăn, mất nước và giảm cân với sự suy nhược thường quan sát thấy ở chó mắc bệnh Care cấp tắnh Dịch mũi và nước mắt chảy ra có mủ nhày Viêm phổi thường do bội nhiễm vi khuẩn Da bị phát ban có thể viêm mủ ở vùng da bụng Triệu chứng viêm não cấp tắnh có thể có những biểu hiện khác nhau: sự co thắt cơ vân theo nhịp (Myolonus), cơ vân bị vặn không theo ý muốn, thể hiện như dạng nhai kẹo cao su, vận ựộng không ựiều hòa và không phối hợp với nhau Phản ứng sợ hãi và mù là những triệu chứng thường thấy trong bệnh Care cấp tắnh

Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), chó mắc bệnh Care ựầu tiên xuất hiện các triệu chứng như: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ắt, không thắch vận ựộng, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa; sau ựó sốt, nhịp thở tăng, thân nhiệt lên ựến 40 Ờ 41,50C kéo dài từ 24 Ờ 26 giở rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5 - 39,50C Lúc này chó ăn

ắt, mệt mỏi 3 - 4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai đó là do sự bội nhiễm của

các vi khuẩn kế phát Cơn sốt kéo dài 3 - 4 ngày Lúc này chó bắt ñầu thể hiện các triệu chứng ở ñường hô hấp, tiêu hoá, da và thần kinh

- Triệu chứng ở ñường tiêu hoá:

Do viêm cata ở niêm mạc dạ dày và ruột non nên con vật khát, nôn mửa rồi ỉa chảy, lúc ñầu phân loãng, có bọt sau ñó có lẫn máu, phân có màu cà phê nhạt Trường hợp nặng, phân có thể lẫn máu tươi, niêm mạc ruột bong ra làm phân có mùi tanh khắm rất khó chịu Chó thường bị viêm niêm mạc miệng và hạch amidal

Nôn là triệu chứng thường gặp của bệnh Care Nôn thường xuất hiện sớm, lúc ñầu nôn ra thức ăn sau ñó nôn khan hoặc nôn ra bọt có màu vàng

- Triệu chứng ñường hô hấp:

Chó bị viêm mũi, thanh quản, phế quản rồi viêm phổi nên chó khó thở, nhịp thở tăng rõ, nghe phổi có tiếng ran ướt Con vật chảy nhiều nước mũi lúc ñầu loãng, sau ñặc dần, ñôi khi có mủ xanh hoặc máu ñen Chó bị ho, lúc ñầu ho khan, sau ho ướt, chó thở gấp, thè lưỡi ra ñể thở

Ngoài ra, chó bệnh thường xuyên có viêm mắt, chảy nước mắt Lúc ñầu nước mắt trong, sau ñặc dần như mủ, chó bị ñục, loét giác mạc

- Triệu chứng trên da:

ðặc trưng là sự xuất hiện các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong ñùi ðầu tiên, ở các vị trí da trên nổi những nốt chấm ñỏ, những chấm ñỏ ñó biến thành những nốt sài to bằng hạt ñỗ xanh, hạt gạo, lúc ñầu ñỏ sau bội nhiễm vi khuẩn nên mềm ra, có mủ, khi vỡ làm lông bết lại, hôi hám Các nốt sài có thể

vỡ ra hoặc không vỡ ra rồi hình thành vảy, bong ñi, ñể lại một vết thương nhanh chóng lành và không hình thành sẹo

Sau khi bị bệnh 10 - 15 ngày, ở 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn chân tăng sinh dày lên, có khi bị nứt ra làm cho chó ñi khập khiễng

- Triệu chứng thần kinh:

Quá trình tiến triển, con vật có thể thể hiện các triệu chứng thần kinh như ủ

rủ, buồn rầu hoặc hung dữ sau ñó là các cơn co giật ñều ñặn ở bắp thịt, mũi, tai, chân hoặc toàn thân, cuối cùng là liệt Con vật loạng choạng, ñứng lên, ngã xuống, ñâm sầm vào tường, sùi bọt mép Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ và chết Tỷ lệ chết có thể tới 60%, bệnh kéo dài 2- 5 tuần Những con lành bệnh thường có di chứng gầy còm, ñi xiêu vẹo, mù và ñiếc…

2.5.2 Bệnh tích

Theo Appel và Summer (1995), bệnh tích ñại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá da ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức ñộ kế phát các loại vi khuẩn mà

có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da

Bệnh tích ñường tiêu hóa: viêm cata niêm mạc ruột, loét ruột, ñám hạch lympho màng treo ruột sưng, gan thoái hóa mỡ

ðường hô hấp: viêm niêm mạc mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi mụn vỡ ra gây viêm phế mạc

Thần kinh: viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử

Tế bào thượng bì ñường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt

có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong nguyên sinh chất tế bào

Theo Carter và cs, (1992), chó mẹ có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu chứng toàn thân, tổn thương ñường hô hấp trên, viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản, viêm kết mạc mắt Chó con sơ sinh ñược sinh ra từ những chó mẹ chưa có kháng thể CDV mà bị nhiễm thì thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata

Biểu hiện sừng hoá lớp da ở mũi, bàn chân thường thấy ở chó có triệu chứng thần kinh Tổn thương nhẹ trung khu thần kinh, hiếm gặp sung huyết màng não, trong buồng não và tăng áp lực hệ thần kinh trung ương do phù não

Suy giảm tế bào lympho là bệnh tích ñiển hình ở chó có triệu chứng toàn thân Viêm kẽ phổi lan toả mà ñặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự

tăng sinh của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm các tế bào long vách phế nang và ñại thực bào Biểu mô ñường tiết niệu sưng phồng lên Chó con mắc bệnh sẽ bị hỏng men răng, hoại tử và thoái hoá tế bào tạo men răng

Viêm tinh hoàn thường thấy ở chó ñực mắc bệnh Care ðiều này có thể giải thích ñược sự giảm sinh tinh trùng, giảm chất tiết của tiền liệt tuyến sau khi hồi phục ở chó ñực

Chó sơ sinh mắc bệnh có bệnh tích viêm não cấp tính, thoái hoá tế bào thần kinh và phá huỷ myelin Những con sống sót, các vùng ñốm hoại tử thay vào bởi các tế bào sao phì ñại, nơi tạo thành mạch lưới do ñại thực bào hấp thu myelin Biến ñổi trầm trọng nhất là chất trắng ở thần kinh trung ương, biến ñổi

có thể tìm thấy trên cuống tiểu não sau, từ sừng lưng của tủy sống ñến buồng não IV Tổn thương cũng thấy ở não giữa và thuỳ thái dương của ñại não Các vùng khác như các bó thị giác, gấp nếp vỏ não, cách nhánh thần kinh bề mặt não, cũng bị ảnh hưởng

Ở một số chó, virus Care tấn công và chủ yếu gây ảnh hưởng ở ñại não và ñồi thị Trường hợp nặng, myelin có thể bị phá hủy tạo thành các không bào xốp

ở chất trắng hay viêm tế bào thần kinh ñệm Thể vùi trong bào tương và trong nhân chủ yếu tìm thấy ở tế bào sao và tế bào thần kinh

Ở một số chó có miễn dịch nhưng không ñủ ñộ bảo hộ nếu chó mắc bệnh Care thì bệnh tích chủ yếu là viêm não và giảm bạch cầu Những bệnh tích này thường ñược biểu hiện bởi các triệu chứng như mất thăng bằng và rối loạn tiền ñình Khi quan sát trên kính hiển vi các tiêu bản từ bệnh phẩm là não thì thấy bệnh tích vi thể ñặc trưng là sự lan rộng của những ñám lympho bào xung quanh vùng myelin và thần kinh bị thoái hoá Các ñám lypho bào có thể lan rộng và trầm trọng hơn ở trường hợp viêm não cấp tính Trường hợp mạn tính, tổn thương có thể phát triển thành xơ cứng trong não ñặc trưng bởi sự lắng cặn và thay thế của các mô thần kinh bởi các mạng lưới các tế bào sao dày ñặc

ðối với các chĩ chưa được tiêm vacxin mà bị mắc bệnh Care thì bệnh tích đại thể đặc trưng là viêm não dẫn tới hoại tử não với vùng ưu tiên là sừng bụng Thể vùi cĩ thể tìm thấy trong nhân hoặc bào tương của tế bào sao và tế bào thần kinh

Kiểm tra tổ chức học bằng kính hiển vi thường thấy thể vùi CDV trong bào tương và nhuộm màu axit, cĩ đường kính 1 - 5µm Chúng ta thường tìm thấy thể vùi ở tế bào biểu mơ của bạch cầu, tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh chính thức Thể vùi thường được tìm thấy sau khi chĩ bị nhiễm bệnh 5 - 6 tuần

Hình thái thể vùi vẫn chưa được biết rõ Bằng phương pháp hố tổ chức cho thấy thể vùi được tạo ra từ sự kết hợp giữa vỏ nucleocapsid của virus và cặn của các tế bào do virus Care phá hủy Chúng ta cũng khơng thể khẳng định hồn tồn là cĩ bệnh Care khi chỉ cĩ sự xuất hiện của thể vùi Thể vùi đặc trưng trong bào tương khi nhiễm CDV cũng xác định được ở tế bào niêm mạc bàng quang của chĩ bình thường

Sự hình thành tế bào khổng lồ đầu tiên trong chất trắng của thần kinh trung ương và tiếp đĩ là hạch lympho, phổi, lớp màng não mỏng là đặc trưng nhất của bệnh Care Những phát hiện bệnh lý này cĩ thể sử dụng để chẩn đốn chính xác sự nhiễm CDV (Greene và Appel, 1987)

2.6 Chẩn đốn bệnh

2.6.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chĩ 2 tháng tuổi đến 12 tháng tuổi, ở thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi đột ngột, độ ẩm cao hoặc lạnh

2.6.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn đốn bệnh Care thể cấp tính và á cấp tính cĩ thể dựa vào bệnh sử và triệu chứng lâm sàng Khi cĩ những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh thì

cĩ thể nghi ngờ chĩ mắc bệnh Care Ở những chĩ chưa tiêm phịng hoặc chĩ

trưởng thành không ựược tiêm phòng ựầy ựủ có những triệu chứng như: sốt, chảy nước mũi, ho, có dử mắt và có thêm các triệu chứng trên ựường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ đình Chúc, 1993)

Trong quá trình chẩn ựoán bệnh Care dựa vào triệu chứng lâm sàng cần phân biệt với những bệnh thường gặp ở chó sau ựây:

Bệnh viêm gan truyền nhiễm: Bụng chướng to, sờ nắn vùng gan thấy con vật rất ựau ựớn Giác mạc ựục hơn, có thể như Ộcùi nhãnỢ

Bệnh do Parvovirus: Gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết do hoại tử tế bào thượng bì nhung mao ruột Chó thường ỉa chảy phân loãng như nước và có máu tươi Con vật chết rất nhanh, không có triệu chứng thần kinh

Bệnh do Leptospira: Viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và thường xuất hiện ở chó lớn Triệu chứng ựặc trưng là vàng da và niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng

2.6.3 Chẩn ựoán trong phòng thắ nghiệm

Tìm thể Lents

Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch niêm mạc mắt hay mũi của chó bị bệnh, làm tiêu bản, ựem nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE), tìm tiểu thể Lents bằng kắnh hiển vi Cần chú ý, ở não, thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (Blixenkrone-Moller et al., 1993)

Chẩn ựoán virus học

Tiêm truyền bệnh phẩm cho ựộng vật thắ nghiệm

Mẫu bệnh phẩm là lách, gan, phổi của chó nghi mắc bệnh ựem nghiền, sau ựó bổ sung PBS ựể chế thành huyễn dịch và tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm

Ưu tiên sử dụng chồn hoặc chó non, ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát triệu chứng lâm sàng của bệnh trên ựộng vật thắ nghiệm, mổ

khám quan sát bệnh tích đại thể và kết luận

Phân lập virus trên mơi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên mơi trường

tế bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi cĩ gắn receptor đặc hiệu cho virus Care) Virus Care chỉ cĩ thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào

(Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp Bệnh tích tế

bào do CDV gây ra cĩ thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuơi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuơi cấy nhiều ngày (Lan và cs, 2005)

Chẩn đốn bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)

ELISA(Enzim linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét

nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết quả đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, cĩ sử dụng kháng thể cĩ gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra

sự kết hợp đĩ (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009)

Chẩn đốn bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch

Nhuộm hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp

cĩ độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nghuyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam, 2011)

Chẩn đốn bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno fluorescent test) cĩ độ chính xác cao, dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh

sáng cĩ bước sĩng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng cĩ bước sĩng dài hơn) Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên – kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

Chẩn đốn phát hiện RNA của virus Care bằng RT- PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain

Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp

PCR Phương pháp này cĩ thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khĩ cĩ thể phát hiện bằng phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong PCR khơng hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT) Sau đĩ, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus

Sự hiện diện của sản phẩm này được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan

và cs, 2008)

Chẩn đốn phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đốn nhanh

Hiện nay, nhiều phịng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, đơn giản, tiện dụng và cĩ độ chính xác cao

Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, nước mắt và nước mũi của chĩ Hai kháng thể

đơn dịng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhĩm quyết định kháng nguyên khác nhau của virus Care Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm Cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dịng thứ nhất Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dịng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hồn chỉnh Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp “sắc ký miễn dịch”

Ưu điểm của thiết bị này là cĩ độ nhạy cao, cĩ thể chẩn đốn bệnh sớm trong thời gian đầu của bệnh, khi mà các triệu chứng lâm sàng chưa thể hiện rõ Mặt khác phương pháp này dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết tương, huyết thanh, nước mắt và nước mũi ðọc kết quả phản ứng sau

5 - 10 phút

2.7 Phịng và điều trị bệnh

2.7.1 Phịng bệnh

Phịng bệnh bằng vệ sinh

Nuơi dưỡng, chăm sĩc tốt, cho chĩ ăn đầy đủ dinh dưỡng và vệ sinh sạch

sẽ nơi ở của chĩ là những biện pháp tốt để tăng sức đề kháng tự nhiên của cơ thể chĩ đối với bệnh

Những chĩ ốm phải nuơi cách ly, chuồng chĩ ốm phải tiêu độc bằng thuốc sát trùng, xử lý chất bài tiết và thức ăn nước uống thừa của chĩ bệnh

Chĩ mới mua về phải kiểm tra kỹ hồ sơ, nuơi cách ly, theo dõi ít nhất 10 ngày, nếu khơng thấy cĩ biểu hiện của bệnh mới cho nhập đàn

Phịng bệnh bằng tiêm phịng vacxin

Tiêm vacxin là biện pháp phịng bệnh phổ biến hiện nay đối với các bệnh

do virus gây ra nĩi chung, trong đĩ cĩ bệnh Care Vacxin phịng bệnh Care được tiêm lần đầu cho chĩ lúc 2 tháng tuổi, trong những trường hợp chĩ cĩ nguy cơ lây nhiễm cao thì cĩ thể tiêm phịng sớm hơn Tiêm nhắc lại sau mũi đầu tiên 2

ñến 4 tuần Sau ñó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần ñể ñảm bảo khả năng bảo hộ

Theo Greene và Appel (1987), Kháng thể thụ ñộng truyền qua nhau thai

và sữa ñầu có tác dụng bảo vệ cho chó con sau sinh và cai sữa Lượng kháng thể giảm một nửa sau 8.4 ngày Có 3% kháng thể truyền qua nhau thai và 97% truyền qua sữa ñầu, kết quả cho thấy rằng hiệu giá ban ñầu ở chó con mới sinh bằng 77% lượng kháng thể ở con mẹ Nếu không có sự hấp thu sữa ñầu chó con

có thể ñược bảo vệ ít nhất 1 - 4 tuần Kháng thể bị ñộng hấp thu từ sữa mẹ thường biến mất sau 12 - 14 tuần tuổi

Chó khỏi bệnh sau khi mắc bệnh tự nhiên hoặc ñược tiêm vacxin, miễn dịch có thể kéo dài hàng năm Sự bảo vệ ñó có thể ñược bảo ñảm nếu chó không

bị phơi nhiễm với virus ñộc lực cao, số lượng lớn, stress Sau khi tiêm một mũi ñơn vacxin Care cho chó chưa ñược tiêm bất kỳ một mũi vacxin phòng bệnh Care nào thì hiếm khi tạo ra ñược miễn dịch kéo dài quá 1 năm Vì lý do này, mặc dù có kháng thể thụ ñộng từ sữa ñầu của chó mẹ thì chó con phải ñược tiêm

ít nhất 2 mũi vacxin phòng bệnh Care cách nhau 2 - 4 tuần khi chó con ñược 2 tháng tuổi Chó trưởng thành vẫn có thể bị nhiễm Care, vì vậy phải tiêm vacxin phòng bệnh Care ñịnh kỳ mỗi năm 1 lần

Lượng kháng thể sẽ giảm dần sau khi lượng kháng thể ñạt ngưỡng tối ña nhưng ngưỡng bảo hộ của vacxin phòng bệnh Care có thể kéo dài ít nhất 1 năm Vacxin vô hoạt không tạo ra ñược miễn dịch ñầy ñủ ñể chống lại bệnh sau khi công cường ñộc nhưng nó vẫn có tác dụng bảo hộ tốt hơn so với chó không ñược tiêm vacxin Nhưng hiện nay vacxin vô hoạt vẫn ñược bán và sử dụng trên thị trường Vacxin vô hoạt thường bị mất một vài gluco-protein bề mặt do vậy không tạo ra ñáp ứng miễn dịch khi công cường ñộc

Mặc dù ñã có những thành công khi tiêm vacxin phòng bệnh Care nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy chó khỏi bệnh Care sau khi nhiễm bệnh tự nhiên hoặc

cho tiếp xúc lâu dài với virus Care không còn ñộc lực thì chó vẫn có ñáp ứng miễn dịch

Sự nhiễm Parvovirus vẫn ñược cho là nguyên nhân làm giảm khả năng sản sinh kháng thể của chó khi tiêm vacxin phòng bệnh Care ðồng thời việc chủng vacxin chống bệnh do Parvovirrus cũng ñược cho là gây ức chế ñáp ứng miễn dịch khi tiêm ñồng thời với vacxin phòng bệnh Care Những minh chứng

về ñiều này còn chưa ñầy ñủ nên ñược nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan

tâ (Greene and Appel, 1987)

Hiện nay, trên thị trường thuốc thú y Việt Nam, vacxin phòng bệnh Care cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và nhập khẩu từ nước ngoài Thống kê từ danh mục vacxin và chế phẩm sinh học ñược phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới 17 loại vacxin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) ñể phòng và trị bệnh này Trong ñó có sự tham gia của những tên tuổi lớn như Intervet- Hà Lan, Merial- Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc, PFRIZER - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ

Xí nghiệp Thuốc thú y trung ương (Vetvaco) ñã chế ñược vacxin phòng bệnh Care từ chủng virus nhược ñộc ñông khô, sản xuất qua môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus

2.7.2 ðiều trị

Dùng kháng huyết thanh: liều 15 – 30 ml/con, tiêm sớm Khi con vật ñã

có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không

có tác dụng

Ở các cơ sở ñiều trị theo các bước sau ñây:

Cắt nôn bằng cách tiêm atropin hay primeran 2 ml, tiêm dưới da

Bổ sung nước và chất ñiện giải bằng cách cho uống Ozeron 5%, tiêm nước muối sinh lý 0,9% hay nước ñường Glucoza 5% vào tĩnh mạch khoeo của chó

Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc đặc trị tiêu chảy chĩ mèo Imodium uống 1 viên (chĩ to hay bé đều uống 1 viên) sau 12h mà chĩ vẫn tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2; Bisepton: uống nửa viên đối với chĩ nhỏ, chĩ to uống 1 viên, uống cho tới khi khỏi tiêu chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10 kgP

Chống kế phát vi khuẩn bằng cách tiêm các loại kháng sinh: Gentamycin: tiêm bắp liều 8 – 10 mg/kgP, 2 lần/ ngày; Streptomycin: tiêm bắp liều 10 – 20 mg/kgP, 2 lần/ ngày

An thần cho chĩ: dùng các loại thuốc cĩ tính chất an thần như: Seduxen: chĩ nhỏ uống 1 viên/ ngày, chĩ to 2 viên/ngày trong 3 ngày; Meprobamat: chĩ nhỏ uống 1 viên/ ngày, chĩ to 2 viên/ngày trong 3 ngày

Trợ sức, trợ lực cho chĩ: sử dụng các thuốc trợ tim mạch, trợ sức, trợ lực, cầm máu cho chĩ như: Cafein, Spartein, Vitamin B1, Vitamin B12, Vitamin K, Vitamin C

2.8 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Giải trình tự bộ gen người, động vật và

vi sinh vật giúp chẩn đốn bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ích con người Cĩ 3 nhĩm phương pháp giải trình gen chủ yếu: Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (cịn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

2.8.1 Giải trình tự gen theo phương pháp Maxam và Gilbert

• Nguyên lý:

Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hĩa học Tạo mạch khuơn DNA theo cơ sở đánh

dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ và biến tắnh phân tử DNA thành các mạch ựơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch ựơn ựã ựánh dấu phóng xạ ựược cho vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học ựặc hiệu ựể phân cắt các mạch ựơn thành các ựoạn ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide Cuối cùng ựiện di sản phẩm phân giải DNA thu ựược trong gel polyacrylamide Di ựộng của các ựoạn DNA trong ựiện trường phụ thuộc vào ựộ dài của chúng nhờ ựó xác ựịnh ựược trình tự nucleotide Phương pháp này hầu như không ựược sử dụng ngày nay do ựộ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót ựể chọn một kết quả gần ựúng nhất nhưng nó là tiền ựề cho các phương pháp giải trình tự khác

Ớ Các bước thực hiện

Bước 1: đánh dấu ựồng vị phóng xạ P32 ựầu 5Ỗ của mạch khuôn, biến tắnh

và ựiện di tách lấy 1 mạch DNA làm mạch khuôn ựể xử lý hóa học

Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu

Có thể sử dụng 4-5 ống nghiệm ựể thực hiện các phản ứng hóa học ựặc hiệu khác nhau

Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất ựịnh các mạch ựơn DNA khuôn ựã ựánh dấu phóng xạ và ựược xử lý hóa học ựặc hiệu khác nhau tạo ra các ựoạn DNA bị cắt dài ngắn khác nhau

Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm ựem chạy ựiện di, hiện hình phóng xạ và xác ựịnh kết quả

Bước 4: Tập hợp kết quả thu ñược ở tất cả các ống nghiệm, thu ñược các ñoạn polynucleotide dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide từ ñó xác ñịnh ñược trình tự của ñoạn DNA khuôn

2.8.2 Giải trình tự gen theo phương pháp Dideoxy

• Nguyên lý

Xác ñịnh trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger (F.Sanger), Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzym hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật F.Sanger ñã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kí sinh vi khuẩn E.Coli (1977) là bộ gen ñầu tiên ñược xác ñịnh trình tự Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc ñặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA ñang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không tiếp tục kết hợp ñược với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo Như vậy khi trộn một lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzym polymerase Kết quả sẽ cho một loạt các ñoạn DNA ñược kết thúc một cách ñặc hiệu bởi gốc dideoxynucleotide và sẽ thu ñược các ñoạn DNA

có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide Chạy ñiện di các ñoạn có thể xác ñịnh ñược trình tự ñoạn DNA nghiên cứu

• Các bước thực hiện

Bước 1: Biến tính DNA khuôn, ñiện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung

ure) thu các mạch ñơn DNA

Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA

Lấy 4 ống eppendorff, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống (DNA khuôn, mồi có ñánh dấu phóng xạ, enzym DNA polymerase và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch ñệm thích hợp) bổ sung vào mỗi ống

tương ứng một lượng nhỏ (1%) các loại ddNTP nhất ñịnh (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)

Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt Bước 4: ðiện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch ñơn DNA

ñược tổng hợp ñể xác ñịnh trình tự của mạch khuôn

Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có ñộ chính xác tương ñối cao, là cơ sở hoạt ñộng của các máy giải trình tự gen tự ñộng

2.8.3 Giải trình tự gen bằng máy tự ñộng

Máy thực hiện tổng hợp các mạch ñơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, ñồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính ñể xử lý kết quả giúp kiểm soát ñược các sai sót ñảm bảo ñộ chính xác cao

• Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị DNA khuôn

Bước 2: Chuẩn bị các ñiều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA và

thực hiện nhân DNA bằng thiết bị PCR

Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy

Trong quá trình hoạt ñộng của máy, các nucleotide ñược kiểm soát nhờ detecter báo về bộ phận xử lý của máy, phần mềm xử lý kết quả và vẽ ñồ thị của các loại nucleotide ñi qua detecter

Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp, so sánh kết

quả xác ñịnh trình tự ở cả 2 mạch ñơn mới, ñồng thời căn cứ vào ñồ thị ñể sửa các sai sót Và chọn kết quả chính xác nhất