ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU_NUOI CAY MO THUC VAT

Ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng trong tạo hình cây nuôi cấy in vitro. Ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro. Ánh sáng xanh lơ hoặc tím kích thích việc tạo chồi, ánh sáng đỏ cảm ứng việc sinh tạo rễ. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000lux. Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ ánh sáng tăng khoảng từ 3000 lux đến 10000 lux.

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM

Khoa Công nghệ Sinh học & KTMT

Bộ môn Nhập môn Công nghệ Sinh học

Mục lục 2

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ 4

Nuôi cấy mô thực vât 5

I Tổng quan 5

1 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy mô thực vật 5

2 Khái niệm nuôi cấy mô thực vật 5

2.1 Nhân giống vô tính 5

2.2 Vi nhân giống 6

3 Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 7

3.1 Điều kiện nuôi cấy 7

3.1.1 Nhiệt độ 7

3.1.2 Độ ẩm 7

3.1.3 Ánh sáng 7

3.1.4 Đất 7

3.2 Môi trường nuôi cấy 7

3.3 Dụng cụ thiết bị 8

3.4 Nguồn nuôi cấy mô thực vật: 8

4 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật 8

4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: 8

4.2 Nuôi cấy mô sẹo 8

4.3 Nuôi cấy tế bào đơn 9

4.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen 9

4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 9

II Ý nghĩa công nghệ nuôi cấy mô thực vật 9

1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản 9

2 Về mặt thực tiễn 10

2.1 Nhân giống cây trồng 10

2.2 Chọn tạo giống 10

2.3 Trong lĩnh vực khác 10

III Quy trình nuôi cấy cây Hông 10

1 Giới thiệu cây hông 11

2 Phương pháp nhân giống trong phòng thí nghiệm 12

2.1 Vật liệu và phương pháp tiến hành 13

2.3.1 Vật liệu 13

2.3.2 Phương pháp 13

2.2 Quy trình nhân giống cây Hông 14

3 Kết quả 16

IV Kết luận về công nghệ nuôi cấy mô thực vật 17

1 Ưu điểm và hạn chế của công nghệ nuôi cấy mô thực vật 17

2 Tình hình phát triển 18

3 Đề xuất 18

Tài liệu tham khảo 23

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

CÔNG VIỆC

MỨC ĐỘ HỢP TÁC

CHỮ KÝ

Trần Hoài Tâm 2008120179 Phần I4, II3.4.5 Tốt

Nguyễn Lê Hoài Nhân 2008120086 Tổng hợp word Tốt

Nguyễn Văn Lâm

2008130033 Phần I, I1,I2 TốtNguyễn Lê Trâm Anh 2008130007 Phần II2.4.1.2.3, Tốt

Trần Thị Diệu Hiền 2008120001 Phần IV.1,2 Tốt

Nguyễn Hiếu Thuyên 2008130022 Phần I3 Tốt

Trần Thị Kim Chỉ 2008130014 Phần III2.4.4.5,

III3 TốtPhạm Thị Phi Yến 2008130281 Phần III1.2.3 Tốt

Nuôi cấy mô thực vât

I Tổng quan

1 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy mô thực vật

- 1902: Haberlandt đưa ra ý kiến cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể và đưa vào ốngnghiệm (in vitro)

- 1919: Mô động vật được cấy đầu tiên bởi A.Carrel

- 1934: White phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua

- 1964: Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rể từ việc nuôi cấy chồi ngọn

- 1951: Skoog và Miller phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi

- 1962: Murashige và Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy và sử dụng rộng rãi cho đếnngày nay

- 1960 – 1964: Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng

2 Khái niệm nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kĩ thuật nuôi cấy những tế bào thực vật, hay môphân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào haynhững cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm

2.1 Nhân giống vô tính

Sinh sản vô tính tự nhiên: Trong tự nhiên, thực vật có khả năng tạo những cơ thể

mới từ một bộ phận của thân bò (Sinh sản vô dâu tây, rau má), thân rễ (cỏ gấu), thân củ

(khoai tây), lá cây (thuốc bỏng), rễ củ (khoai lang)

Sinh sản vô tính nhân tạo: là sự sinh sản, trong đó con người chủ động nhân lên

hoặc tạo ra cơ thể mới từ một bộ phận cắt rời của cơ thể bố hoặc mẹ Các dạng sinh sản

vô tính nhân tạo gồm: giâm (cành, lá, rễ), chiết (cành), ghép (cành, chồi), nuôi cấy mô tếbào

Sau đây là một số hình thức nhân giống vô tính nhân tạo:

 Chiết: là hình thức tạo rễ trên một đoạn của cành khi còn gắn với cây, sau đó cắt

rời cành có rễ để được một cây nguyên vẹn

 Ghép: là sự chuyển cơ quan hoặc mô ở thực vật, động vật và người Ở thực vật

ghép cây là một kỹ thuật quan trọng trong nghề làm vườn, trong đó một phần (cành ghép)của một cá thể này được đem phối hợp (ghép nối, ghép nêm, ghép dưới vỏ gần gốc) vớimột phần cây khác (gốc ghép) có thể cùng loài hoặc khác loài Sau một thời gian chỗghép sẽ liền lại và gốc ghép sẽ nuôi cành ghép lớn lên thành một cá thể mới mang đặctính chung của hai cá thể gốc ghép và cành ghép

 Giâm: là việc cắt một đoạn thân hoặc cành

của cây mẹ rồi cắm hoặc vùi xuống cát hoặc đất pha

cát để nó mọc rễ đâm chồi thành một cây mới Đây là

phương pháp trồng chủ yếu đối với các cây sắn, mía,

dâu tằm, rau muống, khoai lang,…

 Nuôi cấy mô tế bào:là kĩ thuật cấy và nuôi mô, tế bào động - thực vật bằng môi

trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình thuỷ tinh

2.2 Vi nhân giống

Nhân giống in vitro (invitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống

(micropropagation) là việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật ở

điều kiện vô trùng trong các ống

Một số sản phẩm:

Hình 2:Cây sứa-Dallbergia tonkinensis Hình 3:Hoa cát tường-Eustoma grandiflorum sp

3 Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật

.1 Điều kiện nuôi cấy

3.1.1 Nhiệt độ

Trong quá trình tiến hành có thể tối ưu hóa nhiệt độ cho mỗi giai đoạn sinh trưởng.Nhiệt độ chung thường được điều chỉnh 22±20C Trong đó,nhiệt độ 200C ±10C dành chocây ôn đới, nhiệt dộ 250C ±10C dành cho cây nhiệt đới

.1.2 Độ ẩm

Độ ẩm tương đối trong bình chứa có thể được kiểm soát bởi các phương tiện khácnhau như sự thông khí, làm lạnh dưới đáy, nồng độ agar.

.1.3 Ánh sáng

Ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng trong tạo hình cây nuôi cấy in vitro Ánhsáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro Ánhsáng xanh lơ hoặc tím kích thích việc tạo chồi, ánh sáng đỏ cảm ứng việc sinh tạo rễ

Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000lux Tronggiai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ ánhsáng tăng khoảng từ 3000 lux đến 10000 lux

.1.4 Đất

Môi trường để cấy cây con,cần chú ý điều kiện pH đất, độ giữ ẩm, độ thoáng khí và dinh dưỡng cần chú ý

.2 Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùngmột mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thayđổi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy

Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần:

 Khoáng đa lượng: N, P, K, Mg, S, Ca, với hàm lượng thường lớn hơn 30mg/l

có vai trò tạo các mô tế bào xây dựng thành phần cấu trúc

 Khoáng vi lượng: Fe, Mo, Mn, B, I, Co, Zn,…với hàm lượng mỗi nguyên tố nhỏ

hơn 30mg/l Chúng là thành phần của coenzyme để xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ratrong tế bào

 Vitamin: là vitamin dễ hòa tan trong nước như B1, B2, B3, B5, B6,… với hàm

lượng từ một đến một vài mg/l Chúng là thành phần của coenzyme tham gia vào xúc táccác phản ứng sinh hóa

 Đường (nguồn carbon): thường là đường mía saccaroza với nồng độ

20-30g/l(một số trường hợp còn sử dụng đường maltoza, glucoza, lactoza,…)

 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Auxin, Cytokinin, Giberilin, giúp điều

khiển được quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thể hiện được tính toàn năng của

tế bào trong môi trường nuôi cấy tế bào

.3 Dụng cụ thiết bị

 Dụng cụ: Bình tam giác (250 mL), Ống nghiệm, Nắp đậy, Giấy cấy vô trùng,

Ống đong thủy tinh, Bécher (cốc đốt thuỷ tinh) 500 mL, 1000 mL; Forceps (kẹp), daocấy, đèn cồn, Đĩa petri vô trùng,

 Thiết bị: Autoclave, Tủ sấy, Tủ cấy (laminar), Tủ lạnh, Máy điều hòa nhiệt độ,

Máy lắc nằm ngang, Tử ấm, Hệ thống đèn chiếu, Tủ sấy 60-2000C, Cân kỹ thuật, cânphân tích, Máy cất nước 1 lần, 2 lần; Máy khuấy từ, pH kế; Máy kỹ thuật số; Kính hiển vi

2 mắt (độ phóng đại 1000 lần), Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần),

.4 Nguồn nuôi cấy mô thực vật: Có thể dùng lá, thân, rễ hay chồi, để tiến

hành nuôi cấy mô thực vật

4 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật

4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên.

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủchất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kíchthích sinh trưởng

Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ pháttriển thành một hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thànhmột cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần thích nghi và phát triển bìnhthường

4.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóacủa các tế bào đã phân hóa, đặc biệt khi môi trường có auxin Khối mô sẹo có khả năngtái sinh thành cây hoàn chỉnh khi môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện cho những loài thực vật không có khả năng nhângiống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

4.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn được tách ra từ khối mô sẹo khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng

và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp Sau đó, tế bào đơn được lọc và nuôicấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

4.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellolose, có sức sống và duytrì đầy đủ các chức năng sẵn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào,tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật)

4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo Môsẹp này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

II Ý nghĩa công nghệ nuôi cấy mô thực vật

1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản

 Tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống

 So sánh các đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể

 qui luật về mối tương quan giữa các bộ phận trong cây

 Phân biệt từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của

cá thể  tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về qui luật sinh trưởng, phát triển, quan hệgiữa chúng với môi trường…và chủ động điều khiển sự phát triển của cây trồng theo ýmuốn

 Biết được nguyên nhân gây bệnh và đưa ra biện pháp phòng bệnh cho cây trồng

2 Về mặt thực tiễn

Kỹ thuật nhân giống in vitro ưu việt hơn phương pháp khác:

 Sử dụng mô nuôi cấy nhỏ

 Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp

 Có hệ số nhân giống cao và cá thể đồng nhất về mặt di truyền

Nuôi cấy tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nhưng đã đóng góp nhiềuthành tựu to lớn trong lĩnh vực chọn tạo giống, nghiên cứu tính di truyền – cơ chế sinh

tổng hợp của thực vật, Hàng loạt cây trồng có phẩm chất tốt, năng suất cao được ra đời,như: mía, lúa, cà phê, khoai tây, phong lan,

2.1 Nhân giống cây trồng

 Nuôi cấy mô các giống cây khó nhân giống hữu tính như phong lan hồ điệp, câymật nhân, cây ba kích, giúp lưu trữ nguồn gen thực vật quý hiếm

 Phục tráng giống: nhằm hồi phục những cây bị nhiễm virut, tạo cây sạch bệnh, nâng cao năng suất và góp phần cải tiến chất lượng các hoạt chất sinh học

 Nhân nhanh giống với số lượng lớn trong một thời gian ngắn

2.2 Chọn tạo giống

 Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu và tái sinh, góp phần tạo các sản phẩm mới

 Tạo các thể biến dị soma, làm phong phú thêm nguồn gen của thực vật

 Nuôi cấy đơn bội

 Tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại virut, vi khuẩn, ) từ cây mẹ nhiễm bệnh

 Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

III Quy trình nuôi cấy cây Hông

1 Giới thiệu cây hông

Phân loại:

- Tên khoa học: Paulownia

Phân bố địa lý, sinh thái:

- Cây hông phân bố ở Việt Nam, Trung Quốc, Lào Ở Việt Nam, cây hông phân bố ởCao Lạng (Cao Lộc, Lộc Bình, Bắc Sơn, Bình Gia,…), Bắc Thái, Yên Bái, Lạng Sơn,Hoà Bình,

- Hông là cây ưa sáng, ưa khí hậu mát mẻ Thường thấy mọc ở vùng đồi núi thấp,

độ cao từ 300-1300m so với mặt biển Cây thường gặp ở bìa rừng hoặc trong trảng câybụi và thường mọc thành đám, tốt nhất là chân núi, ven các bản làng, đất ẩm, sâu dày

Giá trị:

 Kinh tế: Gỗ hông không bị rạng nứt trong quá trình sấy, dễ bắt màu do đó dễ

nhuộm màu và gỗ rất khó bị mục, gõ hông cách nhiệt tốt và điểm bắt lửa cao đến 4000C

gỗ nhẹ, thông gió tốt Theo các nhà đầu tư trồng cây hông giá trị thị trường quốc tế của

gỗ hông là600-1000 USD/m3

 Dược liệu: hoa và trái cây hông có tác dụng trị bệnh suyễn.

 Công dụng khác: Lá và hoa paulownia giàu nitơ và nguồn dinh dưỡng quý, làm

thứ ăn cho gia súc, phân bón cây Đồng thời, hoa có mùi hương dịu có thể được dùngtrong hương liệu và mỹ phẩm

2 Phương pháp nhân giống trong phòng thí nghiệm

Ngoài tự nhiên, cây được nhân giống chủ yếu bằng hạt, nhưng cây mầm nhỏ nênkhó sống cần phải có phương pháp chăm sóc chu đáo Ở nước ta, đặc biệt là ở phía nam

không có hạt để gieo và lượng cây được trồng cũng còn rất ít nên việc nhân giống bằngchồi rễ không thể đáp ứng một lượng lớn cây đáp ứng nhu cầu.

2.2.1 Nuôi cấy mô

Ở nước ta, Viện sinh học nhiêt đới đã nhập và tiến hành nhân giống cây paulowniabằng phương pháp vi giâm cành sau đó tạo được trong môi trường MS/2 có bổ sung BAPcũng tạo được cây hoàn chỉnh Người ta có thể sử dụng:

- Phôi hữu tính để tạo và nuôi cấy mô sẹo, sau đó tạo phôi trực tiếp từ mô sẹo

- Trục hạ diệp của cây non trồng bằng hạt trong điều kiện in-vitro tạo chồi trực tiếp

- Đỉnh sinh trưởng tạo thành cây

- Nuôi cấy chồi nách tạo ra cây

- Chồi tạo rễ trực tiếp

2.2.2 Phương pháp quang tự dưỡng: Không sử dụng đường, vitamin và các chất

điều hoà sinh trưởng Trong nuôi cấy có sục khí CO2

 Nguyên tắc phương pháp:

Thông qua 1 máy bơm khí, CO2 được đưa vào lồng nuôi cấy Cường độ CO2 đưavào được điều chỉnh bằng 1 van và đồng hồ đo tốc độ Để hạn chế vi sinh vật và các nấmbệnh có thể nhiễm vào không gian nuôi cấy, CO2 được lọc qua 1 lớp màng lọc milipore

và lượng CO2 thoát ra khỏi lồng nuôi cấy thông qua một lỗ thoát, giúp cho CO2 luôn đượcluân chuyển, cung cấp đủ lượng CO2 cần thiết cho cây xanh quang hợp và phát triển

 Vật liệu: Sử dụng 1,4kg florialite cho mô nuôi cấy (Florialite là hỗn hợp sợi

cellulose và vermiculite là một hợp chất trơ để giúp hệ thống rễ phát triển do công tyMinoru Sangyo Nhật Bản sản xuất)

 Mẫu cấy: đốt thân từ cây trong ống nghiệm

 Môi trường: Môi trường lỏng MS ½ không đường và không vitamin Thể tích

môi trường là 38 ml mỗi cây Tốc độ trao đổi khí là 0,15 lần/giờ (Kozai và cộng sự 1986)

Điều kiện nuôi cấy:

 Cường độ ánh sáng: 145 μmol.m-2s-1

 Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

 Nồng độ CO2 phòng nuôi cấy: 150±50μmol.mol-1

 Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 26 ± 20C

 Ẩm độ phòng nuôi cấy: 60 – 70%

 Thời gian nuôi cấy: 28 ngày

2.1 Vật liệu và phương pháp tiến hành

2.3.1 Vật liệu

Mẫu cấy: Từ cây trồng ngoài thiên nhiên, chọn cây khoẻ manh phát triển tốt

không sâu bệnh Mẫu cấy là đốt thân, phiến lá non, cuống lá lấy từ ngọn đến cặp lá thứ tưtính từ trên xuống

Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng đa lượng và vi

lượng bằng ½ thành phần khoáng của môi trường MS (MS/2: Murashige và Skoog 1962)

Môi trường bổ sung:

Đoạn thân của cây con ngoài thiên nhiên cắt thành từng đoạn 4-6 cm

Rửa bằng nước Savon loãng

Lắc mẫu trong cồn 70% trong 1 phút

Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng

Sau đó mẫu được xử lý bằng dung dịc hypochloric Calcium với nồng độ 1% trong 20phút

Cấy mẫu

Trong tủ cấy vô trùng, mẫu cấy được rửa với nước cất vô trùng 3 lần, cắt bỏ cácphần bị trắng do tác dụng của hypochlorid Calcium Các đoạn thân được cắt thành đốtriêng lẻ và cấy đứng trong môi trường.

Điều kiện nuôi cấy:

Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 20C

Cường độ chiếu sáng: 2800 – 3000 lux

Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày

Ẩm độ trung bình: 70%

2.2 Quy trình nhân giống cây Hông

Quy trình nhân giống cây hông Paulownia fortunei hemsl bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro