ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU_NUOI CAY TE BAO DONG VAT

Hiện nay, nhiều căn bệnh nguy hiểm xuất hiện ở người, đòi hỏi việc nghiên cứu tìm ra cách chữa bệnh là rất cần thiết nhưng các kết quả nghiên cứu trên động vật không phải lúc nào cũng được ứng dụng mở rộng cho con người. Vì vậy, nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm là xu hướng được khuyến khích hiện nay. Việc lựa chọn những điều kiện thích hợp cho nuôi cấy mô tế bào động vật để thu kết quả tốt nhất đang được quan tâm và phát triển. Bên cạnh đó, nuôi cấy tế bào gốc cũng đang là công việc được cộng đồng xã hội và các nhà khoa học quan tâm đặc biệt. Vì những đặc tính hiếm có mà tế bào này sở hữu cũng như khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau. Tế bào gốc trung mô (MSC) là một ví dụ điển hình. Các MSC này có khả năng biệt hóa thành tế bào sụn, xương, mỡ,…phục vụ cho nhiều nghiên cứu nhằm phục hồi các khiếm khuyết bẩm sinh hay mắc phải trên cơ thể con người. Các tế bào gốc trung mô được xác định đã xuất hiện ở nhiều loài, kể cả người. Những hiểu biết về MSC ngày càng tăng. Do vậy có thể khảng định rằng, MSC đã và sẽ có những ứng dụng to lớn trong liệu pháp gen cũng như nhiều công nghệ khác.

Trang 1

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

************************

NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI : NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT GVHD: TRẦN HOÀNG NGÂU

SVTH: NHÓM 7

Nguyễn Thi Trúc Phương 2008120162

Tp HCM, 11/2014

Trang 2

MỤC LỤC

III.ỨNG DỤNG VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

2

Trang 3

LỜI NÓI ĐẦU

Hiện nay, nhiều căn bệnh nguy hiểm xuất hiện ở người, đòi hỏi việc nghiên cứu tìm racách chữa bệnh là rất cần thiết nhưng các kết quả nghiên cứu trên động vật không phảilúc nào cũng được ứng dụng mở rộng cho con người Vì vậy, nuôi cấy tế bào động vậtđể làm mô hình thử nghiệm là xu hướng được khuyến khích hiện nay Việc lựa chọnnhững điều kiện thích hợp cho nuôi cấy mô tế bào động vật để thu kết quả tốt nhấtđang được quan tâm và phát triển

Bên cạnh đó, nuôi cấy tế bào gốc cũng đang là công việc được cộng đồng xã hội vàcác nhà khoa học quan tâm đặc biệt Vì những đặc tính hiếm có mà tế bào này sở hữucũng như khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau Tế bào gốc trung mô(MSC) là một ví dụ điển hình Các MSC này có khả năng biệt hóa thành tế bào sụn,xương, mỡ,…phục vụ cho nhiều nghiên cứu nhằm phục hồi các khiếm khuyết bẩmsinh hay mắc phải trên cơ thể con người

Các tế bào gốc trung mô được xác định đã xuất hiện ở nhiều loài, kể cả người Nhữnghiểu biết về MSC ngày càng tăng Do vậy có thể khảng định rằng, MSC đã và sẽ cónhững ứng dụng to lớn trong liệu pháp gen cũng như nhiều công nghệ khác

Bài tiểu luận gồm có hai nội dung chính:

Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào động vật

Nuôi cấy tế bào gốc trung mô (MSC)

Dù đã rất cố gắng nhưng bài thuyết trình của nhóm không tránh khỏi những thiếu sótmong nhận được sự đóng góp từ cô để bài thuyết trình của nhóm được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn cô!

NHÓM 7

Trang 4

I TỔNG QUAN

I.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Việc nuôi cấy mô và tế bào động vật đã được tiến hành cách đây hơn 100 năm nay,thông qua những nghiên cứu đầu tiên nhằm tìm hiểu một số vấn đề trong lĩnh vực Sinhhọc phát triển

Năm 1912, Alexis Carrel thử nghiệm nuôi phôi bằng cách bổ sung chất dinh dưỡngvào môi trường và ông giữ được tim phôi gà đến tháng thứ ba

Năm 1955 Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô, dịch huyết và những chất đangdùng nuôi cấy có thể được thay thế bởi “một hỗn hợp các amino acid, vitamin, cáccofactor, carbohydrate và muối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh”, điềunày mở ra một thời kì mới trong nuôi cấy in vitro tế bào động vật

Các dòng tế bào đầu tiên đã được thiết lập thành công, chúng duy trì ít nhất một phầnđặc điểm, chức năng ban đầu như: các tế bào thượng thận và tế bào tuyến yên(Bounassisi và Cs, 1962), tế bào thần kinh (Augusti-Toco và Sato, 1969), tế bào cơ(Yaff, 1968)…

Sự phát triễn của kỹ thuật mô ngày càng tinh vi,hiện đại do nhu cầu bức thiết của haihướng nghiên cứu: tạo vaccine kháng vi rút và nghiên cứu về ung thư

I.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Tính cơ học yếu

Tế bào động vật không có vách, nhưng kích thước khá lớn (khoảng 10µm), nên tínhbền cơ học yếu Do đó, tế bào động vật trong in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác động khikhuấy trộn để tách tế bào, thao tác…Trong trường hợp nuối cấy tế bào cần khuấy hayquay, thì tốc độ không vượt quá 100rpm

Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động vật cũng nên cố gắng sao cho ngắnnhất, thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ Trong bảo quản và di chuyểncác mẫu tế bào cũng cần thật nhẹ nhàng

2 Tăng trưởng và phân chia chậm

Thời gian tăng gấp đôi của tế bào trong điều kiện sinh lý là 20 – 40 giờ Hiệu suất sảnsinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm Do đó cần cóthời gian dài và khối lượng tế bào lớn, khi muốn sản xuất các chất có hoạt tính từ tếbào động vật

4

Trang 5

3 Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back)

Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó, sẽ đượcthực hiện bởi chính sự gia tăng của chất đó trong môi trường Do đó, việc thay mớimôi trường sau một thời gian nuôi cáy là rất cần thiết nhằm tránh hoạt động kìm hãmngược của cơ thể Trong phòng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngược còn có thể gây tổnthương tế bào, thậm chí làm chết tế bào hang loạt

4 Tính chất cần giá đỡ

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào độngvật cần bám vào giá đỡ đễ sống và phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khigắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trênbề mặt của dụng cụ nuôi cấy Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư, hoặc tếbào liên tục từ mô bình thường, sau khi được thuần hóa, có thể thuần hóa, có thể sinhtrưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền

5 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dunghợp hai tế bào có nhân khác nhau, tạo thành tế bào lai

6 Có thể bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâutrong nitơ lỏng (-197oC) suốtnhiều năm Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào được phục hồi khả năng tăngtrưởng phân chia như ban đầu

7 Các đặc tính khác

Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có đặc điểm khác như kém thích nghi vớimôi trường, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh,hormone…để tăng trưởng và phân chia

I.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với thànhphần môi trường nuôi cấy vi sinh vật hay thực vật, chúng là hỗn hợp các yếu tố dinhdưỡng và các chất khác Các công trình đầu tiên về nuôi cấy tế bào động vật thườngdùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết thanh và các chế phẩm phô gà làm môitrường Do thành phần của chúng phức tạp, khó ổn định, nên người ta quan tâm dầnđến việc nghiên cứu, tạo ra các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sửdụng, điều chỉnh và ổn định thành phần trong những lần nuôi cấy khác nhau

Trang 6

I.3.1 VAI TRÒ CỦA MÔI TRƯỜNG

Chất dinh dưỡng giữ vai trò cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyếtđịnh sự thất bại hay thành công của tế bào in vitro Hầu hết các thành phần khác củamôi trường nuôi cấy có thể thay thế bằng các phương pháp đơn giản hơn Trong khi đócác chất dinh dưỡng chỉ được thay thế bằng các hợp chất sinh học, thậm chí có khiphức tạp hơn

Các amino acid, acid béo , các ion, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môitrường hóa học của tế bào giúp tế bào phân chia Sodium bicarbonate được sử dụng đểduy trì pH và tạo áp suất thẩm thấu

Một vài môi trường phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào động vật

- Môi trường BM (Basal Medium): đây là môi trường cơ bản do H Eagle thiếtlập, khi dùng phải bổ sung 5 – 10% huyết thanh và amino acid, vitamin Môi trườngnày thường sử dụng nuôi cấy tế bào Hela, tế bào L

- Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium) còn gọi là môi trườngtối thiểu, do Eagle thiết lập Đây là môi trường BM có chứa amino acid, vitamin vớinồng độ cao Cần bổ sung 5 – 10% huyế thanh khi nuôi cấy tế bào

- Môi trường DMEM (Dulbecco-Modified Eagle Medium) là môi trườngE’MEM do Dulbecco cải tiến, với thành phần amino acid cao gấp hai lần và một sốvitamin cao gấp bốn lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

- Môi trường Iscove: do N.N Iscove thiết lập nhờ cải biến môi trường DMEM

- Môi trường 199: do R.C Parker thiết lập dùng để nuôi cấy tế bào mô cơ phôigà trong sản xuất vaccine phòng bệnh bại liệt

I.3.2 THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNG

Muối vô cơ

Muối vô cơ trong môi trường giúp cân bằng áp suất thẫm thấu tế bào, giúp cân bằngđiện thế màng tế bào nhờ các ion Na+, K+, Ca2+ Đa phần các muối vô cơ đều cần trongchất nền tế bào, với vai trò bám gắn và hoạt động như các cofactor, đồng thời duy trì

cơ chế vận chuyển chất qua màng tế bào

Hệ đệm

Hầu hết các môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 là thành phần chính.Ngoài ra còn hệ đệm phosphate, hệ đệm hữu cơ hay huyết thanh

6

Trang 7

Khi sử dụng bicarbonate làm hệ đệm chính trong môi trường thì sự tương tác của CO2thu nhận từ các tế bào hay từ không khí với nước sẽ dẩn đến sự điều chỉnh pH môitrường theo cân bằng của phương trình:

H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO3

-Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần duy trì không khí với 5 – 10% CO2 trong tủ, hệđệm này rẻ tiền, không độc với tế bào nên được sử dụng tương đối phổ biến

Hệ đệm hữu cơ được sử dụng nhiều nhất là HEPES ethane sulfonic acid) Các đệm hữu cơ không nhạy cảm với CO2, có thể ổn định pH.HEPES có khả năng duy trì pH từ 7,2 – 7,4 nhưng tương đối đắt và độc với một số tếbào ở nồng độ cao

(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red như một chất chỉ thị pH Môitrường chuyển màu vàng cho biết pH giảm và màu đỏ cho biết pH tăng

Carbohydrate

Đường được sử dụng chính là glucose và galatose, một số môi trường còn sử dụngmaltose hay fructose Nồng độ đường khác nhau giữa các môi trường cơ bản từ 1g/l-4,5g/l môi trường chứa nồng độ đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào

Vitamin

Vitamin là cơ chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều trong thành phần của huyếtthanh Nhiều loại môi trường cần bổ sung vitamin thích hợp vì chúng cần thiết trongnuôi cấy tế bào động vật Đặc biệt vitamin B cần thiết cho sự phát triển tế bào, một sốmôi trường có nhiều vitamin A và E Thông thường vitamin được sử dụng trong môitrường là riboflavin, thiamine, biotin

Protein va peptide

Đây là thành phần quan trọng trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt là với môi trường nuôicấy không huyêt thanh Một số protein, peptide rất cần thiết như albumin, transferring,fibronectin và fetuin chúng có sẵn trong huyết thanh, vì vậy thuận lợi đối với loại môitrường được bổ sung huyết thanh

Acid béo va lipid

Đây là các chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy không huyết thanh và cho một số tếbào đặc biệt chúng hiện diện trong huyết thanh với các dạng như chlolesterol vàsteroid

Yếu tố vi lượng

Trang 8

Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong đóselenium là chất giúp tách các gốc oxy tự do Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà

ta bổ sung vào môi trường các yếu tố vi lượng thích hợp

Huyết thanh

Vai trò của huyết thanh:

- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các nguyên tố vi lượng, aminoacid thiết yếu

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

- Kích thích sự phục hồi của các tế bào khi cấy chuyền, các protein trong huyết thanhgây bất hoạt trypsin, tránh các enzyme gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Chống oxy hóa: huyết thanh kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tố của oxy

- Cải thiện tính bám dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi cấy

I.4 ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

Nhiệt độ

Đa số các tế bào của người và động vật có vú được nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC trong quátrình nuôi cấy, tế bào động vật không chịu nhiệt độ cao hơn 2oC so với nhiệt độ pháttriển thích hợp của chúng Chỉ vài giờ sau khi tăng nhiệt độ, tế bào đã có thể chết Ởnhiệt độ trên 40oC, tế bào chết rất nhanh

Tuy nhiên, tế bào lại có khả năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triểntối ưu của chúng Ở 4oC, tế bào động vật có khả năng sống vài ngày, có thể cấp đông tếbào động vật ở nhiệt độ -196oC mà không ảnh hưởng đến sự phát triển về sau Tế bàocủa những loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy khác nhau Ví dụ, tế bào củađộng vật có vú và người phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC, tế bào của các loài chim pháttriển tốt ở 38,5oC, tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25oC

Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy người ta thường sử dụng tủ ấm Nhìn chung các tủ ấm duytrì nhiệt độ bằng cách làm ấm và tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với những thay đổinhiệt và trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau khi mở hay đóng cửa tủ Đối với các tủ ấm cóbổ sung nước ở khay bên dưới sẽ duy trì độ ẩm cao

pH

Môi trường nuôi cấy có pH quá cao hoặc quá thấp sẽ ảhonh hưởng đến tế bào nuôi cấy

pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trìchức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và

8

Trang 9

nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt Sự biến đổ pH có thể làm thay đổi chuyểnhóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn tới sựchết tế bào (apoptosis) Do vậy, kiểm soát pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôicấy.

Môi trường nuôi cấy của tế bào động vật đều được điều chỉnh ở pH 7,0 – 7,4 (trungbình 7,2) bởi hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8

Áp suất thẩm thấu

Muối và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm thấu, mặc dù cácamino acid cũng rất quan trọng Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào sẽ ảnh hưởngđến sự phát triển và chức năng của tế bào Khi áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trườngquá cao, nước từ trong tế bào ra ngoài làm tế bào co lại, ngược lại tế bào sẽ căngphồng khi áp suất bên ngoài quá thấp Nếu tế bào trong môi trường có áp suất thẩmthấu không phù hợp tế bào sẽ bị biến dạng

Các môi trường thương mại được thiết kế áp suất thẩm thấu là 300 mOsm (tế bào pháttriển tốt trong khoảng 290 – 310 sOsm) Cách tốt nhất để kiểm tra áp suất thẩm thấu làdùng Osmom kế (Osmometer)

Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292g/lít NaCl sẽ làmtăng 1 mOsm

Các loại khí.

Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2, và N2 Tỷ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ các phân áp khí được tạo ra thích hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào và mô sống

I.5 CÁC KIỂU NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Nuôi cấy sơ cấp

Là phương pháp sử dụng các tế bào sau khi được tách từ các mảnh mô và trước lần cấychuyền đầu tiên Quy trình được tiến hành từ việc thu nhận các mảnh sinh phẩm, cácmảnh mô sống Sau đó, các mảnh mô được xử lý sơ bộ để loại bỏ vi khuẩn, nấm cũngnhư các thành phần không mong muốn khác Tiếp theo, chúng được tách để tạo huyềnphù tế bào đơn trước khi nuôi cấy Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng để khai tháccác tế bào ban đầu trong những mảnh mô, nhằm tạo ra các dòng tế bào mới

Trang 10

Nuôi cấy thứ cấp

Được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi cấy sơ cấp Hầu hết các tế bào

được bảo quản lạnh nên việc đầu tiên của quá trình nuôi cấy thứ cấp là giải đông và

nuôi cấy trong điều kiện thích hợp Các tế bào nuôi cấy thứ cấp là đối tượng chính cho

các nghiên cứu cũng như ứng dụng của công nghệ tế bào động vật

10

Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase

NUÔI SƠ CẤP Tái huyền phù

DÒNG TẾ BÀOCấy chuyền

Ly tâm

Thu nhận tế bào mới

Nuôi mãnh mô thứ cấp

Nuôi mẫu mô sơ cấp

THU NHẬN MẪU MÔ

Cắt nhỏ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt nhỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ (mảnh nhỏ

để nuôi) Tách tế bào bằng cơ học ( nghiền, ép) Tách tế bào bằng enzyme

Ly tâm

Trang 11

Nuôi cấy huyền phù

Thường được sử dụng để nuôi cấy tế bào thu nhận từ mẫu máu Đây là phương phápnuôi cấy trong không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thôngqua hệ thống bioreactor nhằm thu nhận một lượng lớn các tế bào mong muốn

Nuôi cấy lớp đơn

Đây là phương pháp để nuôi cấy các tế bào thu nhận từ các mô rắn như phổi, thận, da,xương, cần nuôi phát triển thành lớp đơn

Ngoài ra, một số dòng tế bào có thể biểu hiện trạng thái bán bám dính Khi đó trongdụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám dính và các tếbào huyền phù

I.6 CÁC DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

Dụng cụ nuôi cấy: hộp đĩa nuôi cấy đĩa 35 mm, đĩa 60 mm, bình Roux, … các dụng cụ nuôi cấy có thể được làm bằng thủy tinh hay bằng nhựa, được vô trùng sẵn và sử dụng một lần ( đối với dụng cụ được làm bằng vật liệu nhựa )

Đĩa nuôi cấy

Bình Roux

Các thiết bị của phòng thí nghiệm:

Định dạng
Số trang	23
Dung lượng	1,45 MB