SẮC kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bộ phận loại khí dung môi Degasser in line - Loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm.. Bộ phận tiêm mẫu Một nguyên tắc chung cầ

SKL cao áp hay SKL hiệu năng cao HPLC (High Performance Liquid Chromatography) có ưu điểm là:

 Thời gian sắc ký

 Kích thước hạt

 Độ phân giải

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM- KHOA DƯỢC

BỘ MÔN PHÂN TÍCH-KIỂM NGHIỆM-10/2016

Ts Phan Thanh Dũng

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

MỤC TIÊU

 Định nghĩa HPLC

 Phân loại

 Trang thiết bị cơ bản của HPLC

 Các thông số đặc trưng của HPLC

 Ứng dụng của HPLC

1.ĐỊNH NGHĨA

- HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước  10  m Dùng một bơm có áp suất cao (high pressure)  300 atm để đẩy pha động (mobile phase) qua cột (pha tỉnh) với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh (High Performance) một lượng mẫu nhỏ cở

20  g

- HPLC ra đời từ 1960 đến nay đã được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm áp dụng nhiều lĩnh vực do:

+ Có độ nhạy cao

+ Độ đúng và độ chính xác cao đáp ứng các yêu cầu về định lượng

+ Thích hợp với các hợp chất không bay hơi và chịu nhiệt

(A) Hỗn hợp chất cần phân tích khi bơm vào cột

 Tập trung ưu tiên ở pha động (B)

 Tập trung ưu tiên ở pha tĩnh (B)

(C) Cân bằng mới được thiết lập

(D) Quá trình lặp lại liên tục, sau 1 thời gian 2 chất tách rời nhau

A

B

C

D

T=0

T=10’

T=20’

Mạnh Tương tác với pha tĩnh Yếu

Bơm mẫu Chiều di chuyển của pha động Detector

Điều kiện sắc ký: mẫu: 40 ng mỗi thành phần; cột: 3 cm  4,6 nm, ID; pha tĩnh: ChromSphere UOP C18, 1,5  m; pha động: hỗn hợp nước: acetonitril (85:15); tốc độ dòng: 3,5 ml/phút; nhiệt độ phân tích: 350C; phát hiện: detector UV 254 nm; các peak được tách hoàn toàn: 1= bromazepam, 2= nitrazepam; 3= clorazepam; 4= oxazepam; 5= flunitrazepam; 6= hydroxydiazepam( ternazepam); 7= desmethyldiazepam( nordazepam); 8= diazepam(valium)

PHÂN LOẠI

Dựa vào cơ chế tách chiết phương pháp SKLHNC được chia làm 4 loại:

- Sắc ký phân bố (partition chromatography)

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

- Sắc ký ion (ion chromatography)

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000)

ít phân cực Trong NP, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động

NP dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

- Sắc ký pha đảo (Reversed phase chromatography): Pha tỉnh là những chất lỏng ít phân cực (hydrocarbon….) Pha động là dung môi phân cực (nước, methanol, acetonitril…) Trong RP pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng RP Dung môi sử dụng trong RP là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, RP được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn NP

2 TRANG THIẾT BỊ

1 Bình đựng pha động

2 Bộ phận khử khí

3 Hệ thống bơm cao áp

4 Bộ phận nạp mẫu

5 Lọc tiền cột

6 Cột sắc ký

7 Bộ phận phát hiện

8 Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu

HEÄ THOÁNG HPLC HP1100

Solvent cabinet

Degasser Pump module Injector/Autosampler Column compartment

HEÄ THOÁNG HPLC Agilent 1260

HEÄ THOÁNG HPLC Water

2.1 Bình chứa dung môi

- Thủy tinh trung tính, rửa sạch thể tích 100 ml  2 lít

- Thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng

- Nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi

Xử lý dung môi

Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi:

- Dung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat kích thước 0,22 và 0,45  m

- Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: màng lọc RC (regenerated cellulose, cellulose tái sinh), polyamid hay nylon

-Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon

Pha động trong SKLHNC:

Pha động trong SKLHNC phải đạt những yêu cầu sau:

- Hòa tan được mẫu cần phân tích

- Phù hợp với đầu dò

- Không hòa tan, làm mòn hay hủy hoại pha tĩnh

- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

- Đạt độ tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

- Bộ phận lọc dung môi: giá đỡ của bộ phận lọc dung môi thường bằng thủy tinh thường có kích thước 5  10  m, cần phải thường xuyên làm vệ sinh (DD acid nitric 5% + siêu âm khoảng 15’, rửa lại bằng nước cất đã được lọc qua màng lọc 0,45  m

2.2 Bộ phận loại khí dung môi (Degasser in line)

- Loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi dung môi vào bơm

Khử khí ngay trên dòng (On-line membrane degassing)

Pha động chảy qua một sợi rỗng làm bằng màng bán thấm Áp suất chân không từng phần được duy trì bên ngoài màng Do không khí có thể khuyếch tán qua màng trong khi hơi dung môi không qua được nên khí hoà tan thoát ra khỏi dung môi trước khi đến bơm

Buồng chân không

Bình chứa pha động

Bình chứa pha động

Dung môi sau khi được khử khí Màng khử khí này hay được đặt thẳng đứng ngay trên đường dung môi vào bơm để không khí không thể hoà tan trở lại vào dung môi

2.2 Bộ phận loại khí dung môi (Degasser in line)

1 Lọc dưới áp suất giảm (chân không = vacuum): rất

thích hợp cho việc đuổi khí vì có thể kết hợp việc lọc pha động bằng chân không để loại đi cả khí hoà tan lẫn các tạp nhiễm

2 Siêu âm (sonication): đặt bình đã chứa dung môi

vào bồn siêu âm Đây là thao tác đuổi khí cho phép khí thừa thoát ra khỏi dung môi trước khi vào bơm Siêu âm hay được thực hiện kết hợp với đuổi khí bằng áp suất giảm (chân không)

3 Sục khí helium (helium sparge): một dòng khí

helium sục vào pha động có thể đuổi đi khí hoà tan (helium không tan trong hầu hết các dung môi, do vậy rất ít helium thay chổ của không khí)

Ngoài ra còn có các kiểu hay sử dụng để đuổi khí:

2.3 Hệ thống bơm HPLC:

Hầu hết hệ thống bơm SKLHNC có bán tên thị trường là dựa trên mô hình piston thuận nghịch

- Đầu bơm có 2 van điều tiết, mỗi van có một lỗ nhỏ với 1 bi, các van này đảm bảo cho việc hút pha động vào thân bơm hoặc đẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc ký được hoàn toàn

- Thân bơm có một pisston để chuyển động đi lại Khi pisston tiến tới 1 bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm Khi pisston lùi lại 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mỡ lỗ phía cột để pha động vào cột sắc ký

Piston Chậm

Bơm HPLC dùng để hút pha động từ bình chứa và đẩy chúng qua cột sắc ký, gồm các loại khác nhau:

2.3.1.Bơm có lưu lượng hằng định:

- Lưu lượng thường không đổi & áp suất cũng không đổi Bất lợi là thân bơm có thể tích nhỏ Do đó phải làm đầy pha động thường xuyên

Bơm một pisston:

- Điều khiển bằng hệ thống tâm sai, lưu lượng không đổi nhưng áp suất thay đổi

Bơm 2 pisston:

- Khi pisston đẩy pha động vào cột thì pisston khác sẽ hút pha động vào thân bơm Do đó cột sẽ luôn luôn có áp suất không đổi, lúc đó lưu lượng không đổi, áp suất hằng định và thể tích không bị giới hạn Lưu lượng có thể điều chỉnh bằng motơ

Điều chỉnh sự thay đổi áp suất

Những điều cần chú ý khi dùng bơm đẳng dòng:

Không tăng tốc độ dòng đột ngột

Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích

Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào

Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng với nước khi không tiến hành phân tích để tránh sự phát triển của nấm môùc

2.3.2 Bơm đẳng dòng (isocratic pump):

Chỉ lấy được một loại dung môi không tự động pha trộn được dung môi

Van vào

Hai piston

2.3.3 Bơm nhị phân (binary pump):

Có thể lấy đồng thời 2 loại dung môi đầu

Có thể chạy được chương trình hóa dung môi (gradient)

Tiết kiệm dung môi

Cột phân tích Bộ phận trôn

Van ra Van ra

Van vào Van vào

2.3.4 Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)

Có thể lấy đồng thời 4 loại dung môi động

Có thể chạy được chương trình dung môi (gradient) một cách uyển

chuyển và đa dạng

Tiết kiệm dung môi

Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân

Tương tự như bơm đẳng dòng

Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đường ống

Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi

Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tương tự như hỗn hợp dung môi đệm

Rửa kỹ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân tích, sau đó rửa lại bằng hỗn hợp dung môi methanol hay acetonitril với nước

Hệ thống khử khí trên dòng chảy dung môi

Bình chứa dung môi đi vào

Bộ phận tiêm mẫu vào cột

Hệ thống trộn dung môi

2.4 Bộ phận tiêm mẫu

Một nguyên tắc chung cần phải tôn trọng khi đưa mẫu thử vào cột tách là không được làm xáo trộn chất nhồi trong cột

Phương pháp dùng syringe trực tiếp

Phương pháp dùng van bơm với thể tích xác định (loop)

Bộ phận bơm mẫu tự động auto-sampler

2.4.1 Phương pháp sử dụng syringe trực tiếp

Là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng bơm tiêm (syringe)

Phải dùng đến vách ngăn (septrum): teflon, silicone

Yêu cầu bắt buộc

Không được tương kỵ với pha động của hệ thống sắc ký

Không được chứa các chất dẻo hoá, chất chống oxy hóa

Ưu điểm

Tiện lợi, đơn giản

Có hiệu lực cao vì mẫu được đưa trực tiếp vào cột, hạn chế được thể tích ngoài cột

2.4.2 Phương pháp sử dụng van bơm

(Valse – loop injector hay Syringe loop injection)

Là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác định

Đặc điểm:

- Van bơm có thể hoạt động dưới áp suất cao

- Nhờ được trang bị một cột có chứa mẫu có thể tích nhất định (loop) nên thể tích mẫu được đưa vào cột lúc nào cũng hằng định

- Lượng mẫu bơm vào thường nhiều hơn lượng cần thiết(10-100 l) Trước tiên, mẫu được đưa vào van tiêm ở vị trí 1, sau đó mẫu sẽ được bơm vào cột với 1 thể tích nhất định khi ta chuyển sang vị trí 2

 Ưu điểm

Hệ thống bơm có thể làm việc dưới áp suất rất cao mà không bị gián đoạn dòng chảy

Cột tách không bị tắt hay bị bẩn do các mãnh đệm ngăn (Septum)

 Thể tích mẫu thử được đưa vào cột lúc nào cũng hằng định vì vậy độ lặp lại sẽ rất cao

 Chú ý

- Phải dùng một thể tích hợp lý của mẫu thử cho một thể tích loop nhất định (Ví dụ: phải dùng tới 100 l mẫu thử để làm đầy cho 1 loop 20 l)

Thông thường người ta dùng loại microsyrine với các thể tích chính xác:

25, 50, 100, 250 l Điều này có ưu điểm là loại hẳn được ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật đối với kết quả trên sắc ký đồ

- Hoạt động của hầu hết các autosampler là sự xuyên thấu qua các lọ chứa mẫu phân tích đã được đậy nắp bằng một bằng một kim gắn với ống dẫn Mẫu phân tích được hút từ lọ chứa mẫu qua kim vào loop của bộ phận tiêm mẫu và đưa vào cột sắc ký

- Cũng là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác định nhưng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chương trình điều khiển Hệ thống có thể bơm liên tục 100 mẫu và có thể bơm chính xác từ 1-100 µl, có độ chính xác và độ lặp lại cao

2.5 Lọc tiền cột (precolumn filter) hay cột bảo vệ (guard column)

- Là một cột ngắn đặt giữa bộ phận tiêm mẫu và đầu vào cột phân tích chính, cột bảo vệ được nhồi với chất hấp phụ giống như cột sắc ký chính nhưng có kích thước lớn hơn một ít

- Mục đích: hấp phụ, giữ lại tạp hay các tiểu phân nhỏ có trong mẫu phân tích hay tạp có trong pha động có thể gây nghẹt và phá huỷ cột chính

2.6 Cột HPLC

- Cột được dùng trong sắc ký lỏng thường là một ống làm bằng thép không rỉ hoặc làm bằng thủy tinh đặc biệt (chỉ dùng khi áp suất khoảng 60 psi) hoặc bằng ống nhựa polyethylen Về cơ chế phân 2 loại cột: cột phân tích và cột chế hoá

Cột phân tích

- Dài 5, 10, 15, 25 cm, muốn tăng chiều dài người ta nối nhiều cột với nhau

ĐK trong khoảng 2  10 mm Kích thước của chất nhồi là 3,5 đến 10 m Hiện nay cột hay được dùng nhất có chiều dài 25 cm, ĐK trong từ 4  6

mm Chất nhồi cột kích thước 5 m Mỗi cột chứa khoảng 40.000  60.000 đĩa lý thuyết/ mét

- Gần đây người ta chế tạo cột có hiệu năng cao, kích thước nhỏ hơn các cột trên ĐK trong khoảng 1  4,6mm Kích thước của chất nhồi là 3  5

m Dù kích thước hạt nhồi rất nhỏ nhưng với kỹ thuật tiên tiến, các hạt này được sắp xếp các lỗ xốp nối với nhau thành một ống theo chiều dài của cột Do đó rất tiện lợi về tốc độ chảy và tiêu tốn ít dung môi Mỗi cột chứa khoảng 100.000 Neff/mét rất tiện lợi về tốc độ chảy và tiêu tốn ít dung môi

Một vài loại cột SK thường gặp

Novapak C18, Nucleosil C18, Zorbax, Micropak, Spherisorb, Chromolith Performance (RP – 18, RP 8)

Pha tỉnh : Pha tỉnh lỏng được tẩm vào chất mang bằng liên kết hoá học rồi nhồi vào cột

Chất mang: không được có hoạt tính, nghĩa là không còn khả năng hấp thụ nữa Thông thường các chất mang có lỗ xốp ở bề mặt khi tẩm các hạt chất mang lỗ xốp bằng pha tỉnh, các thể tích lỗ xốp sẽ được lấp đầy

Các chất mang thường dùng: diatomide (diachrome, spherosile, dorasil), silic (Lichrosorb, Zipax…)

 Ghép tướng tỉnh lên chất mang

Phương pháp tẩm

- Gắn tướng tỉnh vào chất mang theo kiểu liên kết hóa học

Ester hoá trực tiếp nhóm hydroxyl bề mặt của silica với hydrocarbon

Si – OH  Si – O – R + H 2 O

 R thay đổi tùy theo nhóm chất phản ứng dùng làm tướng tỉnh Tướng tỉnh dưới dạng ester nên không bền với nhiệt, dễ dàng bị thủy phân

 Silane hoá nhóm hydroxyl bề mặt

Tùy theo bản chất gốc R, ta có chất nhồi khác nhau

VD: Si – OH + Cl 3 – (CH 2 ) 17 – CH 3  SiO – Si (CH 2 ) 17 CH 3

CH OH

Octyl - (CH2)7CH3 Oxypropionitril -OCH2CH2C  N

Sắc ký lỏng pha thường (Normal phase)

Pha tỉnh phân cực do chất mang được phủ hoặc liên kết với những

chất phân cực (như H 2 O, -oxydipropionitril, PEG, trimethylenglycol…)

Pha động là dung môi hữu cơ ít phân cực (hexan, benzen…)

Sắc ký lỏng pha đảo (Reverse phase)

Pha tỉnh là những chất lỏng ít phân cực (hydrocarbon…)

Pha động là dung môi phân cực (H 2 O, MeOH, CH 3 CN…)

Cột chế hoá:

Thường các loại cột chế hoá có đường kính trong lớn hơn so với cột phân tích Đường kính trong của cột chế hoá thường từ 10 đến 50 mm, chiều dài cột chế hoá thường dài hơn nhiều so với cột phân tích Do đó tốc độ dòng sẽ lớn hơn nhiều so với cột phân tích Cột này thường ứng dụng nhiều trong lĩnh vực dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất.

2.7 Bộ phận phát hiện (Detector)

Là bộ phận khá quan trọng trong hệ thống HPLC

Bộ phận phát hiện là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi chúng được tách ra khỏi cột sắc ký Việcï lựa chọn bộ phận phát hiện để sử dụng phải dựa trên tính chất hóa lý của chất cần được phân tích

Một bộ phận phát hiện lý tưởng

Độ nhạy cao, khả năng phát hiện phải thấp hơn giới hạn 0,1 g mẫu trong 1 cm 3 pha động

Đáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tích hay có những đặc tính có thể đoán được

Không nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt và của tốc độ pha động, không phá hỏng mẫu thử

Vận hành liên tục

Thể tích ngoài cốc đo nhỏ

Độ lặp lại tốt và dễ vận hành

Thực tế không có bộ phận phát hiện đáp ứng đầy đủ các yêu cầu trên

 Có rất nhiều loại bộ phận phát hiện tuỳ theo tính năng của nó

 Bộ phận phát hiện quang phổ kế khả kiến và tử ngoại

 Bộ phận phát hiện đa sóng PDA (Photo Diode Array Detector)

 Bộ phận phát hiện huỳnh quang (Fluorescence Detector)

 Bộ phận phát hiện khúc xạ kế vi sai (RI- Refractive Index Detector)

 Bộ phận phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)

 Bộ phận phát hiện đo cường độ xung

 Bộ phận phát hiện điện hoá

 Bộ phận phát hiện ghép với khối phổ

 Bộ phận phát hiện điện lượng

 Bộ phận phát hiện kiểu đo cường độ dòng

 Bộ phận phát hiện đo độ dẫn

 Bộ phận phát hiện ánh sáng khuyết tán

Thủy tinh Quartz

2.7.1 Bộ phận phát hiệnquang phổ khả kiến và tử ngoại UV-Vis (Ultraviolet Visible absorbance Detector)

Phổ biến nhất hiện nay

Cấu tạo gồm 3 bộ phận chính

 Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light): Thường là đèn kết hợp với kính lọc hay đèn kết hợp với bộ tạo ánh sáng đơn sắc Là bộ phận cho phép chọn một bước sóng từ đèn nguồn phát ra ánh sáng trên một vùng giải bước sóng rộng

 Flow cell (Cốc đo cho dòng chảy đi qua): làm bằng thạch anh (quartz) có hai đầu ống hình trụ đường kính 1 mm, chiều dài 1 cm, thường hoạt động đưa chất lỏng vào và ra theo hình chử “Z”,