CƠ sở kĩ THUẬT sắc kí LỎNG CAO áp

Sơ đồ chung của một hệ HPLC Pha động: là dung môi có tác dụng vận chuyển mẫu đi qua pha tĩnh khi được bơm qua cột Pha tĩnh: pha cố định trong cột phân tích, ví dụ C18, Silica v.v… Quá t

Lê Thanh Hải

TramatCo Ltd

Application Manager

May 2016

Cơ sở kỹ thuật Sắc ký lỏng cao áp

• Chế độ chạy isocratic và gradient

• Các phương pháp định lượng trong sắc ký lỏng

3

Lịch sử sắc ký (LC)

Năm 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) đã thí nghiệm tách chất bằng cột sắc ký lần đầu tiên

M.S Tswett Ber Dtsch Bot Ges 24: 384-393 (1906)

HPLC

Năm 1906…

Ngày nay…

“Chromatography” kết hợp

bởi hai từ Chromo và Graphy,

trong tiếng Hy lạp có nghĩa là

mầu sắc và sự ghi lại Tương

tự ta có từ “Sắc ký” trong tiếng

Việt

4

HPLC =?

 Horrible Performance Liquid Chromatography

 High Performance Liquid Chromatography

 Hyper Performance Liquid Chromatography

(UHPLC = Ultra High Performance LC)

Sơ đồ chung của một hệ HPLC

Pha động: là dung môi có tác dụng vận chuyển mẫu đi qua pha tĩnh khi được bơm qua cột

Pha tĩnh: pha cố định trong cột phân tích, ví dụ C18, Silica v.v…

Quá trình tách chất được thực hiện do sự dịch chuyển khác nhau của các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động

• Mẫu không cần bay hơi

• Mẫu cần hòa tan trong

• Mẫu thường khôngphân cực, hoặc phân cựcnhưng không quá mạnh

7

Phân loại mẫu và các kỹ thuật

phân tích tương ứng

 Giới thiệu chung

 Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC

 Các chế độ phân tích trong kỹ thuật HPLC

 Các loại cột phân tích

 Hệ thống bơm dung môi trong HPLC Gradient và isocratic

 Các kỹ thuật bơm mẫu

Thời gian lưu, thời gian không lưu giữ và

thời gian lưu hiệu chỉnh

Injection

to

tRmAU

time

tR

to - thời gian không lưu giữ

tR- thời gian lưu

t'R- thời gian lưu hiệu chỉnh được tính theo:

Trong đó F là lưu lượng dòng pha động đi qua cột tính bằng ml/min, V tính

bằng ml còn thời gian lưu tính bằng phút

Tương tự ta có:

V’R= F t’R và Vo= F to

Ưu điểm của việc sử dụng thể tích lưu là đại lượng này không phụ thuộc

vào lưu lượng dòng pha động và Vo chính là thể tích rỗng của cột

11

Hệ số dung lượng k’ hay hệ số lưu giữ k

Dung lượng lưu giữ k được định nghĩa là tỷ số giữa thời gian lưu

hiệu chỉnh và thời gian khụng lưu giữ

Hay ta cú

•k là tỷ lệ thời gian mẫu nằm trong pha tĩnh so với thời gian nằm trong pha

động Hay núi cỏch khỏc, k là tỷ lệ giữa số mol chất tan trong pha tĩnh với

số mol chất tan trong pha động Hệ số dung lượng k càng lớn thỡ thời gian

phõn tớch càng lõu

• Hệ số dung lượng k của một cấu tử biểu thị khả năng lưu giữ của cột đối

với cấu tử đú

• Những cấu tử cú k= 0 thỡ khụng bị lưu giữ bởi pha tĩnh của cột và sẽ cú

thời gian lưu là to

•Những cấu tử tương tỏc khụng thuận nghịch với pha tĩnh (khụng nằm

trong pha động) sẽ cú giỏ trị k tiến tới ∞ và sẽ khụng rửa giải ra khỏi cột

Hệ số dung lượng k’ hay hệ số lưu giữ k

Hệ số dung lượng phụ thuộc mạnh vào thành phần pha động

(khỏc với sắc ký khớ, pha động chỉ đúng vai trũ vận chuyển).

Ví dụ trong sắc ký RP, hàm lượng dung môi hữu cơ trong pha

động càng cao, hệ số lưu giữ càng giảm (peak rửa giải sớm

hơn).

Tương tự trong sắc ký ký có chế độ chạy chương trình nhiệt độ,

trong sắc ký lỏng, ta có thể áp dụng chế độ chạy gradient dung

môi với những mẫu phức tạp

k = 1 – 20: Tạm được; k = 3 – 10: tốt hơn; k = 5 – 7: lý tưởng!

Hiệu quả tách của cột, số đĩa lý thuyết N

Hiệu quả tách của cột, số đĩa lý thuyết N

• N nhỏ sẽ cho cỏc peak tự và thấp, khả năng tỏch kộm.

• Chiều cao đĩa lý thuyết H tỷ lệ nghịch với số đĩa lý thuyết N

Với L là chiều dài cột phõn tớch

(HETP = height equivalent theoretical plate)

• Số đĩa lý thuyết N của cột LC phụ thuộc vào:

a) Kớch thước hạt nhồi dp Hạt càng nhỏ, N càng lớn

b) Độ nhớt của pha động càng lớn, N càng nhỏ

c) Nhiệt độ cột càng cao, N càng lớn (trong giới hạn)

d) Thường thỡ N tăng khi tốc độ pha động giảm

e) Với các cột có hạt nhồi dới 2um, tốc độ tăng không làm giảm N

đáng kể -> Giúp tăng tốc quá trình phân tích

…

L H N



16

Hiệu quả tỏch của cột, số đĩa lý thuyết N

Phương trỡnh van Deemter

Phương trỡnh van Deemter

Với H : chiều cao đĩa lý thuyết

A: Số hạng biểu thị sự chảy rối của dũng dung mụi pha động

B: Số hạng biểu thị khuyếch tỏn dọc theo cột

C: Trở lực chuyển khối trong đú C = Cm +Cs

u : Tốc độ dài của pha động (cm/phỳt)

B

u

§ưêng cong Van Deemter với kích thước

hạt khác nhau

17

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng với cột HPLC với

kích thước hạt 1 µm

Với tốc độ dòng gần giá trị optimum, số đĩa lý

thuyết có thể tính gần đúng như sau:

Xếp vừa 2 peak

Xếp vừa 3 peak : tăng dung lợng lên 1/3

21

Dung lượng peak và hiệu quả tỏch N

Hạt nhồi nhỏ giúp tăng hiệu quả tách N

nhưng cũng làm tăng áp suất !

(UHPLC tăng độ phân giải tới 60% so với HPLC thờng)

23

Hệ số tỏch α = độ chọn lọc

(separation factor)

Hệ số tỏch α của một cặp peak sỏt nhau được định nghĩa bằng tỷ số giữa

thời gian lưu hiệu chỉnh của peak rửa giải sau cho thời gian lưu hiệu

chỉnh của peak rửa giải trước:

Như vậy hệ số tỏch α luụn lớn hơn 1 Trường hợp α =1, cặp chất là khụng

thể tỏch được

Hệ số tỏch α cú thể được tớnh theo tỷ số của hệ số dung lượng k’ (hoặc

hệ số lu giữ k) hay hằng số phõn bố Kd

2 1

R

R

t t

Hệ số tỏch α phụ thuộc vào bản chất pha tĩnh của cột phõn tớch Những

cột cùng loại (ví dụ cùng RPC18) cũng có thể có độ chọn lọc khác nhau

tuỳ thuộc nhà sản xuất, có end-cap hoặc không…

Độ chọn lọc phụ thuộc vào pha động : ví dụ các dung môi hữu cơ ACN và

MeOH có thể cho độ chọn lọc khác nhau trong RP

Hệ số tỏch α cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, tuy nhiờn ở mức độ thấp hơn

Khi thay đổi nhiệt độ, hệ số lưu giữ k cũng thay đổi theo và sự thay đổi

khụng tương đồng nhau giữa cỏc cấu tử

Độ phõn giải Rs

Độ phõn giải của 2 peak liền kề được tớnh theo cụng thức:

Trong đú delta tRlà hiệu số của cỏc thời gian lưu, wa và wb là cỏc độ

rộng peak ở chõn đường nền

Độ phân giải Rs là đại lợng đánh giá khả năng tách hai cấu tử

Độ phõn giải Rs

(tiếp theo)

Trong nhiều trường hợp, xỏc định độ rộng peak tại chõn đường nền

tương đối khú khăn, ta cú thể sử dụng cụng thức tớnh độ phõn giải Rs

theo độ rộng peak tại nửa đường cao (Wh)

27

Phương trình biểu diễn độ phân giải cơ bản

Rs phụ thuộc vào các yếu tố : N, k và α

Trong phương trình trên, hệ số dung lượng k lấy giá trị của peak rửa giải

– Hexane, Isooctane, methylene

chloride, ethyl acetate

3 Cấu tử có độ phân cực càng

cao, càng lưu giữ mạnh

4 Độ lưu giữ giảm đI khi độ phân

cực của pha động tăng lên

ứng dụng của sắc ký pha thuận

 Phân tích tốt các cấu tử kỵ nớc

 Phân tích các đồng phân

4 Phân tích tốt các đối tượng là anion, cation cả vô cơ và

hữu cơ trong dung dịch nước

Ví dụ phân tích các protein dạng kiềm

2 Pha động được pha thêm tác nhân cặp đôI ion có

chứa các ion đối với ion của cấu tử phân tích (alkyl

sulfonate)

3 Phân tích các hợp chất axit, bazơ hữu cơ yếu

4 Cột khó đạt cân bằng

Sắc ký loại kớch thước (SEC)

33

1 Phân tách các cấu tử dựa trên kích thớc phân tử

2 Bao gồm 2 loại:

– SEC trong dung dịch kỵ nớc: Sắc ký thấm gel (GPC)

– SEC trong dung dịch nớc : Sắc ký lọc gel (GFC)

3 Không có tơng tác sắc ký giữa các cấu tử phân tích và

pha tĩnh của cột

– Các phân tử mẫu khuyếch tán vào các lỗ xốp của hạt nhồi

– Các phân tử đợc tách loại dựa vào sự khác biệt kích thớc của

4 Pha động đợc lựa chọn chủ yếu dựa trên khả năng

hòa tan các cấu tử phân tích

5 Đợc sử dụng chủ yếu trong phân tích polymer và các

protein

Cơ chế tách trong sắc ký loại kích thước

– Các cấu tử càng phân cực càng rửa giải sớm (hệ số lu giữ k nhỏ)

– Các cấu tử có thành phần không phân cực (alkyl) càng lớn càng lu giữ mạnh

4 Pha động: là dung dịch nớc (đệm) + các dung môi hữu cơ tan

trong nớc nh ACN, MeOH v.v

S¾c ký HILIC

(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

37

1 Pha tĩnh rất phân cực : Silica , NH2, Diol (tương tự NP-LC), nhưng pha

động vẫn sử dụng nước trong thành phần Bởi vậy HILIC còn được gọi

là: ‘sắc ký lỏng pha thường trong dung dịch nước (aqueous normal

phase HPLC)’.

2 Pha động thường bao gồm thành phần nước (đệm) chiếm từ 2 – 40 %

Dung môi hữu cơ thường là acetonitrile

3 Thứ tự rửa giải : ngược với RP-LC: càng phân cực, càng lưu giữ

4 Cơ chế:

 Dựa trên phân bố giữa lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh với

pha động

 Dựa trên tương tác của các chất phân tích phân cực với các nhóm

phân cực của pha tĩnh

5 Tăng hàm lượng nước trong pha động  giảm khả năng lưu giữ

6 Ứng dụng với các chất rất phân cực, là một kỹ thuật bổ sung cho

RP-LC Kết hợp tốt với LC/MS

Ảnh hưởng của hàm lượng nước lên lực

rửa giải trong sắc ký HILIC

Trong HILIC, nước là một dung môi mạnh !

Dạng peak - độ đối xứng , bất đối xứng

Dạng peak: độ kéo đuôi TF (USP TF)

Tính chất một số dung môi thường sử dụng

Điểm sôi ( o C)

UV cut off (nm)

Thay đổi độ nhớt của hỗn hợp dung môi

hữu cơ và nước

47

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ nhớt của

dung môi

48

Phương trình Darcy

49

Ảnh hưởng của kích thước hạt, chiều dài cột, độ nhớt

dung môi lên áp suất cột

Ảnh hưởng của dung môi lên áp suất cột

1 Độ nhớt của dung môi: độ nhớt càng cao, áp suất càng lớn (tỷ

lệ thuận)

– Acetonitrile tốt hơn MeOH Trong trường hợp áp suất tăng cao,

việc lựa chọn ACN là ưu tiên số 1

– Dung dịch đệm nhớt hơn H2O Khi sử dụng đệm có độ nhớt cao,

việc lựa chọn các dung môi hữu cơ có độ nhớt thấp càng quan

trọng Lưu ý đệm tan trong pha động tại mọi điểm của gradient.

2 % hữu cơ trong pha động: có điểm độ nhớt đạt cực đại và tuỳ

thuộc vào mỗi loại dm hữu cơ.

– Acetonitrile có thể sử dụng với cột 2.1 x100mm với áp suất thấp

hơn 400bar (có thể phải tăng nhiệt độ)

– MeOH với cột trên thì áp suất có thể vượt 500 bar !

Lọc dung môi và bảo vệ cột

53

Bơm sử dụng trong HPLC

Bơm trong kỹ thuật HPLC cần phải:

• Tạo đợc áp suất đủ cao để đa mẫu và pha động

qua cột với tốc độ dòng mong muốn

• Độ nhấp nhô về áp suất phải nhỏ nhất

• Có khả năng trộn dung môi với hiệu suất cao nhất

(đồng đều)

• Có thể tích trễ nhỏ nhất

Thờng có các loại bơm sau:

• Bơm piston dạng song song

• Bơm piston dạng nối tiếp

• Bơm màng

• §¶m b¶o liªn tôc cã dßng

dung m«i ®i vµo hÖ thèng

B¬m piston d¹ng nèi tiÕp

Bộ dập xung (damper)

• Chứa một chất lỏng có độ nén ép và ngăn với pha

động bằng một màng ngăn

• Đảm bảo dập xung của bơm cao áp đạt thấp hơn

2% giá trị ban đầu

• Thờng đợc gắn sensor áp suất

Bộ phận bơm mẫu bằng tay

Thao tác xoay van cần dứt khoát

Đờng ống thải bố trí thấp hơn vòng loop và luôn

h-ớng xuống dới

Thể tích ngoài cột

ống dây mao quản và ốc nối

Phân tán do dòng chảy

Độ phân tán phụ thuộc vào kích thước mao

quản và tốc độ dòng

Code mầu và PN của các ống mao quản lắp

trong các hệ HPLC của Agilent

Lắp đầu ferrule đúng quy cách

Detector trong sắc ký lỏng cao áp

(HPLC)

Một số detector sử dụng trong HPLC

1 Detector UV - Vis (Fixed UV, VWD, MWD, DAD)

2 Detector huúnh quang FLD

 Nhiễu nội tại detector

 Độ nhậy hay giới hạn ph¸t hiện dưới

 Độ khuyếch t¸n tổng (thể tích trễ)

 Hằng số thời gian

 Khoảng nhiệt độ vµ ¸p suất lµm việc

Các đặc tính của detector trong HPLC

Nhiễu đường nền: là tín hiệu của detector khi không có mẫu

Một chỉ số quan trọng trong phân tích sắc ký là tỷ lệ tín hiệu/

nhiễu Một peak được coi là peak tín hiệu nếu có tỷ lệ S/N >=2

(hoÆc >=3)

69

Nhiễu tín hiệu và trôi tín hiệu (drift)

Độ nhậy (sensitivity)

 Độ nhậy S của detector được định nghĩa là tỷ số giữa chiều cao peak (E) và

lượng chất (với detector nhậy khối lượng) hoặc nồng độ với detector nhậy

nồng độ.

Với detector nhậy khối lượng:

Với detector nhậy nồng độ:

71

E S M



E S C

Giới hạn định lợng nhỏ nhất MDQ thờng có giá trị gấp 3 lần giới hạn phát

hiện dới LOD



Khoảng động học và khoảng tuyến tính

73

Một dạng flowcell điển hình

 Io= độ hấp thụ khi không có mẫu

 l = chiều dài flowcell

 c = nồng độ cấu tử phân tích

 k’ = hệ số hấp thụ

Gọi T = ( IT/Io ) là độ truyền qua

Gọi A = lg( Io/IT ) là hệ số hấp thụ

Ta có A = k’cl

Như vậy, độ nhậy của detector UV phụ thuộc vào chiều dài flowcell và hằng số k’, trong đó k’ phụ thuộc vào cường độ cực đại hấp thụ của cấu tử nghiên cứu Lựa chọn đúng bước sóng cực đại hấp thụ của cấu tử phân tích sẽ cho độ nhậy lớn nhất.

phù hợp với nhiều loại cấu tử

• Không phát triển hoặc tối ưu

được các phương pháp phân

tích

Mirror 2 Mirror 1

Detector mảng diode (DAD)

và detector đa bước sóng (MWD)

Tungsten lamp

Lens

Deuterium lamp

Lens system Holmium filter Detector cell Optical slit Grating

Diode Array

• Có độ nhậy cao

• Có thể chạy nhiều bước sóng

cùng một lúc (up to 8 channels)

• Có thể lấy phổ online của các

peak, giúp cho quá trình phân

Detector DAD và MWD (tiếp theo)

• Kỹ thuật indirect detection

• Bước sóng so sánh (Reference)

• Kiểm tra được độ tinh khiết của peak (phát hiện peak trùng)

Tín hiệu detector và các dạng flow cell.

DAD 1290 Infinity – một bước đột phá

Nguyên lý cell dạng cáp quang của hệ

UHPLC1290 Infinity

 Ánh sáng truyền qua mạnh do hiệu ứng phản xạ trong (TIR) với hiệu suất ~ 100%

 Độ nhậy cao nhất với thể tích cell bé nhất  Giảm độ phân tán làm gioãng peak sắc ký

 Dễ dàng tích phân peak, giảm hiệu ứng nhiệt của dung môi pha động

 Fused silica trần : giảm nhiễu đường nền.

Detector chỉ số khúc xạ (RID)

• Dựa trên chỉ số khúc xạ

khác nhau giữa chất phân

tích và pha động

• Phân tích được những cấu

tử không mang nhóm mang

mầu hoặc không phát huỳnh

• Không chạy được chế độ

gradient dung môi

Detector huỳnh quang

 Cường độ tia phát xạ huỳnh quang được tính theo công thức:

Sơ đồ nguyên lý detector huỳnh quang

Sơ đồ cấu tạo của detector huỳnh quang ghi

được phổ của Agilent Technologies

Emission Monochromator

Lens (condensor EM)

Detector tán xạ bay hơi (Evaporative light scattering detector = ELSD)

• Dựa trên hiện tượng tán xạ Reyleigh

• Độ nhậy khá

• Đáp ứng với hầu hết các nhóm chất

Là giải pháp cho các cấu tử không đáp

ứng UV, huỳnh quang v.v

• Không đáp ứng với các hợp chất dễ

bay hơi

• Hệ số đáp ứng tỷ lệ với khối luợng

phân tử (mass detector)

91

Rửa giải gradient trong sắc ký lỏng cao áp

Những nhược điểm của của kỹ thuật

đẳng dung môi (isocratic)

 Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ số lưu giữ k

nhỏ (rửa giải sớm)

 Độ phân giải thấp đối với những peak ra muộn: do peak

quá doãng.

 Với những dung dịch mẫu có nhiều cấu tử có k khác

nhau, thời gian phân tích bị kéo dài

 Cột hay bị ô nhiễm bởi những cấu tử có độ lưu giữ cao

92

Những ưu điểm của kỹ thuật

gradient dung môi

 Tăng cường độ phân giải

 Tăng độ nhậy với những peak ra muộn (k lớn)

 Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp (các hệ số k

khác biệt lớn)

 Cải thiện dạng peak sắc ký

 Giảm được thời gian phân tích, nhất là những mẫu có

nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau

 Tăng độ bền của cột do loại bỏ được các cấu tử có độ lưu

giữ mạnh.

93

… và những nhược điểm

 Thiết bị HPLC phức tạp hơn, giá thành cao hơn

 Thời gian phân tích thực tế tăng thêm do phải cộng thêm thời gian

cân bằng cột Với chế độ cặp đôi ion, thời gian cân bằng cột có thể

kéo dài.

 Các hệ thiết bị LC khác nhau có thể tích trễ khác nhau làm ảnh

hưởng tới sự chuyển giao phương pháp giữa các thiết bị

 Một số detector hoặc ứng dụng không thể áp dụng gradient dung

môi.

 Nếu sử dụng van tỷ lệ, khả năng bị kết tủa muối ở van cao (cần gia

tăng quá trình rửa)

Trường hợp B, gradient, Các peak tách đồng đều và có dạng peak hẹp, cân đối

Chú ý: các cặp peak tại các điểm 1 và 2 trong trường hợp isocratic không tách đựơc

như trong trường hợp rửa giải gradient

Biểu đồ thay đổi thành phần dung môi hữu cơ

trong kỹ thuật gradient (%B)

96

• Isocratic hold time: thời gian chờ ban đầu

• Gradient time tG: thời gian gradient diễn ra

• Purging: giai đoạn đuổi các cấu tử có độ lưu giữ cao

• Conditioning: ổn định lại cột, chở về thành phần ban đầu

• Equilibrium: cân bằng cột