Chọn cột tách
Nếu mẫu thuộc nhóm A và C thì cột mao quản sẽ cho kết quả tốt hơn cột nhồi
Nếu mẫu thuộc nhóm B thì không được phép dùng cột mao quản phim mỏng (WCOT) mà phải dùng cột mao quản lớp mỏng (SCOT) hoặc cột nhồi
Mẫu thuộc nhóm D sẽ được phân tích tốt trên các cột mao quản có bề mặt thủy tinh đã được muội hóa.
5.1.2 Chọn kích thước cột tách
Chiều dài cột tách ảnh hưởng đến hiệu suất phân giải, tuy nhiên, việc tăng chiều dài cột tách gấp đôi chỉ cải thiện độ phân giải khoảng 40% Đồng thời, chiều dài cột tách tăng cũng dẫn đến sự gia tăng độ chênh lệch áp suất theo phương trình Lu p B.
Không thể kéo dài cột tách một cách tùy ý, vì tiết diện cột tách phụ thuộc vào dung lượng mẫu cần thiết Trong sắc ký khí điều chế, đường kính trong của cột tách cần phải lớn hơn 4mm.
Khi sử dụng detetor TCD để phân tích mẫu nhóm A hoặc C, cần chọn cột có đường kính nhỏ để tránh làm giãn pic với lưu lượng khí mang thấp Để duy trì tốc độ khí mang u trong cột cố định, cần giảm lưu lượng dòng khí đối với cột có tiết diện nhỏ Điều này dẫn đến khả năng chịu tải của cột giảm theo tiết diện, tức là lượng mẫu phải giảm Tuy nhiên, nồng độ mẫu trong khí mang vẫn giữ nguyên, do đó tín hiệu đo được không bị giảm.
Khi mẫu thuộc nhóm B và cần sử dụng detector TCD để phân tích các khí như hydro, oxy, và các khí chứa nitơ (NO, H2S) mà detector FID không phát hiện được, cần bơm nhiều mẫu hơn, dẫn đến tải trọng cột tăng và yêu cầu cột phải có đường kính lớn hơn, thường từ 4,25 đến 6,35mm Tuy nhiên, trong phân tích lượng vết, detector FID vẫn là lựa chọn phổ biến.
Khi sử dụng detetor ion hóa như FID và ECD, cần tạo ra dòng khí mang lớn nhưng vẫn giữ trong vùng tối ưu bằng cách điều chỉnh tốc độ dòng khí Cần lưu ý rằng nếu dòng khí quá lớn, có thể gây tắt ngọn lửa hoặc làm ngọn lửa hoạt động ở vùng không tối ưu Thông thường, cột sử dụng có đường kính trong từ 3 – 4mm, trong khi đó, với cột mao quản, nên chọn cột có đường kính nhỏ để đạt hiệu suất tối đa Nếu cột mao quản không đáp ứng yêu cầu tách, có thể sử dụng cột mao quản lớp mỏng.
Khi sử dụng cột mao quản, việc tiết kiệm chiều dài cột tách thường ít được chú ý Đối với mẫu có hằng số phân bố K lớn, cột mao quản phim mỏng với chiều dài 25m là sự lựa chọn phù hợp.
Điều khiển nhiệt độ cột tách đẳng nhiệt là phương pháp đơn giản và cần thiết để xác định các thông số hóa lý Khi mẫu chứa ít cấu tử với hằng số phân bố tương tự, phương pháp này cung cấp thông tin tối đa Tuy nhiên, đối với mẫu thuộc nhóm C, thời gian phân tích kéo dài và tỷ số giữa chiều cao và độ rộng pic trở nên bất lợi cho phân tích định lượng, do đó, sử dụng chương trình nhiệt độ là giải pháp tốt nhất.
Chương trình nhiệt độ: Chương trình nhiệt độ giúp phân tích hỗn hợp nhóm C chỉ cần một lượng bơm mẫu Ưu điểm của phương pháp này là:
- Rút ngắn thời gian phân tích đối với các mẫu có khoảng điểm sôi rộng
Tỷ lệ chiều cao và chiều rộng của pic luôn ổn định, tạo điều kiện thuận lợi cho phân tích định lượng Các mẫu hợp chất thiên nhiên thường phức tạp, yêu cầu sử dụng đa phương trình thay vì một phương trình tuyến tính để đạt kết quả mong muốn Trong quá trình tách, có thể giữ đẳng nhiệt cột trong thời gian thích ứng trước khi tăng nhiệt độ theo tốc độ yêu cầu Tuy nhiên, khi nhiệt độ cột tách tăng, một số pha tĩnh có thể bị cuốn đi bởi dòng khí, dẫn đến hiện tượng lệch đường nền, gây khó khăn cho việc sử dụng tích phân kế điện tử Giải pháp cho vấn đề này là sử dụng cột kép, với tín hiệu của hai cột phân cực trái dấu nhau, giúp bù trừ hiện tượng pha tĩnh bay hơi Khi áp dụng chương trình nhiệt độ, cần chú ý đến một số điểm quan trọng.
Nhiệt độ của buồng điều nhiệt cần được điều chỉnh theo tốc độ thích ứng như quy định trong chương trình Hiện tại, chưa có máy sắc ký nào hoạt động chính xác với tốc độ dưới 0,3 °C/phút và trên 24 °C/phút Thực tế, cột nhồi thường được sử dụng với tốc độ từ 5 đến 20 °C/phút, trong khi cột mao quản có tốc độ từ 0,25 đến 2,5 °C/phút.
Việc làm nguội buồng điều nhiệt cần thực hiện nhanh chóng và sâu hơn nhiệt độ làm việc ban đầu để ổn định chương trình mới Khi cửa buồng điều nhiệt còn nóng, nhiệt từ các tấm cách nhiệt sẽ tỏa ra, gây ảnh hưởng đến quá trình làm việc.
Nhiệt độ của buồng bay hơi mẫu cần được nâng cao, độc lập với nhiệt độ của buồng điều nhiệt, để đảm bảo quá trình bay hơi mẫu diễn ra ổn định và lặp lại, bất chấp sự thay đổi của nhiệt độ.
Khí mang cần được sử dụng ở trạng thái tinh khiết, vì tạp chất có thể tích tụ tại đầu cột tách Khi nhiệt độ của cột tăng, các tạp chất này sẽ di chuyển qua cột và có thể gây ra hiện tượng pic lạ bất ngờ.
Khi sử dụng cột nhồi, cần chú ý đến độ dày của thành cột để đảm bảo khả năng truyền nhiệt hiệu quả Đường kính cột không nên quá lớn, thường sử dụng cột có đường kính 3mm để giảm thiểu độ chênh lệch nhiệt độ giữa bên trong và bên ngoài cột tách Ngoài ra, cột mao quản thường thích hợp hơn cho các chương trình nhiệt độ so với cột nhồi.
Khi sử dụng pha tĩnh, cần chọn loại có độ chọn lọc cao nhất nhưng cũng phải đảm bảo độ bền nhiệt phù hợp, với nhiệt độ làm việc tối đa luôn thấp hơn nhiệt độ chặn trên của pha tĩnh Nhiều pha tĩnh có độ chọn lọc tốt cho một đối tượng nhưng lại không thể sử dụng do nhiệt độ chặn trên quá thấp hoặc áp suất hơi quá lớn Do đó, trong thực tiễn, cần cân nhắc hài hòa giữa độ chọn lọc và độ bền nhiệt của pha tĩnh.
Trong trường hợp pha tĩnh là tinh thể lỏng, cần chú ý đến nhiệt độ chặn dưới, vì hiệu quả tách cao nhất chỉ đạt được khi pha tĩnh ở trạng thái tinh thể lỏng Chẳng hạn, với metoxietoxiazo xibenzen, nhiệt độ chặn dưới là 96 độ.
Giới thiệu về phương pháp HPCEC
Sự ra đời và phát triển
Năm 1937, Tiselius, nhà khoa học người Thụy Điển, đã nghiên cứu sắc kí điện di lần đầu tiên bằng cách tách các cấu tử trong huyết thanh, bao gồm α, β, và γ globumin Ông tiếp tục phát triển kỹ thuật này để phân tích các hỗn hợp protein, amin và amino axit ở điện thế thấp (110 – 220V), được gọi là điện di cổ điển Nhờ những đóng góp quan trọng trong lĩnh vực này, Tiselius đã được trao giải Nobel vào năm 1949.
Năm 1953: Edstrom đã dùng sơi mao quản đường kính 15 μm để tách được lượng nhỏ ADN.
Năm 1967, Hjerten đã nghiên cứu và mô tả chi tiết cơ sở lý thuyết của sắc ký điện di mao quản trong ống hở Sau đó, các nhà khoa học như Later Virtamen và Mikkers tiếp tục phát triển kỹ thuật này trên ống mao quản bằng thủy tinh và teflon Tiếp theo, nhà khoa học Jorgen Son đã phân loại lý thuyết về các kiểu sắc ký điện di và mô tả đặc điểm cũng như cách hoạt động của từng loại.
Vào giữa thập kỷ 80, sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC) đã được nghiên cứu và phát triển, kết hợp giữa điện di cổ điển và tính chất của cột sắc kí khí mao quản cùng với các detector nhạy cao của kĩ thuật HPLC Để thực hiện điện di trong ống mao quản, cần áp dụng điện thế cao từ 15 đến 50 kV, do đó được gọi là sắc kí điện di mao quản thế cao.
Cuối năm 1992: một số hãng như ISCO, HP, Berkman đã bắt đầu đưa ra thị trường một số hệ thống máy CEC đầu tiên.
Năm 1994: thời kì phát triển của HPCEC.
Năm 1995: các nước tiên tiến đã áp dụng kĩ thuật phân tích này trên nhiều lĩnh vực khoa học, kinh tế, nông công nghiệp và y dược
Từ năm 1995, kỹ thuật HPCEC đã có sự phát triển vượt bậc, hiện nay đang được ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ, đặc biệt là y dược và sinh học.
Hình 1 Sự phát triển của HPCEC (giai đoạn từ năm 1980 đến 1997)
Phân loại các kiểu HPCEC
Sắc ký điện di mao quản có nhiều kiểu đa dạng, từ đơn giản đến phức tạp Các kiểu này được phân loại dựa trên cơ chế, bản chất và đặc điểm của quá trình tách trong ống mao quản.
Bảng 1 Phân loại các kiểu điện di mao quản Kiểu điện di Bản chất của sự tách và đặc trưng Điện di mao quản vùng
- Sự điện di dung dịch tự do theo vùng mẫu.
Sự tách biệt các chất xảy ra khi chất tan di chuyển trong mao quản, với mỗi vùng chất riêng rẽ di chuyển với tốc độ khác nhau Dòng điện EOF trong ống mao quản là yếu tố quyết định, chịu ảnh hưởng bởi lực điện trường E.
Sắc kí điện di mao quản điện động Micell (Micellary
- Sự tương tác ionic hay hydrophobic với Micell.
Trung tâm của quá trình tách trong mao quản là sự hình thành các micelle, những tiểu phân này không chỉ dẫn dắt mà còn tăng cường khả năng tách các chất trong dung dịch đệm và chất điện di bên trong ống mao quản.
Sắc kí điện di mao quản gel (rây phân tử)
Tách theo kích thước và điện tích chất tan.
Sắc kí điện di mao quản hội tụ đẳng điện ((Capillary
- Dựa vào tính chất của điểm đẳng điện pI và vùng mẫu.
Sự tách sắc ký dựa trên điện di kết hợp với sự khác nhau về giá trị pI của chất tan, giúp hội tụ đẳng điện trong điều kiện nhất định Quá trình này làm gọn lại vùng mẫu và tăng cường nồng độ chất phân tích.
Sắc kí điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary
Dựa vào tính chất đẳng tốc độ nhất thời.
Đặc điểm của sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao
Phương pháp HPCEC có các đặc điểm sau đây:
1 Có hiệu lực tách các chất rất cao trong ống mao quản thủy tinh, ống teflon (đường kính trong 25-
2 Thế điện di rất cao, thường từ 10 – 50 kV ( 150-550 V/cm ) đặt ở hai đầu ống mao quản để tạo điện trường E.
3 Số đĩa hiệu lực của cột tách là rất lớn, thường từ 10 5 đến 10 6 đĩa /m nên cho kết quả tách tốt đối với những chất phức tạp.
4 Thời gian tách hỗn hợp nhanh, khoảng 5 – 20 phút.
5 Việc phát hiện hầu hết các chất bằng detector UV hay UV-VIs (trực tiếp hoặc gián tiếp) được thực hiện ngay trên một đoạn nhỏ của đầu cuối ống mao quản nên không cần bộ flowcell như trong HPLC (Hình
6 Lượng mẫu nạp vào cột tách rất nhỏ, khoảng 5 - 20nL (nhỏ hơn lượng mẫu của HPLC trên 1000 lần) nên rất phù hợp để tách các mẫu có khối lượng rất nhỏ, như mẫu máu bệnh nhân, vật liệu quý hiếm.
7 Có nhiều kiểu tách (bảng 1) nên khả năng ứng dụng thực tế rất rộng rãi, đa dạng và phong phú Đặc biệt thích hợp cho nhiều đối tượng phức tạp như các mẫu sinh học
8 Sự tách chủ yếu thực hiện trong dung môi nước có chất đệm pH và chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi đắt tiền như trong HPLC.
9 Việc vận hành tách và phân tích không phúc tạp, cũng dễ dàng tương tự HPLC.
10 Có thể sử dụng nhiều trang bị của HPLC như máy tự ghi, tích phân kế Do vậy cơ sở nào đã có
HPLC thì dễ dàng phát triển và ứng dụng HPCEC.
11 Tự động hóa được trong quá trình tách và phân tích hàng loạt mẫu.
12 Do đường kính trong của mao quản nhỏ nên nó giới hạn và làm khó khăn dòng chảy, vì thế dễ xuất hiện hiệu ứng nhiệt Jun không có lợi Do đó phải khống chế nhiệt độ của mao quản để đảm bảo thu được kết quả phân tích ổn định.
Hình 2 Một đoạn ống mao quản trong HPCEC được xem như một Fowcell
Kỹ thuật phân tích HPCEC đã phát triển nhanh chóng và được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y học, hóa học, sinh học, dược phẩm và nông nghiệp, đạt được tốc độ phát triển chưa từng thấy trong các phương pháp phân tích.
Một số đại lượng trong HPCEC
Tốc độ điện di, độ điện di, thời gian điện di
Điện di là phương pháp tách các chất dựa trên tốc độ di chuyển khác nhau của chúng trong ống mao quản, sử dụng dung dịch đệm và chất điện li dưới tác động của điện trường E Tốc độ di chuyển của chất i được tính bằng công thức: v i = μ i E = μ i V, trong đó μ i là điện di động của chất i và V là hiệu điện thế đặt vào 2 đầu ống mao quản.
L (2.1) Trong đó: v i là tốc độ điện di của chất i trong ống mao quản; μ i là độ điện di của chất i;
V là thế đặt vào 2 đầu ống mao quản (V);
E là cường độ điện trường giữa 2 đầu cột mao quản do thế V sinh ra;
L là chiều dài tổng của ống mao quản (cm).
Theo công thức (2.1) ta có: μ i = v i
E (2.2) Trong điều kiện tốc độ dòng ổn định, lực điện trường F E và lực cản F f (lực ma sát) cân bằng nhau (cùng độ lớn nhưng ngược chiều), F E = F f , do đó: qE = 6πηR.v i (2.3)
Trong đó: η là độ nhớt của dung dịch; R là bán kính của ion i.
Từ (2.1), (2.2), (2.3) ta có biểu thức độ điện di μ i : i 6 q à R
Độ điện di μ i tỷ lệ thuận với điện tích ion q và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch η cùng bán kính của ion R Điều này có nghĩa là trong một điện trường E nhất định, các yếu tố này ảnh hưởng đến độ lớn của độ điện di.
Phần tử nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh.
Các ion cùng điện tích thì ion nào có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn.
Các ion có kích thước tương đương sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, trong đó ion có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn Độ điện di μ i của các chất được xác định trong điều kiện chuẩn, gọi là độ điện di chuẩn μ i 0 Tuy nhiên, trong thực tế, các dung dịch trong ống mao quản không chỉ bao gồm chất nghiên cứu mà còn có các chất khác, do đó cần sử dụng độ điện di hiệu lực μ ef để phản ánh đúng các điều kiện thực nghiệm Giá trị μ ef phụ thuộc vào bản chất, kích thước, điện tích của chất phân tích, cũng như điện thế V được áp dụng giữa hai đầu ống mao quản.
Giá trị pH và nồng độ của dung dịch đệm điện giải trong mao quản;
Thành phần và nồng độ chất điện giải trong pha động;
Hằng số điện li K của chất tan (axit, bazo, phức, …);
Chất hoạt động bề mặt, chất phụ gia trung tính trong pha động;
Dung môi hữu cơ thêm vào pha động điện di hay mẫu phân tích, …
Thời gian điện di là khoảng thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ khi được nạp vào đầu ống mao quản đến khi đến vị trí trung tâm của flowcell trong detector, nơi phát hiện pic sắc ký cực đại Trong HPLC, thời gian này cũng được gọi là thời gian lưu hay thời gian rửa giải của chất tan t i Thời gian điện di có thể được tính toán theo công thức cụ thể.
i i i l L l t = v = V à (2.5)Trong đó: l là chiều dài hiệu lực (cm) (tính từ điểm mẫu được nạp đến vị trí trung tâm của flowcell của detector);
L là chiều dài tổng của ống mao quản (cm), L > l;
V là điện thế đặt vào 2 đầu ống mao quản (V).
Do chất tan di chuyển trong dòng điện di thẩm thấu (EOF), thời gian điện di và các thông số thực nghiệm khác có thể được sử dụng để tính toán độ điện di tổng số μ tot của các phân tử chất tan Vì vậy, độ điện di toàn phần trong mao quản của chất tan i được xác định bởi cường độ điện trường E, được tạo ra từ điện thế V.
E t E V t à = à à + = = = (2.6) Suy ra thời gian lưu của chất tan i là:
Hệ số phân bố và hệ số dung tích
Trong quá trình điện di, sự phân bố chất tan giữa pha tĩnh và pha động luôn xảy ra khi ống mao quản có pha tĩnh, dù là giả hay thật Quá trình này thể hiện sự cân bằng động học của điện di, được đặc trưng bởi hằng số cân bằng hay hệ số phân bố K i.
Hệ số phân bố K i cho biết trong điều kiện điện di cụ thể thì chất tan i phân bố như thế nào giữa 2 pha trong ống mao quản:
Trong đó: C i(SP) và C i(MP) lần lượt là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh (SP) và pha động (MP).
Hệ số phân bố K i được xác định bởi:
Bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh;
Bản chất, thành phần, các chất có trong pha động và giá trị pH của nó;
Lực điện trường E, tức là thế V đặt vào 2 đầu mao quản;
Nhiệt độ của mao quản
Theo quan điểm của nhiệt động học, hệ số phân bố K i được xác định bởi công thức sau: ln(K i ) = H 0 S 0
Trong đó: ∆H 0 , ∆S 0 lần lượt là entapi chuẩn, entropy chuẩn của chất tan;
R là hằng số khí; T là nhiệt tuyệt đối trong ống mao quản.
Hệ số dung tích k i ' phản ánh sự tồn tại của chất tan i trong pha tĩnh của ống mao quản dưới điều kiện điện di cụ thể, và được tính toán theo công thức nhất định.
= V (2.11) Trong đó : t i là thời gian lưu của chất tan i trong mao quản; t 0 là thời gian không lưu giữ của chất tan i trong mao quản;
K i là hệ số phân bố;
V SP ,V MP là thể tích của pha tĩnh và pha động;
V được gọi là tỉ số pha của hệ cột tách.
Việc điều chỉnh tỉ số pha ảnh hưởng đến hệ số dung tích k i ’, trong khi nếu tỉ số pha không thay đổi, hệ số dung tích của chất tan sẽ phụ thuộc vào hệ số phân bố K i Mối quan hệ này giúp tối ưu hóa các điều kiện điện di để đạt được k i ’ phù hợp, từ đó nâng cao kết quả sắc kí Hơn nữa, k i ’ còn bị ảnh hưởng bởi pH của pha động, do đó, việc thay đổi điều kiện pha động như chất đệm, pH và nồng độ chất điện giải là cần thiết để đạt được k i ’ tối ưu.
Trong hệ pha MEKC, đại lượng t t i / 0 được thay thế bằng t t i MC, trong đó t MC là thời gian không lưu giữ của pha Micell Từ đó, có thể tính toán thời gian lưu tổng của chất tan.
+ (2.12) Nếu t MC
