Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xác định được vai trò của một số yếu tố như ánh sáng, loại và nồng độ đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, môi trường khoáng, acid amin và polyamine đối với sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU
TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH RA HOA CỦA CÂY
HOA MÕM CHÓ (Torenia fournieri L.)
NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số: 9 42 01 12
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
TP HCM – 2020
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học: GS TS Dương Tấn Nhựt
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Torenia fournieri được sự quan tâm của các nhà khoa học bằng vẻ
đẹp giản dị, dễ dàng chăm sóc và có thể được trồng với nhiều mục đích khác nhau như trồng trong chậu, ven đường đi, trong nhà, ngoài trời,
trồng ở nơi có khí hậu nóng, ôn hoà hay lạnh Ngoài giá trị trang trí, T
fournieri với vòng đời ngắn, đáp ứng nhanh với sự thay đổi của môi
trường nuôi cấy, là một loại cây mô hình thí nghiệm hữu ích cho các nhà nghiên cứu, đặc biệt thích hợp cho việc nghiên cứu các hiện tượng sinh
lý cơ bản T fournieri cũng được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu in vitro như chuyển gene, tạo biến dị dòng soma, nhân giống
vô tính, tạo hoa in vitro… Mặc dù, đã có một số nghiên cứu về sự ra hoa
in vitro của cây T fournieri, việc làm sáng tỏ thêm mối quan hệ giữa sự
ra hoa và các tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn carbon, môi trường dinh dưỡng khoáng và một số yếu tố khác như polyamine, acid amin vẫn là cần thiết để làm sáng tỏ các cơ chế phức tạp của quá trình ra hoa ở loài cây này
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cùng với kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần cung cấp thêm những kiến thức về quá trình ra hoa ở thực vật
Cho đến nay, bên cạnh cây A thaliana, một loại cây mô hình đã được sử dụng nhiều cho việc nghiên cứu ra hoa, cây T fournieri cũng đã được sử dụng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu về quá trình ra hoa in vitro Trong nghiên cứu về sự ra hoa ở thực vật, điều kiện nuôi cấy in vitro là
điều kiện lý tưởng để thực hiện những nghiên cứu sâu hơn về quá trình
này Trong điều kiện in vitro, các nhà khoa học có thể chủ động điều
chỉnh một số yếu tố như cường độ ánh sáng, quang kỳ, nhiệt độ, đường, chất khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật tùy theo từng mục đích nghiên cứu Những thay đổi trong thành phần môi trường, chất điều
Trang 4hòa sinh trưởng thực vật hoặc thay đổi cụ thể trong từng điều kiện nuôi cấy có thể đẩy nhanh tốc độ sinh trưởng, rút ngắn giai đoạn sinh trưởng
và dẫn đến sự ra hoa sớm Với kỹ thuật này, các nhà khoa học đang hướng tới việc nghiên cứu sâu hơn các hiện tượng sinh lý của quá trình
ra hoa Đây chính là bước tiến quan trọng trên con đường chinh phục thiên nhiên của con người
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố đến quá trình ra hoa của cây hoa Mõm chó (Torenia
fournieri L.) nuôi cấy in vitro” đã được tiến hành thực hiện
2 Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là xác định được vai trò của một số yếu tố như ánh sáng, loại và nồng độ đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
môi trường khoáng, acid amin và polyamine đối với sự ra hoa của cây T
fournieri in vitro
3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 Nghiên cứu vai trò của một số yếu tố đến sự ra hoa của
cây T fournieri in vitro
Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh và hoạt động
biến dưỡng của cây T fournieri in vitro trong quá trình ra hoa
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về cây Torenia fournieri (T fournieri)
Trang 5v Họ: Scrophulariaceae (Huyền sâm hay Mõm chó)
v Chi: Torenia
v Loài: Torenia fournieri L
Hình dạng ngoài của T fournieri được mô tả như sau:
v Thân: màu xanh, cao từ 15-35 cm, thường mọc thẳng, một số loài mới có dạng thân bò
v Lá: màu xanh bóng, có thể dài đến 5 cm, có dạng đơn giản, hình
trứng (trái xoan), bờ lá có răng cưa, sắp xếp theo kiểu đối xứng vòng
v Hoa: rất đa dạng về màu sắc và hình dạng Các màu truyền thống gồm: tía, tím, xanh; các màu mới có thể kể là: trắng, đỏ, hồng, màu kép, vàng Hoa thường có cấu tạo bốn cánh (đôi khi có nhiều hơn) với hai môi Môi trên: lớn nhất trong các cánh, bị che khuất một phần, thường có dạng xoăn hoặc gấp nếp Môi dưới: nhỏ hơn, thùy tròn, thường có một chấm vàng đặc trưng Tuy nhiên, ở một vài loài mới, chấm này có thể bị mất đi, toàn bộ bông hoa chỉ có một màu
Torenia fournieri thuộc nhóm thực vật 2 lá mầm, thân thảo lâu năm
nhưng hầu hết được trồng như cây một năm T fournieri là cây lưỡng
bội (n = 9) Cây tứ bội thể (n = 18) có thể được tạo ra bằng cách xử lý colchicine của cây con và có hoa tương đối lớn mang lại tiềm năng phát triển các giống thương mại Tuy nhiên, các cây tứ bội này, khả năng sống sót của phấn hoa giảm đáng kể, sự hình thành hạt và sự phân bố nhiễm sắc thể không đồng đều ở giai đoạn phân chia tế bào (anaphase) khi so sánh với các cây bố mẹ lưỡng bộ
T fournieri là loài hoa được ưa thích vì màu sắc đa dạng, dễ chăm
sóc và thích hợp cho nhiều mục đích như trồng trong chậu, làm cảnh, làm hàng rào hay đơn giản trồng để che phủ mặt đất Ngoài giá trị trang
trí, T fournieri còn là một loại cây mô hình thí nghiệm hữu ích cho các
nhà tế bào học nghiên cứu lai tạo vì dễ thực hiện do tính chất nhô ra của
Trang 6túi phôi T fournieri cũng được sử dụng để nghiên cứu vị trí và sự di
chuyển của nhiễm sắc thể và tâm động ở giai đoạn đầu của quá trình tạo phôi trong các cây lai
1.2 Các con đường ra hoa ở thực vật
Các cơ chế tiến hoá ở thực vật diễn ra một cách chặt chẽ để đảm bảo sự ra hoa phải xảy ra vào thời điểm tối ưu giúp cho quá trình sinh sản thành công Sự phối hợp của những cơ chế điều hoà này cần sự thống nhất của rất nhiều yếu tố từ môi trường cùng với những yếu tố nội sinh để quá trình chuyển tiếp ra hoa diễn ra vào đúng thời điểm Trên thực tế, có ít nhất 4 con đường ra hoa ở thực vật bao gồm quang kỳ, con đường năng lượng, chất điều hòa sinh trưởng và con đường tự chủ ra
hoa được nghiên cứu từ cây mô hình cây A thaliana Tuy nhiên, không
phải tất cả thực vật có hoa đều ra hoa theo đúng bốn con đường cơ bản này Tuỳ theo từng loài, từng điều kiện sống nhất định thực vật sẽ có những yếu tố kích thích khác nhau phù hợp cho quá trình sinh sản
1.3 Những thành tựu nghiên cứu trong và ngoài nước về ra hoa in vitro và cây Torenia
1.3.1 Một số nghiên cứu trong nước
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật vẫn luôn giữ vai trò quan trọng đối với thực vật và sự điều khiển ra hoa bởi các chất điều hòa sinh trưởng này được nghiên cứu khá rộng rãi Lê Hồng Thuỷ Tiên (2006)
nghiên cứu về sự ra hoa in vitro của cây dừa cạn (Catharanthus roseus)
và cây dã yên thảo (Petunia hybrida), sự ra hoa thành công khi môi
trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA Tổ hợp cytokinin
và auxin đã được sử dụng nhiều nhất để cảm ứng ra hoa là BA và NAA
(có thể là IAA, IBA) ở các cây tím phi (Saintpaulia ionantha Wendl), cây mào gà (Celosia cristala), hoa hồng mini (Rosa hybrida) Bên cạnh
đó, GA3 cũng đã được sử dụng và cảm ứng ra hoa in vitro thành công ở
Trang 7cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) Ngoài tác động cảm ứng ra
hoa, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn đóng vai trò hỗ trợ cho
sự phát triển hoa hoàn chỉnh hoặc rút ngắn thời gian ra hoa Ở cây mào
gà (Celosia cristala), PBZ ở nồng độ 2,0 mg/l làm tăng tỷ lệ ra hoa và
cảm ứng sự ra hoa sớm, thời gian là 30 ngày thay vì 50 ngày sau nuôi cấy Kinetin với nồng độ 1,0 mg/l thúc đẩy hình thành thêm các phác hoa nhỏ, trong khi nồng độ thấp hơn xuất hiện nhiều lá bắc, làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của các hoa này Đối với hoa hướng dương
(Helianthus annuus), môi trường bổ sung 50 g/l sucrose kết hợp 1,0
mg/l IBA giúp các bộ phận hoa phát triển hoàn chỉnh
1.3.2 Một số nghiên cứu ngoài nước
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về sự ra hoa in vitro trên các loài lan thuộc chi Dendrobium như ở loài D madame, D chao-praya-smile
và D candididum Ở các loài lan khác như C goeringii và C hybridium,
sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được ghi nhận trong nghiên cứu của
Li-Ming và Ji-Liang (2006) Cảm ứng ra hoa in vitro bằng cách sử dụng cytokinin và gibberellin đã được nghiên cứu ở cây Pharbitis nil, cây
Passiflora suberosa và cây Lilium longiflorum Một số nỗ lực thành
công trong việc tạo ra hoa hồng in vitro đã được báo cáo Năm 2013, Zeng và đồng tác giả đã nghiên cứu thành công sự ra hoa in vitro ở cây hoa hồng mini (Rosa hybrida cv Fairy Dance)
Sự ra hoa trong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu khi nuôi cấy
phôi soma ở một số cây như cây B vulgaris và cây D giganteus John
và Nadgauda (1997) đã tạo được hoa in vitro ở cây Bambusa vulgaris var vittata và cây B arundinacea Một số loài tre khác đã được dùng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu ra hoa như cây B edulis, cây D
hookeri và cây D latiflorus
Trang 8Những nỗ lực nghiên cứu sự ra hoa in vitro thành công đã được
thực hiện trên một số cây dược liệu Seidlova và đồng tác giả (1981) nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đối với sự ra hoa trong cây ngày ngắn
Chenopodium rubrum Ở cây nhân sâm (Panax ginseng), Tang (2000)
đã nghiên cứu ra sự ra hoa trong ống nghiệm từ nuôi cấy phôi Những thay đổi của hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh trong quá trình phân biệt chồi hoa và chồi sinh dưỡng trong nuôi cấy lớp mỏng tế
bào của cây Cichorium intybus đã được nghiên cứu bởi Ying-zhang và
Bi-wen (1996) Sự ra hoa trong ống nghiệm đã được nghiên cứu ở các
cây thuốc có giá trị như cây Solanum nigrum, cây Centaurium
pulchellum và cây Chamomilla recutita, Vadawale và đồng tác giả
(2006) đã nghiên cứu thành công sự ra hoa ở cây ngũ chảo (Vitex
trùng sơ bộ bề mặt với xà phòng loãng và đặt dưới vòi nước chảy trong
30 phút Chuyển mẫu vào trong tủ cấy, lắc mẫu bằng dung dịch HgCl2
0,1% với 1-2 giọt tween 20 trong thời gian 5 phút Sau đó, mẫu được rửa lại bằng nước cất đã khử trùng 3 lần rồi cấy vào môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 0,5 mg/l
BA để tái sinh chồi Sau đó, các mẫu chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS để tạo mẫu chồi khỏe mạnh và đồng nhất, những chồi đạt chiều cao 2,0 cm được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các thí
nghiệm
Trang 92.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu vai trò của một số yếu tố đến sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa
của cây T fournieri in vitro
2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu vai trò của đường đến sự ra hoa của
cây T fournieri in vitro
2.2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu vai trò của chất điều hoà sinh
trưởng thực vật ngoại sinh đến sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
2.2.1.4 Thí nghiệm 1.4: Nghiên cứu vai trò của môi trường khoáng đến
sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
2.2.1.5 Thí nghiệm 1.5: Nghiên cứu vai trò của acid amin (L-tyrosine,
arginine và proline) đến sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
2.2.1.6 Thí nghiệm 1.6: Nghiên cứu vai trò của polyamine (spermidine,
spermine, putrescine) đến sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
2.2.2 Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh và hoạt động biến dưỡng của cây T fournieri in vitro trong quá trình ra hoa
2.3 Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng với thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng là 45 ± 2 µmol
m-2 s-1, nhiệt độ: 25 ± 2°C, độ ẩm trung bình: 60 ± 5%
2.4 Phương pháp nghiên cứu
• Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• Phương pháp giải phẫu hình thái mô phân sinh
• Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll ở thực vật
• Phương pháp đo hàm lượng đường tổng số ở thực vật
• Phương pháp đo cường độ quang hợp và hô hấp ở thực vật
• Phương pháp đo diện tích lá
Trang 10• Phương pháp thu thập, thống kê và xử lý số liệu
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung 1 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự ra hoa của cây
T fournieri in vitro
3.1.1 Vai trò của ánh sáng đến sự ra hoa ở cây T fournieri in vitro
Một trong những con đường quan trọng trong sự cảm ứng ra hoa ở thực vật là con đường ánh sáng Chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng của ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển thực vật Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2013)
trên cây T fournieri cho thấy cây T fournieri khi được nuôi cấy trong
điều kiện chiếu sáng với cường độ là 45 µmol m-2 s-1 và thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày, sau 60 ngày nuôi cấy, cây có thân to cứng cáp, lá xanh và tỷ lệ ra hoa cao (70,06%) Kế thừa những nghiên cứu trước đó, trong nghiên cứu này chất lượng hay bước sóng của ánh sáng được khảo sát nhằm xác định vai trò của bước sóng ánh sáng lên sự ra hoa của cây
T fournieri in vitro
Chất lượng ánh sáng khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự ra hoa
của cây T fournieri in vitro Sau 40 ngày nuôi cấy, kết quả ở bảng 3.1
cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng đèn LED và nghiệm thức sử dụng đèn huỳnh quang Tỷ lệ ra hoa
của cây T fournieri in vitro cao nhất ở 50% LED đỏ kết hợp với 50%
LED xanh và tỷ lệ ra hoa là 19,59% với số nụ hoa/chồi là 0,33 Khi tăng
tỷ lệ ánh sáng LED đỏ lên 60% thì tỷ lệ ra hoa giảm còn 13,34% Khi tỷ
lệ ánh sáng LED đỏ vượt qua tỷ lệ này thì sự ra hoa bắt đầu giảm mạnh Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dewir và đồng tác giả (2006) trên
cây Euphorbia millii, sự ra hoa trong ống nghiệm giảm khi tỷ lệ đèn
LED đỏ tăng
Trang 11Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của cây T fournieri
in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy
Chiều cao chồi (cm)
đỏ + 50% LED xanh; HQ: Ánh sáng đèn huỳnh quang (Philip, 36W, 1,2 m)
Kết quả nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy
tỷ lệ ra hoa cùng với số lượng nụ hoa của cây nho nhiều hơn khi sử dụng đèn LED đỏ kết hợp với đèn LED xanh và cao hơn so với các điều kiện chiếu sáng chỉ sử dụng đèn LED ở một loại bước sóng đơn lẻ (xanh
hoặc đỏ) Kết quả của nghiên cứu trên cây T fournieri in vitro cũng
tương tự với nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) Các chồi được đặt dưới điều kiện chiếu sáng là 100% LED đỏ hay 100% LED xanh thì
hầu như không có sự cảm ứng ra hoa Sự cảm ứng ra hoa ở cây T
fournieri chỉ xảy ra khi nhận được tín hiệu thích hợp của ánh sáng LED
xanh kết hợp với ánh sáng LED đỏ Điều này có thể được giải thích rằng ánh sáng LED đỏ kích thích sự hoạt động của phytochrome, ánh sáng LED xanh kích thích cho sự hoạt động của cryptochrome; sự kết hợp ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ tạo một tỷ lệ thích hợp để kích
thích sự biểu hiện của gene liên quan đến cảm ứng ra hoa như gene flc,
Trang 12một trong những loại gene mã hóa protein MADs-box Từ đó, sự hoạt
động của flc sẽ thúc đẩy chuỗi hoạt động ra hoa sau này bao gồm kích thích sự hoạt động của tổ hợp gene xác định thời điểm ra hoa như ft,
soc1 và lfy và kích thích sự hoạt động của mô phân sinh phác thể hoa,
sau cùng là dẫn đến sự ra hoa
3.1.2 Vai trò của loại và nồng độ đường đến sự ra hoa của cây T fournieri in vitro
Khi so sánh kết quả tác động của các loại đường với nồng độ khác
nhau lên tỷ lệ ra hoa, kết quả cho thấy các cây T fournieri được nuôi
cấy trên môi trường MS bổ sung fructose với nồng độ 50 g/l cho tỷ lệ ra hoa tốt nhất (53,14%), kế tiếp là glucose ở nồng độ 50 g/l (tỷ lệ ra hoa là 51,48%) (Hình 3.1) Tuy nhiên, trong thí nghiệm sử dụng fructose, số lượng cây bị vàng, hóa nâu và chết, tỷ lệ mẫu cây chết tương đối cao hơn so với thí nghiệm ở các loại đường khác Vì vậy, glucose với nồng
độ 50 g/l phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là cảm
ứng ra hoa ở cây T fournieri in vitro
Đối với cây T fournieri in vitro, 2 loại đường đơn như fructose và
glucose tác động lên sự ra hoa hiệu quả hơn 2 loại đường đôi như sucorse và maltose Kết quả của nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Taylor và đồng tác giả (2007) Nghiên cứu của Taylor
và đồng tác giả (2007) cũng đã chứng minh tỷ lệ ra hoa của cây K
leucocephala tăng lên khi các chồi được nuôi trên môi trường bổ sung
các loại đường đơn, điều này được giải thích là do sự tác động của loại đường này đối với sự phân chia tế bào tại mô phân sinh chồi đỉnh, vấn
đề này rất quan trọng đối với sự cảm ứng ra hoa ở thực vật Glucose và fructose không phải lúc nào cũng kích thích sự cảm ứng hình thành hoa, nên hiệu ứng này có thể không phổ biến và có thể phụ thuộc vào loài
Trang 13thực vật, bản chất của mẫu cấy và khả năng của mẫu cấy sử dụng các nguồn carbon khác nhau
Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sự ra hoa của cây
T fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy
Việc phân biệt giữa cảm ứng ra hoa và phát triển hoa liên quan đến hoạt động của đường là một vấn đề cần xem xét Trong khi một loại đường cụ thể nào đó có thể không kích thích cảm ứng hoa, nhưng có thể
có tác động tích cực đến sự phát triển của hoa như được ghi nhận ở cây
T fournieri Trong nghiên cứu này, mặc dù sucrose không ảnh hưởng
đáng kể đến sự cảm ứng hình thành hoa, nhưng trong nghiên cứu trước
đó trên cây T fournieri, khi bổ sung sucrose với nồng độ 60 g/l vào môi