Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetate cây tu hú (gmelina asiatica linn )

Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate .... Các nghiên cứu cho thấy một số loài trong chi có hoạt tính sinh học như trong cao chiết ethanol từ lá cây của loà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Văn Dũng

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CAO ETHYL ACETATE

CÂY TU HÚ

(Gmelina asiatica Linn.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Thành phố Hồ Chí Minh – 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Huỳnh Văn Dũng

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CAO ETHYL ACETATE

CÂY TU HÚ

(Gmelina asiatica Linn.)

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Tôi tên Huỳnh Văn Dũng, học viên cao học chuyên ngành khoa học vật chất Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sĩ: “Nghiên cứu thành phần hoá học cao ethyl

acetate cây Tu hú Gmelina asiatica Linn.” do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS

Nguyễn Thị Ánh Tuyết Các số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực,

Trong quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô giáo Ngoài ra, tôi còn nhận được sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè, đồng nghiệp Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm

ơn tất cả quý thầy cô giáo giảng dạy cũng như thầy cô Phòng Sau Đại học, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận văn này Đặc biệt, tôi bày tỏ lòng biết ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn cũng như giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn, dù bản thân đã hết sức cố gắng nhưng do năng lực của bản thân có hạn nên luận văn này chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Do đó, tôi rất mong muốn nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành

của quý thầy cô, bạn bè để hoàn thiện luận văn tốt hơn

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các sơ đồ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc diểm thực vật 3

1.1.1 Giới thiệu về chi Gmelina 3

1.1.2 Giới thiệu về loài Gmelina asiatica 3

1.2 Các nghiên cứu về dược tính 4

1.2.1 Các nghiên cứu về dược tính trong chi Gmelina 4

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính của loài Gmelina asiatica 6

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hoá học 7

1.3.1 Thành phân hoá học trong loài Gmelina asiatica 7

1.3.2 Thành phần hoá học một số loài trong chi Gmelina 8

Chương 2 THỰC NGHIỆM 17

2.1 Hoá chất, thiết bị, phương pháp 17

2.1.1 Hoá chất 17

2.1.1 Thiết bị 17

2.1.3 Phương pháp tiến hành 17

2.2 Nguyên liệu 18

2.3 Điều chế các loại cao 18

2.4 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate 19

2.4.1 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao EA2 19

2.4.2 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao EA4 20

3.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA1 23

3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA3 25

3.3 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA5 27

3.4 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA4 29

3.5 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA2 32

3.6 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA7 34

3.7 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA8 36

3.8 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA10 38

3.9 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA11 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

brs

brd

Mũi đơn rộng (broad singlet) Mũi đôi rộng (broad doublet)

dd Mũi đôi – đôi (doublet of doublets)

HMBC Tương quan H – C qua nhiều nối

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

HSQC Tương quan H – C (Heteronuclear Single Quantum

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm Phần triệu (part per million)

Rf Hệ số trì hoãn (Retardation factors)

1D/2D-NMR Phổ Cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều/ 2 chiều

(One/ Two Dimensional-Nuclear Magnetic Resonance)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Dược tính của loài Gmelina asiatica thuộc chi Gmelina 6

Bảng 1.3 Phân tích thành phần hoá học cơ bản trong loài Gmelina asiatica 8

Bảng 1.4 Một số hợp chất đã được cô lập từ loài Gmelia arbora, Gmelia philippensis, thuộc chi Gmelina 9

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA 19

Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 21

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA1 với 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone 24

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA3 với kumatakenin 27

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA5 với apigenin 29

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA4 với curcumin 31

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA2 với betulin 33

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA7 với chrysophanol 35

Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA8 với methyl 4–hydroxy cinamate 38

Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA10 với acid cinnamic 39

Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA11 với chrysin 5,7-dimethyl ether 39

Bảng 4.1 Cấu trúc các hợp chất đã phân lập được 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA1 24

Hình 3.2 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA3 (kumatakenin) 26

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất GA5 (apigenin) 28

Hình 3.4 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA4 (curcumin) 31 Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất GA2 (betulin) 33

Hình 3.6 Cấu trúc của hợp chất GA7 (chrysophanol) 35

Hình 3.7 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA8 38

Hình 3.8 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA10 39

Hình 3.9 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA11 39

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế phân đoạn cao ethyl acetate từ cây Tu hú 18

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chất GA1, GA2, GA3, GA4, GA5, GA7,

GA8, GA10, GA11 22

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một nước với khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật phong phú và đa dạng Nhiều loài thực vật đã và đang được sử dụng trong phòng và hỗ trợ điều trị bệnh Tuy nhiên một số loài chưa được nghiên cứu đầy đủ về dược tính và thành phần hoá học Việc nghiên cứu thành phần hoá học một số loại thực vật giúp làm sáng tỏ, chứng minh, giải thích tác dụng của các bài thuốc Hơn thế nữa, việc nghiên cứu thành phần hoá học còn giúp tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính sinh

học sẽ hỗ trợ cho việc phát triển thuốc

Chi Gmelina là thuộc họ Lamiaceae gồm 31 loài phân bố rộng khắp các vùng

nhiệt đới Các nghiên cứu cho thấy một số loài trong chi có hoạt tính sinh học như

trong cao chiết ethanol từ lá cây của loài Gmelina arborea có khả năng gây độc tế

bào ung thư ruột kết COLO 201, ung thư dạ dày HT-29 và ung thư thực quản TE-2 [1] Cao chiết n-BuOH và ethyl acetate có khả năng gây độc tế bào tế bào ung thư

gan HepG2 [2]

Cây Tu hú (tên khoa học Gmelina asiatica), thuộc họ Lamiaceae Trong dân

gian thường dùng cây Tu hú chữa đau nhức xương, đau nhức đầu, thông tiểu, đau tai [3] Nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Tu hú trong các bộ phận như rễ, thân, quả, lá ở Việt Nam chưa được tìm thấy Do đó, tôi chọn cây Tu hú để nghiên cứu thành phần hoá học trong đề tài này với mong muốn tìm hiểu các thành phần hoá học có trong cây Tu hú để đóng góp thêm những chứng cứ

khoa học vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hoá học cao ethyl acetate cây Tu hú Gmelina asiatica

Linn

3 Đối tượng nghiên cứu

Cây Tu hú Gmelina asiatica Linn được thu hái ở huyện Tân Uyên, tỉnh Bình

Dương vào tháng 11 năm 2019 và được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong cao ethyl acetate cây Tu hú

Gmelina asiatica Linn

5 Phương pháp nghiên cứu

 Chiết xuất các hợp chất hữu cơ trong mẫu nguyên liệu bằng dung môi methanol

 Dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng để điều chế các phân đoạn cao khác nhau

 Dùng sắc ký cột với silica gel pha thường hoặc pha đảo, kết hợp với sắc ký lớp mỏng để phân lập một số hợp chất

 Khảo sát và xác định cấu trúc các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại, chủ yếu là phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc diểm thực vật

1.1.1 Giới thiệu về chi Gmelina

Chi Gmelina được Linnaeus mô tả lần đầu tiên trong 1753 trên cơ sở loài

Gmelina asiatica, chi được đặt theo tên của Johann Georg Gmelina (1709 - 1755)

giáo sư y học, thực vật học và hoá học ở Tübingen, Đức [4]

Chi này xuất hiện tự nhiên từ Ấn Độ và Nam Trung Quốc đến Bắc Úc và Fiji Một số loài được phân bố ở nhiều vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới ở các quốc gia

Loài có thể là cây gỗ (Gmelina arborea) hoặc như một vật trang trí (Gmelina

asatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippinensis) Tổng số loài đã được ước

tính từ khoảng 33 đến khoảng 40, trong đó có 31 loài được chấp nhận [4]

Các loài thường là cây cao hoặc cây bụi, có bạnh vè, như một số loài rất phổ

biến (Gmelina asiatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippinensis) Nhưng cũng

có một số loại là cây bụi hoặc là cây nhỏ (Gmelina uniflora stapf), một số lại có gai (Gmelina asiatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippi nensis), lá của cây thường

có 3 - 7 thùy [4]

1.1.2 Giới thiệu về loài Gmelina asiatica

 Giới thiệu chung

Tên khoa học: Gmelina asiatica

Hệ thống phân loại khoa học:

Bộ (Ordor): Lamiales

Họ (Family): Lamiaceae

Chi (Genus): Gmelina

Loài (Species): Gmelina asiatica

vài sợi lông trên tĩnh mạch, màu trắng, phủ vảy da; đôi khi có 3 gân từ gốc, cuống lá 5-30 mm, nhẵn hoặc có một ít lông vảy nhưng không nhiều [4]

Cụm hoa hình cầu, đôi khi xuất hiện ở nách lá trên các chồi bên ngắn, dài 1,5

- 10 cm, hình thoi hoặc mọc thẳng, có lông thưa, phủ vảy trắng Tràng hoa 4 thùy,

có lông màu vàng, tuyến thưa; môi trước 3 thùy Nhị hoa chèn vào đỉnh của ống, sáng chói [4]

Quả (sấy khô) 13 - 30 x 8 - 30 mm, nhẵn, đỉnh tròn, màu vàng [4]

Cây được trồng tại Ấn Độ và Sri Lanka, Bắc Thái Lan, Bắc Việt Nam, Malaysia và phổ biến khắp vùng nhiệt đới [4]

Hình 1.1 Cây Tu hú 1.2 Các nghiên cứu về dược tính

1.2.1 Các nghiên cứu về dược tính trong chi Gmelina

Tuy trong chi Gmelina có khoảng 31 loài nhưng trong đó chỉ có 2 loài là

Gmelina asiatica và Gmelina arborea được nghiên cứu rộng rãi về thành phần hoá

học cũng như hoạt tính sinh học của chúng Dưới đây là một số nghiên cứu về hoạt

tính sinh học của loài Gmelina arborea

Bảng 1.1 Dược tính của loài Gmelina arborea thuộc chi Gmelina

Chống oxi hoá

Cao chiết methanol của thân cây có tác dụng bắt gốc tự

do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) với giá trị

IC50 là (19.20; 14.10 và 28.94 µg/ mL); tổng khả năng

chống oxi hoá là (412.69; 518.45 và 390.41 mg/gam dịch chiết)

[5]

Cao chiết methanol của vỏ thân cây có khả năng ức chế DPPH là 85,2 %, giá trị IC50 bắt gốc nitrogen

Những phát hiện của nghiên cứu này cho thấy rằng

dịch chiết ethanol của Gmelina arborea có tác dụng

hạ đường huyết và giảm mỡ máu đáng kể ở chuột bị

tiểu đường

[7]

Những con chuột được 10-12 tuần tuổi được sử dụng trong nghiên cứu này 100 mg bột lá được hòa tan trong 1000 mL nước Nghiên cứu hiện tại cho thấy những thay đổi về mức độ HbA1c (Hemoglobin and glycosylated hemoglobin), glucose, urea, creatinine, protein, albumin, globulin, SGOT(serum glutamic oxaloacetic transaminas), SGPT (serum glutamic pyruvic transaminase), và ALP (alkaline phosphatase)

Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng dịch chiết là không độc hại và có tác dụng chống đái tháo đường

Cao chiết thô của lá cây gây ức chế sự phát triển của

khuẩn Escherichia coli gây bệnh

[9]

Tăng khả năng

làm lành vết

thương

Nghiên cứu thử nghiệm dịch chiết methanol của bột lá

khô của Gmelina arborea ở mức liều 200 mg/kg trọng

lượng chuột Kết quả cho thấy tỷ lệ co rút vết thương

và phá vỡ u hạt rất cao

[10]

Kháng tế bào

ung thư

Cao chiết ethanol của lá Gmelina arborea đã thể hiện

tác dụng ức chế tế bào ung thư COLO 201 (ung thư ruột) (IC50 20 ± 0.15 mg/mL), HT-29 (ung thư dạ dày) (IC50 12 ± 0.32 mg/mL) và TE-2 (ung thư thực quản) (IC50 16 ± 0.05 mg/mL)

[1]

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính của loài Gmelina asiatica

Bảng 1.2 Dược tính của loài Gmelina asiatica thuộc chi Gmelina

Chống oxi hoá

Cao chiết methanol của thân cây có khả năng chống lại DPPH và gốc NO có giá trị IC50 lần lượt là 18.38 và

78.18 µg/mL Tổng hàm lượng phenolic của cao chiết

methanol của thân cây là 4800 ± 24.53 mg/gam và tổng hàm lượng flavonoid của cao chiết methanol là 28.54 ± 0.18 mg/gam

[11]

Bảo vệ gan

Cao chiết chloroform và ethanol của các bộ phận trên

mặt đất Gmelina asiatica được đánh giá chống lại tổn

thương gan chuột do CCl4 gây ra Ở liều thử nghiệm 400 mg/kg được dùng bằng đường uống mỗi ngày một lần

Kết quả cho thấy nồng độ các enzyme huyết thanh tăng cao [aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT), phosphatase kiềm huyết thanh (SALP) ] và tổng số bilirubin đã được phục hồi theo hướng bình thường

[12]

Hạ đường

huyết

Cao chiết methanol của vỏ cây Gmelina asiatica cho

thấy có tác dụng làm giảm hàm lượng glucose trong máu đáng kể: 25.8% ở mức 100 mg/kg 28.9% ở mức 250 mg/kg và 32.4% ở mức 500 mg/kg trọng lượng cơ thể

[13]

Kháng khuẩn Cao chiết chloroform và ethyl acetate của Gmelina

asiatica cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nhẹ chống lại [14]

C diphtheriae ở nồng độ 20 mg/mL Cao chiết ether dầu

hỏa ức chế chống lại C diphtheriae ở nồng độ 50

mg/mL

Kháng nấm

Cao chiết với chất lỏng siêu tới hạn của lá và thân cây

Gmelina asiatica cho thấy khả năng kháng nấm Malassezia furfur gây ra gàu Kết quả cho thấy nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) là 15.6 µg/mL

[15]

Kháng tế bào

ung thư

- Thử hoạt tính của cao chiết ethyl acetate từ rễ Gmelina

asiatica trên các dòng tế bào ung thư vú nhận thấy chúng

dương tính với thụ thể estrogen (MCF-7) và âm tính (MDA-MB-231) Giá trị IC50 là 32.9 ± 3.8 μg/mL trên dòng tế bào MCF-7 và 19.9 ± 2.3 μg/mL trên các dòng tế

bào MDA-MB-231

- Dịch chiết chloroform của các bộ phận trên mặt đất của

Gmelina asiatica được tiêm vào chuột , với liều điều trị

200 và 400 mg/kg trong 14 ngày Vào ngày 15, số lượng tế bào ung thư hạch bạch huyết giảm đáng kể trong khối

u của chuột

[16]

[17]

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hoá học

1.3.1 Thành phân hoá học trong loài Gmelina asiatica

Vào năm 2016, Florence A.R và Regini Balasingh G.S đã nghiên cứu định tính thành phần hoá học từ các dịch chiết của lá cây Gmelina asiatica và kết quả

được trình bày trong bảng 3 Kết quả cho thấy lá cây chứa đa dạng các nhóm hợp chất như alkaloid, carbohydrate, glycoside, coumarin, quinone, saponin, steroid, terpenoid, protein, phytosterol, tannin và flavonoid [18]

Bảng 1.3 Phân tích thành phần hoá học cơ bản trong loài Gmelina asiatica

Nhóm các hợp

chất

Dịch chiết Nước Pet.ether Chloroform Ethanol Acetone

Năm 2015, bằng phương pháp GC-MS trên cao chiết ethanol của lá cây G

asiatica A.R Florence và S Jeeva đã xác định được sự hiện diện của một số hợp

chất béo trong loài G asiatica và một số hợp chất steroid như

stigmasta-5,22-dien-3-ol (1), triterpene như chondrillasterol (2) và methyl commated (3), 18-oleanene (4) lup-20(29)-en-3-yl acetate (5) [19]

Năm 1975, A.S.R Anjaneyulu, A Madhusudiiana Rao, V Kameswara Rao và

L Ramachandra Row đã cô lập được một số hợp chất từ cao methanol của loài

Gmelina asiatica như methyl p-methoxy-cinnamate (6), sitosterol (7), paulownin

(8), gmelinol (9), methyl p-hydroxy-cinnamate (10) và cycloolivil (11) [20]

1.3.2 Thành phần hoá học một số loài trong chi Gmelina

Thành phần hoá học của chi Gmelina chưa được khảo sát nhiều, bảng 1.3 trình bày thành phần hoá học của 2 loài được nghiên cứu nhiều nhất là Gmelia arbora và

Gmelia philippensis

Bảng 1.4 Một số hợp chất đã được cô lập từ loài Gmelia arbora, Gmelia

philippensis, thuộc chi Gmelina

6-O-(3''-O-trans-cinnamoyl)- α -L- Trên mặt 28 [23]

rhamnopyranosylcatalpol đất

6-O-(3''-O-cis-cinnamoyl)- α

-L-rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 29 [23]

6-O-(3''-O-benzoyl)- α

-L-rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Trên mặt đất 30 [23]

6-O-(3''-O-trans-cinnamoyl)- α

–L-rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Trên mặt đất 31 [23]

6-O-(3''-O-cis-cinnamoyl)- α

-L-rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Trên mặt đất 32 [23]

Lignan

Một số hợp chất khác

2-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 35 [22]

3-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 36 [22]

2-O-cis-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 37 [22]

1-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 38 [22]

4''-O-cis-p-coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol Trên mặt

đất 46 [25]

6-O- α -L-(2'', 3''-O-dibenzoyl,

4''-O-trans-p-coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 47 [25]

6-O- α -L-(2''-O-benzoyl,

3''-O-trans-p-coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 48 [25]

6-O- α -L-(2'',3''-O-dibenzoyl)

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 49 [25]

6-O- α -L-(3'', 4''-O-dibenzoyl)-

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 50 [25]

6-O- α -L-(2'', 4''-O-dibenzoyl)

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 51 [25]

6-O- α -L- (2''-O-trans-p-methoxycinnamoyl)

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 52 [25]

6-O- α -L- (3''-O-trans-p-methoxycinnamoyl)

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 53 [25]

6-O- α -L- (2''-O-trans-p-coumaroyl)

rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 54 [25]

 Công thức hoá học một số hợp chất trong chi Gmelina

(40)

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hoá chất, thiết bị, phương pháp

- Sắc ký lớp mỏng pha đảo: TLC RP-18 F254 ( Merck, Germany)

- Sắc ký cột pha thường: silica gel 60 (40-63 μm, Merck, Germany)

2.1.1 Thiết bị

- Các cột sắc ký

- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng

- Máy cô quay chân không (Heidolph)

- Bếp cách thuỷ (Memmert)

- Đèn soi UV: bước sóng 254/ 365 nm (spectroline ENF-240 C/FE, USA)

- Cân phân tích (Sartorious BL 210S)

- Các phổ NMR (500 MHz cho phổ 1H-NMR, 125 MHz cho phổ 13C-NMR) được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance) tại phòng NMR, Viện Hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội và tại phòng Thí nghiệm Phân Tích trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

- Phổ HR-ESI-MS được ghi trên hệ thống máy khối phổ MS/MS phân giải cao

6500 series Q-TOF của Agilent (USA), được đo tại trường đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

Sử dụng phương pháp phổ nghiệm, chủ yếu là phổ NMR để xác định cấu trúc

của các hợp chất phân lập được

2.2 Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu trong luận văn là phần trên mặt đất cây Tu hú (Gmelina

asiatica) được thu hái tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương vào tháng 11 năm

2.3 Điều chế các loại cao

Cây Tu hú (Gmelina asiatica Linn.) được phơi khô và nghiền thành bột mịn,

đến khối lượng không đổi (40.0 kg) Nguyên liệu bột mịn được trích với methanol

bằng phương pháp ngâm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được

cao methanol thô (417 g) Cao methanol được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung

môi n-hexane và ethyl acetate thu được các cao phân đoạn tương ứng

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế phân đoạn cao ethyl acetate từ cây Tu hú

Cô quay thu hồi dung môi

Chiết lỏng – lỏng lần lượt với dung

môi n-hexane, ethyl acetate

2.4 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate

Phân đoạn cao ethyl acetate (279.2 g) được sắc kí cột (SKC) silica gel, giải ly

với hệ dung n-hexane - ethyl acetate có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% ethyl

acetate sau đó giải ly với hệ dung môi ethyl acetate – methanol có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% methanol Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) Những lọ cho kết quả SKLM giống

nhau được gộp chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 16 phân đoạn (EA 1 - 16), được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA

(gam)

Sắc kí lớp

2.4.1 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao EA2

Phân đoạn EA2 (13.81 gam) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn EA2 được thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi chloroform - methanol

độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Tiến hành các bước tương tự như

khi sắc kí cột phân đoạn EA Kết quả thu được 10 phân đoạn (EA2.1 – EA2.10),

được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA2

STT Phân đoạn Khối lượng

(gam) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

Phân đoạn EA2.1 (0.5282 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ

dung môi n-hexane - chloroform 7:3 thu được hợp chất GA7 (3.2 mg)

Phân đoạn EA2.2 (0.8401 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi chloroform - methanol 98:2 thu được hợp chất GA8 (4.9 mg) và giải ly với hệ dung môi chloroform - methanol (93:7) thu được hợp chất GA10 (21.4 mg) Phân đoạn EA2.3 (0.6215 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với dung môi chloroform thu được hợp chất GA2 (6.1 mg) và GA4 (16.4 mg)

2.4.2 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao EA4

Phân đoạn EA4 (18.00 gam) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn EA4

được thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi ethyl acetate – methanol độ phân cực tăng dần từ 0 đến 50% methanol Tiến hành các bước tương tự như khi sắc

kí cột phân đoạn EA2 Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA4.1 – EA4.5), được trình

bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4

STT Phân đoạn Khối lượng

(gam) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

Phân đoạn EA4.1 (2.3 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ

dung môi n-hexane – chloroform 1:1 thu được hợp chất GA11 (6.5 mg)

Phân đoạn EA4.2 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ

dung môi n-hexane – chloroform 1:1 thu được hợp chất GA1 (13.0 mg), và giải ly

với hệ dung môi chloroform - methanol 95:5 thu được hợp chất GA3 (26.9 mg) Phân đoạn EA4.3 (2.9 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi chloroform - methanol 95:5 thu được hợp chất GA5 (28.4 mg)

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chất GA1, GA2, GA3, GA4, GA5, GA7, GA8, GA10, GA11

EA2.1

0.5282 g

EA2.3 0.6215 g

EA2.4 0.9987 g

EA2.9

1.7303 g

EA2.10 1.2532 g

EA2.2 0.8401 g

EA4.1 2.3 g

EA4.2 3.1 g

EA4.3 2.9 g

EA4.4 1.2 g

EA4.5 2.7 g

GA8

4.9 mg

GA2 6.1 mg

GA4 16.4 mg

GA7

3.2 mg

GA10 21.4 mg

EA16

13.32 g

EA10 12.50 g

EA11

10.81 g

EA12 11.18 g

EA13

15.12 g

EA14 18.14 g

EA3 20.93 g

EA4 18.00 g

EA5 12.53 g

EA6

12.60 g

EA7 8.09 g

EA8 19.32 g

EA9

16.68 g

Sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate

Sắc ký cột với hệ dung môi chloroform - methanol Sắc ký cột với hệ dung môi ethyl acetate – methanol

Cao ethyl acetate ( 279.2 gam)

GA5 28.4 mg

GA1 13.0 mg

GA3 26.9 mg GA11

6.5 mg

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA1

 Nhận xét chung

Hợp chất GA1 (13.0 mg) thu được từ phân đoạn EA4.2 với các đặc điểm sau:

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi chloroform

- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi giải ly n-hexane - chloroform (1:1) cho vết

hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20%, hơ nóng ở nhiệt độ cao cho vết màu vàng với Rf = 0.34

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 1, 1a và bảng 3.1)

- Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 1b và bảng 3.1)

- Phổ HSQC (CDCl3) (phụ lục 1c)

- Phổ HMBC (CDCl3) (phụ lục 1d)

 Biện luận cấu trúc

Phổ 1H-NMR của hợp chất GA1 cho tín hiệu cộng hưởng của năm proton

vòng thơm trong vùng δH 7.71-6.36, trong đó có ba proton ở δH 7.71 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz) và 7.05 (1H, d, J = 8.5 Hz) giúp dự đoán ba

proton này gắn trên vòng thơm có ba nhóm thế ở vị trí 1, 2, 4 Hai proton thơm còn lại ghép cặp meta cộng hưởng ở δH 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.36 (1H, d, J =2.0

Hz) Ngoài ra, phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của ba nhóm methoxy ở δH

3.98 (3H, s), 3.88 (3H, s) và 3.86 (3H, s)

Phổ 13C-NMR kết hợp với HSQC thấy hợp chất GA1 có 15 carbon cộng

hưởng trong vùng δC 178.8-92.2 đặc trưng cho hợp chất flavone Trong đó, một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 178.8 và các carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC 165.5-138.9 Ngoài ra phổ đồ còn có tín hiệu của ba nhóm methoxy ở δC

Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxy ở δH 3.86 cho tương quan với carbon tại δC 138.9 giúp đề nghị vị trí C-3 mang nhóm methoxy Sự tương quan HMBC từ proton của nhóm methoxy ở δH 3.88, hai proton ghép cặp meta ở 6.45 và 6.36 đến cùng carbon ở δC 165.5 giúp dự đoán C-7 gắn nhóm methoxy Proton của nhóm -OH ở δH 6.00 cho tương quan HMBC đến carbon δC 114.6 giúp dự đoán nhóm -OH này gắn C-4' Tương quan HMBC của proton δH 7.05 đến carbon δC

146.4 giúp dự đoán nhóm methoxy còn lại gắn C-3'

Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên và kết hợp với dữ liệu phổ của hợp chất

5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone [26] cho thấy số liệu NMR của GA1 tương

đồng với số liệu NMR của 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone nên đề nghị cấu

Hợp chất GA3 (26.9 mg) thu được từ phân đoạn EA4.2 với các đặc điểm sau:

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO

- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi giải ly chloroform – methanol (95:5) cho vết hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20%, hơ nóng ở nhiệt độ cao cho vết màu vàng với Rf = 0.48

- Phổ 1H-NMR (DMSO-d 6, 500 MHz) (phụ lục 2 và bảng 3.2)

- Phổ 13C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) (phụ lục 2a và bảng 3.2)

- Phổ HSQC (DMSO-d 6) (phụ lục 2b)

- Phổ HMBC (DMSO-d 6) (phụ lục 2c)

 Biện luận cấu trúc

Phổ 1H-NMR của GA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn proton methine

vòng thơm ghép cặp ortho với nhau ở δH 7.97 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', H-6') và 6.96

(2H, d, J = 9.0 Hz, H-3', H-5'), hai proton methine vòng thơm ghép cặp meta với

nhau ở δH 6.73 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-8) và 6.37 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) Như vậy,

hợp chất GA3 có hai vòng thơm, gồm một vòng bốn nhóm thế và một vòng có hai nhóm thế đối xứng Ngoài ra, phổ đồ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton

hai nhóm methoxy ở δH 3.86 (s, 7-OCH3), 3.80 (s, 3-OCH3), một proton của nhóm hydroxy kiềm nối ở δH 12.66 (1H, s, 5-OH) và một proton của nhóm hydroxy tự do

ở δH 10.30 (1H, s, 4'-OH)

Tương tự với hợp chất GA1, phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC của hợp

chất cho thấy GA3 là một hợp chất flavone Trong đó, một carbon >C=O cộng

hưởng ở δC 178.0 và các carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC

165.1-137.8 Khác với GA1, hợp chất GA3 chỉ thể hiện tín hiệu của hai nhóm methoxy ở

ở vị trí C3, proton nhóm methoxy ở δH 3.80 cho tương quan HMBC đến carbon δC

165.2 giúp xác định nhóm methoxy thứ hai này gắn ở vị trí C7

Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên và kết hợp với dữ liệu phổ của hợp chất 5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxylflavone (kumatakenin) [27] cho thấy số liệu NMR

của GA3 tương đồng với số liệu NMR của kumatakenin nên đề nghị cấu trúc hợp chất GA3 là 5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxylflavone (kumatakenin)

Hình 3.2 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA3

(kumatakenin)

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA3 với kumatakenin

Hợp chất GA5 (28.4 mg) thu được từ phân đoạn EA4.3 với các đặc điểm sau:

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO

- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi giải ly chloroform – methanol (95:5) cho vết hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20%, hơ nóng ở nhiệt độ cao cho vết màu vàng với Rf = 0.3

- Phổ HRESIMS (Phụ lục 3): cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 269.0465

- Phổ 1H-NMR (DMSO-d 6, 500 MHz) (phụ lục 3a và bảng 3.3)

- Phổ 13C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) (phụ lục 3b và bảng 3.3)

 Biện luận cấu trúc

Phổ HRESIMS của GA5 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 269.0465 phù

hợp với công thức phân tử C15H10O5 ([M-H]- = 269.0450), sai số 0.0015

Phổ 1H-NMR của GA5 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn proton methine

vòng thơm ghép cặp ortho với nhau ở δH 7.92 (2H, dd, J = 7.0, 1.5 Hz, H-2', H-6')

và 6.93 (2H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz, H-3', H-5'), hai proton methine vòng thơm ghép

cặp meta với nhau ở δH 6.48 (1H, d, J = 1.5 Hz, 8) và 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz,

H-6) Như vậy, hợp chất GA5 có hai vòng thơm, gồm một vòng bốn nhóm thế và một vòng có hai nhóm thế đối xứng Ngoài ra, GA5 còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng

của một proton olefin ở δH 6.77 (1H, s, H-3), một proton của nhóm hydroxy kiềm

nối ở δH 12.95 (1H, s, OH-5)

Phổ 13C-NMR cho thấy GA5 có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 181.7

-94.8 đặc trưng cho hợp chất flavone Chứng tỏ GA5 là một flavonoid có cấu trúc tương tự như GA1 và GA3, tuy nhiên, GA5 không có sự hiện diện nhóm methoxy

Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên và phổ HRESIMS kết hợp với dữ liệu phổ của hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavone (apigenin) [28] cho thấy số liệu

NMR của GA5 tương đồng với số liệu NMR của apigenin nên đề nghị cấu trúc hợp chất GA5 là 5,7,4'-trihydroxyflavone (apigenin)

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất GA5 (apigenin)

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA5 với apigenin

3.4 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA4

 Nhận xét chung

Hợp chất GA4 (16.4 mg) thu được từ phân đoạn EA2.3 với các đặc điểm sau:

- Chất dạng bột, màu vàng cam, tan tốt trong dung môi DMSO

- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi giải ly chloroform cho vết hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20%, hơ nóng ở nhiệt độ cao cho vết màu vàng cam với Rf = 0.38

- Phổ HRESIMS (Phụ lục 4): cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 367.1194

- Phổ 1H-NMR (DMSO-d 6, 500 MHz) (phụ lục 4a, 4b và bảng 3.4)

- Phổ 13C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) (phụ lục 4c, 4d và bảng 3.4)

- Phổ HQSC (DMSO-d 6 (phụ lục 4e)

- Phổ HMBC (DMSO-d 6) (phụ lục 4f)

 Biện luận cấu trúc

Phổ HRESIMS của GA4 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 367.1194 phù

hợp với công thức phân tử C21H20O6 ([M-H]- = 367.1182), sai số 0.0012

Phổ 1H-NMR của hợp chất GA4 cho thấy có sự hiện diện của hai nhóm

hydroxy tự do ở δH 9.64 (2H, s), hai cặp proton olefin có cấu hình trans ở δH 7.54

(2H, d, J = 16.0 Hz, H-4/ H-4'), 6.75 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-3/ H-3') Đồng thời,

phổ đồ còn hiện diện tín hiệu proton của hai vòng benzene có ba nhóm thế ở vị trí 1,

2, 4 ở δH 7.32 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-6/ H-6'), 7.15 (2H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-10/

H-10'), 6.82 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-9/ H-9') Ngoài ra, hợp chất GA4 còn xuất hiện

tín hiệu một proton olefin ở δH 6.06 (1H, s) và hai nhóm methoxy ở δH 3.84 (-OCH3,

s)

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC của hợp chất GA4 cho thấy hợp chất có 21

carbon, trong đó có một tín hiệu cộng hưởng của hai carbon carbonyl ở C 183.1 2/ C-2'), bốn carbon thơm mang oxygen ở C 149.3 (C-8/ C-8'), 147.9 (C-7/ C-7') Các carbon vòng thơm khác cộng hưởng trong vùng C 140.6 đến 100.7 Ngoài ra, trên phổ còn xuất hiện tín hiệu của hai nhóm methoxy ở C 55.7 (2x-OCH3)

(C-Các tín hiệu cộng hưởng của proton, carbon trên phổ NMR xuất hiện với

cường độ gấp đôi cho so với tin hiệu C-1 dự đoán GA4 có cấu trúc đối xứng nên

mỗi vòng benzene mang một nhóm hydroxy và một nhóm methoxy

Bốn proton vòng thơm ở δH 7.31 (H-6/ H-6'), 7.14 (H-10/ H-10') cùng cho tương quan HMBC đến carbon olefin ở C 140.6 (C-4/ C-4') giúp xác định vị trí liên kết đôi này gắn trực tiếp vào vòng benzene tại C-5/ C-5' Đồng thời, hai proton olefin ở δH 7.54 (H-4/ H-4'), 6.75 (H-3/ H-3') cùng cho tương quan HMBC đến carbon >C=O ở C 183.1 (C-2/ C-2') giúp xác định vị trí liên kết đôi ở vị trí C3 – C4 Ngoài ra, proton nhóm methoxy ở δH 3.84 tương quan đến carbon ở C 147.9 (C-7/ C-7') giúp xác định nhóm vị trí hai nhóm -OCH3 ở carbon 7 và 7' Tương quan của hai proton -OH ở δH 9.64 đến bốn carbon ở C 149.3 (C-8/ C-8') và 115.7 (C-9/