GI IăTHI UăLU NăÁN 1.. 3.ăNh ngăđóngăgópăm iăc aăLu năán 3.1... ng th i có tác d ng gi m đau trên mô hình gây đau b ng acid acetic, không có tác d ng trên mô hình gây đau b ng mâm nóng.
Trang 1B GIÁO D C & ÀO T O B Y T
HĨăN Iă- 2014
Trang 3GI IăTHI UăLU NăÁN
1 Tínhăc păthi tăc aălu năán
Cây n kim thu c chi Song nha (Bidens L.), là cây m c hoang kh p n c ta t mi n núi, trung
du đ n đ ng b ng và có nhi u n c trên th gi i nh : Trung Qu c, Hàn Qu c, Nh t B n, Brazilầ.vv ây
là loài cây m c quanh n m, s c sinh s n nhanh và đ c coi nh loài “c d i” [6], [15], [19] T lâu, cây n kim đư đ c nhân dân nhi u n c trên th gi i s d ng đ đi u tr các b nh nh m n ng a, vàng da, ung
nh t, viêm loét d dàyầ Vi t Nam, theo tài li u c a Võ V n Chi, cây n kim có v đ ng, tính mát, có tác
d ng thanh nhi t gi i đ c, ch t kh , ho t huy t [6]
Trên th gi i, cây n kim đ c các nhà khoa h c quan tâm nghiên c u và đư có nhi u công trình công b v thành ph n hóa h c c ng nh tác d ng sinh h c c a d c li u này Cây n kim đư đ c ch ng
ch ng đái tháo đ ng [33], [41], [114]; kháng khu n, kháng n m [25], [27]; kháng ký sinh trùng s t rét và
đi u hoà mi n d ch [27] G n đây, các nghiên c u v cây n kim t p trung vào tác d ng đi u tr ti u đ ng [131] và c ch t bào ung th [27]
Cho đ n nay, các công trình nghiên c u đư công b v thành ph n hóa h c c ng nh tác d ng sinh
h c c a cây n kim m c hoang Vi t Nam còn r t ít, do đó đ tài: “Nghiênăc uăthƠnhăph năhóaăh căvƠă
m tăs ătácăd ngăsinhăh căc aăcơyă năkimă(Bidens pilosa L.,ăh ăAsteraceae)” đư đ c th c hi n v i 2
m c tiêu chính:
2.ăM cătiêuăc aăLu năán
1 Xác đ nh thành ph n hóa h c c a cây n kim
2 Th đ c tính c p, m t s tác d ng sinh h c c a d ch chi t và ch t tinh khi t đ c phân l p t cây
- Chi t xu t, phân l p và nh n d ng các ch t phân l p đ c
V ăth ăđ cătínhăvƠătácăd ngăsinhăh c:
- Th đ c tính c p c a cao l ng r và ph n trên m t đ t cây n kim;
- Th tác d ng kháng khu n, kháng n m c a tinh d u lá;
- Th tác d ng ch ng viêm c p và m n c a cao l ng r và ph n trên m t đ t cây n kim;
- Th tác d ng b o v gan c a flavonoid toàn ph n chi t t ph n trên m t đ t cây n kim;
- Th tác d ng gây đ c t bào ung th c a các ch t phân l p đ c
3.ăNh ngăđóngăgópăm iăc aăLu năán
3.1 V thành ph n hóa h c
- ư xác đ nh ph n trên m t trên m t đ t cây n kim có: alcaloid, saponin, flavonoid, acid h u c ,
carotenoid, acid amin, tanin, phytosterol, tinh d u, đ ng kh và ch t béo; trong r có: alcaloid, saponin, flavonoid, acid amin, tinh d u, đ ng kh và ch t béo
- ư xác đ nh trong ph n trên m t đ t và r cây n kim có 34 nguyên t vô c Trong đó, nguyên t có hàm l ng cao nh t là K, sau đó đ n Mg, P, Ca và Fe, nh ng nguyên t đ c nh As, Hg, Cd, Pb đ u n m trong gi i h n cho phép
Trang 4- ư xác đ nh hàm l ng tinh d u trong lá n kim là 0,18% (tt/kl) tính theo kh i l ng d c li u t i Trong tinh d u có 36 h p ch t, thành ph n chính là 1-phenyl-hepta-1,3,5 triyn (74,46%)
- ư phân l p đ c 17 h p ch t, có 6 h p ch t t ph n trên m t đ t và 11 h p ch t t r cây n kim Trong đó:
Pilosolane) (BP20);
Maltol 3-O- glucopyranosid (BP5); Ficuscarpanosid B (BP6); 4-allyl-2,6-dimethoxy phenol-1-O- glucopyranosid (BP13); 3-[(4'-hydoxy-3'-methoxyphenyl) propan-1,2 diol-2-O- -D-glucopyranosid (BP15);
- li u 10g/kg và 20g/kg, r cây n kim có tác d ng ch ng viêm c p trên c 2 mô hình gây phù bàn chân chu t và mô hình gây d ch r viêm ng th i có tác d ng gi m đau trên mô hình gây đau b ng acid acetic, không có tác d ng trên mô hình gây đau b ng mâm nóng
- li u 10g/kg và 20g/kg, ph n trên m t đ t cây n kim có tác d ng ch ng viêm c p trên mô hình gây
d ch r viêm
- li u 7,5g/kg và 15g/kg, c ph n trên m t đ t cây và r cây n kim đ u có tác d ng ch ng viêm m n
- li u 60 mg/kg và 120 mg/kg, flavonoid toàn ph n chi t t ph n trên m t đ t cây n kim có tác d ng b o
v gan trên mô hình gây đ c b ng CCl4 thông qua tác d ng h n ch t ng ho t đ ALT, AST và h n ch t n
th ng c c u trúc đ i th và vi th gan; đ ng th i làm t ng n ng đ GSH và gi m đ c MDA trong gan
- Th tác d ng c ch t bào ung th in vitro 17 h p ch t t cây n kim cho th y: Có 9 ch t tác d ng
y u đ i v i dòng t bào ung th máu (HL-60) (IC50:18,5 – 85,7 µg/ml); có 3 ch t BP20, BP2 và BP23 có tác
d ng gây đ c đ i v i t bào ung th vú (MCF-7) v i IC50 t ng ng là 45,8 µg/ml, 114,8 µg/ml và 185,9
µg/ml; Có 3 ch t BP7, BP8 và BP23 có tác d ng đ i dòng t bào ung th ph i (A549) v i IC50 t ng ng là
bào ung th máu (HL-60) v i IC50 t ng ng là 58,6 µg/ml, 25,3 µg/ml
Trang 54.ăụăngh aăc aăLu năán
- K t qu phân tích các nguyên t vô c trong cây n kim cho th y trong cây có các nguyên t vi l ng
có tác d ng t t cho s c kh e nh Mg, Mn, Ge, Fe, Ca, Zn , đ ng th i c ng cho th y trong cây có các kim
lo i n ng nh Pb, Hg, As, Cd, nh ng hàm l ng gi i h n cho phép theo qui đ nh c a WHO
- K t qu đ nh l ng tinh d u trong lá và xác đ nh trong tinh d u lá cây n kim có 36 h p ch t là m t đóng góp b sung thêm nh ng s li u v tinh d u cây n kim m c hoang Vi t Nam
- K t qu phân l p đ c 17 h p ch t, trong đó có 2 ch t m i, 11 ch t l n đ u tiên công b có trong chi
h p ch t thiên nhiên nói chung và v cây thu c thu c chi Bidens Vi t Nam nói riêng
K t qu nghiên c u v thành ph n hóa h c c ng là c s khoa h c đ ti p t c đ nh h ng nghiên c u v tác d ng sinh h c
- K t qu nghiên c u v đ c tính c p đư ch ng minh d c li u (c ph n trên m t đ t và r ) không gây
đ c m c li u g p kho ng 56 l n li u dùng trên ng i, đi u đó cho th y li u dùng theo kinh nghi m dân
- K t qu nghiên c u v tác d ng sinh h c đư góp ph n gi i thích kinh nghi m s d ng cây n kim đi u
tr m t s b nh nh m n ng a, viêm gan, viêm th n, ung nh t c a nhân dân là có c s khoa h c ng
th i, K t qu ngiên c u c a Lu n án đư m ra tri n v ng nghiên c u ti p t c đ có th ng d ng d c li u
n kim ph c v c v s c kh e c ng đ ng hi u qu h n
5.ăB ăc căc aăLu năán
Lu n án g m 4 ch ng, 36 b ng, 29 hình, 138 tài li u tham kh o, 20 ph l c Lu n án có 147 trang g m các ph n chính: t v n đ (2 trang), t ng quan (40 trang), nguyên li u và ph ng pháp nghiên c u (13 trang), k t qu (65 trang), bàn lu n (24 trang), k t lu n và ki n ngh (3 trang)
A N IăDUNGăC AăLU NăÁN
CH NGă1.ăT NGăQUAN
ư t p h p và trình bày có h th ng các k t qu nghiên c u t tr c đ n nay v th c v t h c, thành ph n hóa h c, đ c tính, tác d ng sinh h c, ng d ng trên lâm sàng c a m t s loài thu c chi Bidens nói chung và
CH NGă2 NGUYÊNăV TăLI Uă VĨăPH NGăPHÁPăNGHIÊNăC U
- Gi ng vi sinh v t ki m đ nh do B môn Vi sinh - Sinh h c, Tr ng i h c D c Hà N i cung c p
- Các dòng t bào ung th do tr ng i h c Catholic cung c p
- Các hoá ch t và thu c th đ t tiêu chu n phân tích theo quy đ nh c a D c đi n Vi t Nam IV
(methanol, ethanol, n-butanol, ethylacetat, cloroform, n-hexan )
Trang 62.2 Ph ngăphápănghiênăc u
- Phân tích s b các nhóm ch t h u c : Theo ph ng pháp phân tích sàng l c các nhóm h p ch t thiên nhiên có trong cây b ng ph n ng hoá h c [9]
- Xác đ nh các nguyên t vô c có trong m u b ng thi t b thi t b ICP-MS
- nh l ng và phân tích thành ph n tinh d u lá: đ c ti n hành theo ph ng pháp ghi trong tài li u [46]
- Chi t xu t các ch t có trong d c li u b ng ph ng pháp ngâm v i dung môi nhi t đ phòng
- Phân l p các h p ch t trong r và ph n trên m t đ t cây n kim b ng s c ký c t Theo dõi các phân
- Xác đ nh c u trúc các h p ch t phân l p đ c d a trên các ph ng pháp ph bao g m: ph kh i l ng,
ph kh i phân gi i cao, ph c ng h ng t h t nhân m t chi u, hai chi u và đ i chi u v i tài li u tham kh o
- D a theo ph ng pháp nghiên c u xác đ nh đ c tính c p c a Abrham W.B., Turner A và theo quy
đ nh c a B Y t Vi t nam và T ch c Y t th gi i v nghiên c u đ c tính c a thu c [16], [113]
- Th tác d ng kháng khu n, kháng n m b ng ph ng pháp khu ch tán, đo vòng kháng khu n, kháng
n m trên đ a th ch
- ánh giá tác d ng gi m đau trên chu t nh t tr ng gây đau qu n b ng acid acetic (ph ng pháp Koster)
và gây đau b ng mâm nóng
- ánh giá tác d ng ch ng viêm c p b ng carragenin trên mô hình gây phù chân chu t và mô hình gây viêm màng b ng
- ánh giá tác d ng ch ng viêm m n theo mô hình gây u h t th c nghi m trên chu t b ng amiant
- ánh giá tác d ng b o v gan trên mô hình gây t n th ng gan th c nghi m b ng tetraclorid carbon
- ánh giá tác d ng c ch t bào ng th in vitro theo ph ng pháp MTT
- Các s li u th c nghi m đ c x lý theo ph ng pháp th ng kê dùng trong Y - Sinh h c, s d ng
S khác bi t có ý ngh a th ng kê v i p<0,01 ho c p<0,05
CH NGă3 K TăQU ăNGHIÊNăC U
3.1.ăK TăQU ăNGHIÊNăC UăV ăTHĨNHăPH NăHOÁăH Că
3.1.1.ă nhătínhăcácănhómăch tăh uăc ătrongăcơyă năkim
- Trong ph n trên m t đ t cây n kim có 11 nhóm ch t: alcaloid, saponin, flavonoid, acid h u c ,
- Trong r cây n kim có 7 nhóm ch t: alcaloid, saponin, flavonoid, acid amin, tinh d u, ch t béo và
đ ng kh
- Không có s khác bi t v đ nh tính các nhóm ch t h u c trong n kim thu hái Yên L c - V nh Phúc và Hà ông – Hà N i
3.1.2 X ácăđ nhăcácănguyênăt ăvôăc ătrongăcơy năkim
- ư xác đ nh đ c 34 nguyên t có m t trong r và ph n trên m t đ t cây n kim
Trang 7- i v i ph n trên m t đ t, nguyên t có hàm l ng cao nh t là K, sau đó đ n Mg, P, Ca và Fe Còn v i
r , nguyên t có hàm l ng cao nh t là K, sau đó đ n Mg, P, Fe, Al, Ca và Na
- Hàm l ng kim lo i n ng có đ c tính cao nh As, Pb, Hg, Cd c ph n trên m t đ t và r trong kho ng gi i h n cho phép theo tiêu chu n c a WHO ( <1 mg/kg d c li u khô) [127]
3.1.3 nhăl ngăvƠăphơnătíchăthƠnhăph năhóaăh cătrongătinhăđ u lá cây năkim
3.1.3.1 Xác đ nh hàm l ng tinh d u lá cây n kim
Hàm l ng tinh d u có trong lá n kim tính theo tt/kl là 0,18 ± 0.01%, còn tính theo kl/kl là 0,11 ± 0,004 % (tính theo d c li u t i)
3.1.3.2 Phân tích thành ph n tinh d u lá cây n kim
Có 36 h p ch t đư đ c xác đ nh trong tinh d u lá cây n kim, trong đó h p ch t chi m t l cao nh t
3.1.4 C hi tăxu tăvƠăphơnăl păcácăh păch tăt ăcơyă năkim
Chi t xu t và phân l p các h p ch t t cây n kim đ c ti n hành nh s đ hình 3.1 và hình 3.2:
- T r cây n kim đư phân l p đ c 11 h p ch t, ký hi u là: BP1, BP2, BP3, BP4, BP5, BP6, BP7, BP8, BP11, BP13, BP15
- T ph n trên m t đ t cây n kim đư phân l p đ c 6 h p ch t, ký hi u là BP17, BP18, BP19, BP20, BP22, BP23
3.1.5 Xác đ nhăc uătrúcăhóaăh căc aăcácăh păch tăphơnăl păđ c
3.1.5.1 ả p ch t BP1
H p ch t BP1 thu đ c d i d ng b t màu tr ng, đ quay c c - 260 (c= 0,3, MeOH) C u trúc c a
h p ch t BP1 đ c xác đ nh d a vào phân tích d li u ph NMR đ c trình bày b ng 3.6:
H
a, c
(ppm) mult (J in Hz)
Trang 8đ c xác đ nh là (1R, 2R)-guaiacyl glycerol, m t h p ch t l n đ u tiên đ c phân l p t chi Bidens và đư
bi t t loài Pimpinella anisum L [61]
tín hi u trong vùng H 7,287,44 (5H), trong đó có 2 tín hi u có c ng đ m nh t ng ng v i 2 c p proton
đ i x ng, đi u này kh ng đ nh s có m t c a 1 vòng benzen th mono Ngoài ra còn có s c ng h ng c a các proton c a m t phân t đ ng (H 3,284,38, 7H), v i tín hi u đ c tr ng t i H 4,38 (1H, d, J = 7,5 Hz)
Trang 9c a proton anome Hai proton còn l i v i H 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz) và H 3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz) t ng
h p ch t BP3 v i benzyl-O--D-glucopyranosid (h p ch t 3 trong tài li u 43) giúp ta xác đ nh đ c h p ch t BP3 là benzyl-O--D-glucopyranosid, m t h p ch t đư bi t t loài Cedronella canariensis [43]
Hình 3.6 C u trúc hóa h c c a h p ch t BP3
3.1.5.4 ả p ch t BP4
H p ch t BP4 thu đ c d i d ng b t màu tr ng, đ quay c c – 48,10
(c= 0,5, MeOH) Trên ph proton xu t hi n 3 tín hi u đ c tr ng cho vòng th m t i các v trí c ng h ng H 7,03 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,83
J = 7,5 Hz), d a vào giá tr J = 7,5 Hz có th suy ra đ ng có c u hình -D và m t tín hi u đ c tr ng c a nhóm methoxy c ng h ng t i v trí H 3,89 (3H, s)
K t qu phân tích ph 13
C-NMR và DEPT cho th y h p ch t BP4 có tín hi u c a 16 carbon trong đó
có 1 nhóm methoxy t i C56,4 ppm; hai tín hi u oxymethylen t i C62,5, 63,2 ppm; 7 tín hi u oxymethin trong kho ng tín hi u t C 71,4 – 105,3 ppm và các tín hi u đ c tr ng cho vòng th m th 3 l n trong kho ng tín hi u C 111,7 – 149,0 ppm
D a vào k t qu phân tích trên và k t h p so sánh v i s li u ph c a h p ch t
có s t ng đ ng t i các v trí tín hi u carbon t ng ng M t khác, so sánh đ quay c c c a h p ch t BP4
và 2 ch t trên có th xác đ nh h p ch t BP4 chính là D-threo-guaiacylglycerol-8-O- -D-glucopyranosid.
Trang 10(ppm)
H a,c
C1 đo trong C5 D5N [117], C2 đo trong CD3 OD at 500 MHz, 125 MHz [78], ađo trong CD3 OD, b125, c 500 MHz
xác đinh c u trúc c a h p ch t BP5, d li u ph NMR c a h p ch t này đ c so sánh v i h p ch t Maltol
môi đo nh ng đây là sai s n m trong gi i h n cho phép kh ng đ nh thêm tính chính xác, s li u ph
NMR c a h p ch t BP5 đ c so sánh v i h p ch t Maltol 6'-O--D-apiofuranosyl--D-glucopyranosid [78],
cho th y hoàn toàn t ng đ ng t i các tín hi u carbon t ng ng S sai khác duy nh t là giá tr carbon t i
v trí C-6' ( C 68.5 so v i 62.5), đó là do t i v trí C-6' c a h p ch t Maltol 6'-O--D-apiofuranosyl-glucopyranosid có thêm 1 phân t đ ng K t h p các d ki n phân tích trên, có th kh ng đ nh h p ch t
-D-BP5 chính là Maltol 3-O- -D-glucopyranosid
O
O
O HO
O
OH 4'2'
6' 5' 1'
3' 2
OH
OH 4
6
O
O
O HO
O
OH OH
xu t hi n tín hi u c ng h ng c a 17 carbon, trong đó có 2 nhóm methoxy t i C 56,9 (x2); 2 nhóm
Trang 11oxymethylen C62,6, 62,1; 9 nhóm methin t i C 106,3 (x 2), 99,8, 82,6, 80,8, 80,5, 79,8, 75,1, 71,9 và 4
carbon b c 4 t i C 149,2 (x 2), 137,0, 129,3 T các s li u cho th y, trong phân t BP6 có ch a m t vòng
th m th 4 v trí m t cách đ i x ng và m t phân t đ ng glucose S chuy n d ch v phía tr ng th p c a các tín hi u C80,8, 79,8, 75,1, 71,9 g i ý cho s đóng vòng t i v trí 1 và 2 c a phân t đ ng So sánh s
đ quay c c c a h p ch t BP6 v i ficuscarpanosid B ( 2',7-epoxy-syringoylglycerol 8-O- glucopyranosid) [93] có th xác đ nh h p ch t BP6 chính là ficuscarpanosid B ây c ng là h p ch t l n đ u
-D-tiên đ c phân l p t chi Bidens
OH O
O O
OH HO HO
O O OH
1 4 7
8 9
1' 2' 5' 6'
Hình 3.10 C u trúc hóa h c và các t ng tác HMBC chính c a h p ch t BP6
3.1.5.7 ả p ch t BP7
xác đ nh chính xác v trí các liên k t c ng nh c u trúc c a đ ng, đư ti n hành đo ph hai chi u HSQC và HMBC Phân tích các t ng tác trên ph HSQC và HMBC m t l n n a kh ng đ nh ph n aglycon
c a h p ch t BP7 có khung quercetin v i s xu t hi n c a t ng tác HMBC gi a H-6 ( H6,20) v i C-5, C-7,
6,84) v i C-1', C-3' và gi a H-6 (H7,56) v i C-2, C-2 , C-4 và C-5 Ngoài ra, t ng tác gi a proton anome
c a phân t đ ng t i H5,58 v i carbon C-3 ( C 133,3) đư xác đ nh v trí liên k t c a g c đ ng này t i
carbon C-3 Các t ng tác c a H-1'' ( H5,58) v i C-3'' ( C 76,9), C-4'' ( C 85,8); H-2'' ( H4,15) v i C-3'' ( C
76,9), C-4'' ( C 85,8); H-3'' ( H3,72) v i C-2'' ( C 82,1), C-4'' ( C 85,8), C-5'' ( C 60,6); H-4'' ( H3,56) v i
C-3'' ( C 76,9) và H-5'' v i C-3'' ( C 76,9), C-4'' ( C85,8) xác đ nh v trí c a các carbon c a phân t đ ng Phân tích đ d ch chuy n hoá h c và các t ng tác trên ph c ng h ng t h t nhân và so sánh v i tài
li u tham kh o [100], c u trúc đ ng đ c xác đ nh là arabinofuranosid, và h p ch t BP7 đ c xác đ nh là
L và đư đ c phân l p t loài Bidens sulphurea [100]
Trang 12đ c phân l p t loài Bidens sulphurea [100]
H a,c
Trang 13T vi c phân tích ph NMR đư xác đ nh c u trúc c a BP1 là 7-phenyl-2-hepten-4,6-diyn-1-ol và trình
Trang 143-[(4'-hydoxy-3'-methoxyphenyl) propan-1,2 diol-2-O- -D- (6''-O-galloyl)-glucopyranosid [68] th y s t ng
đ ng, ch có s sai khác t i v trí C- 5'' và C-6'', ch ng t trong c u trúc c a BP15 không có m t c a phân
t galloyl T đó, xác đ nh h p ch t BP15 là 3-[(4'-hydoxy-3'-methoxyphenyl) propan-1,2 diol-2-O-
-D-glucopyranosid ây là h p ch t l n đ u tiên đ c phân l p t chi Bidens
H3CO
HO
CH2OH 1'
3' 5'
OH OH 1''
3'' 5'' 6'' OH HO
H
a, c
(ppm) mult (J in Hz)
HMBC (H C)
a đo trong DMSO, b
125MHz,c500MHz, # C c a (3S, 6S) -6,7-dihydroxy-dihydrolinalool [62] đo trong pyridin-d 5
K t h p đ i chi u v i tài li u tham kh o [62], h p ch t BP17 đ c xác đ nh là (3S,
OH
1 2 3 4
5 6 7 8
Hình 3.19 C u trúc hóa h c c a h p ch t BP17
