Luận văn tốt nghiệp góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether ly trích từ cây chỉ thiên giả

Flavonoid mang nhiều nhóm –OH, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong các dung môi phân cực như acetone, ethanol, methanol, butanol, nước,… Để phân lập từng chất flavonoid, người ta áp d

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

- -

NGUYỄN NGÔ HUYỀN NHUNG

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO PETROLEUM ETHER

LY TRÍCH TỪ CÂY CHỈ THIÊN GIẢ

(Clerodendrum indicum (L.) O Ktze)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: Hóa học

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ THANH PHƯỚC

Cần Thơ - 2011

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô Bộ môn Hóa –Khoa Khoa học tự nhiên - Trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt bốn năm đại học

Em xin cảm ơn các thầy, cô quản lý, các anh, chị và các bạn ở phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ chuyên sâu – Khoa Khoa học tự nhiên – Trường Đại học Cần Thơ

đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài

Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Hóa học K33, những người bạn yêu quý đã chia sẻ cùng tôi vui buồn suốt quãng đời sinh viên

Xin chân thành cảm ơn!!!

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc

3 Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ chuyên sâu – Khoa Khoa Học

Tự Nhiên – Trường Đại Học Cần Thơ

4 Số lượng sinh viên thực hiện: 1

5 Họ và tên sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngô Huyền Nhung MSSV: 2077025

6 Mục đích yêu cầu: Điều chế các cao thành phần từ cây Chỉ thiên giả Định tính các nhóm hợp chất có trong cao etanol tổng Khảo sát thành phần hóa học của cao petroleum ether

7 Nội dung chính và giới hạn của đề tài: đề tài gồm 4 phần:

Phần I: TỔNG QUAN

Phần II: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

Phần III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN

Phần IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

8 Yêu cầu hổ trợ: Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và kinh phí để thực hiện đề tài

9 Kinh phí dự trù cho việc thực hiện đề tài: 700.000 đồng

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên đề nghị

(Ký tên và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Ngô Huyền Nhung

Ts Lê Thanh Phước

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Lê Thanh Phước

2 Tên đề tài: Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether ly trích từ cây Chỉ thiên giả

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngô Huyền Nhung MSSV: 2077025

4 Lớp: Cử Nhân Hóa Học K33

5 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d Kết luận đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Cán bộ chấm hướng dẫn

Ts Lê Thanh Phước

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Lê Thanh Phước

2 Tên đề tài: Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether ly trích từ cây Chỉ thiên giả

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngô Huyền Nhung MSSV: 2077025

4 Lớp: Cử Nhân Hóa Học K33

5 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệp (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d Kết luận đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Cán bộ chấm phản biện

TÓM TẮT LUẬN VĂN



Cây Chỉ thiên giả (hay còn gọi là cây Ngọc nữ Ấn Độ) có tên khoa học là

Clerodendrum indicum (L.) O Ktze, thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Cây thường

mọc hoang ở ven đường hay bãi đất trống Cây cũng được trồng làm cảnh hoặc sử dụng như một vị thuốc điều trị các bệnh hô hấp, cảm mạo

Trong đề tài luận văn này, chúng tôi tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu, ngâm chiết với cồn 95°, sau đó tiến hành điều chế các cao từ không phân cực đến phân cực Tiến hành sắc ký cột cao petroleum và từ một phân đoạn cao petroleum đã cô lập được một hợp chất tinh khiết

MỤC LỤC



Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về cây Chỉ thiên giả 1

1.1.1 Phân loại khoa học 1

1.1.2 Tổng quan về chi Clerodendrum 1

1.1.3 Phân bố sinh thái 1

1.1.4 Đặc điểm hình thái 2

1.1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 2

1.1.6 Tác dụng dược lý 4

1.2 Tổng quan về các nhóm chức 6

1.2.1 Alkaloid 6

1.2.2 Steroid 6

1.2.3 Flavonoid 7

1.2.4 Glycosid 8

1.2.5 Saponin 9

1.2.6 Tanin 9

1.3 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên 10

1.3.1 Nguyên liệu 10

1.3.2 Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi nguyên liệu 10

1.3.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi nguyên liệu 13

1.4 Các phương pháp sắc ký 16

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 16

1.4.2 Sắc ký cột hở 21

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 26

2.1 Địa điểm 26

2.2 Phương tiện nghiên cúu 26

2.2.1 Phương tiện 26

2.2.2 Hóa chất 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Điều chế cao 27

2.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cao ethanol 27

2.3.3 Khảo sát thành phần hóa học cao petroleum ether 27

Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nguyên liệu 28

3.1.1 Thu hái nguyên liệu 28

3.1.2 Định danh nguyên liệu 28

3.1.3 Xử lý nguyên liệu 28

3.2 Xác định độ ẩm mẫu nguyên liệu 29

3.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 29

3.2.2 Kết quả xác định độ ẩm nguyên liệu 29

3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cao ethanol ly trích từ cây Chỉ thiên giả 30

3.3.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 30

3.3.2 Khảo sát sự hiện diện của steroid 31

3.3.3 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 32

3.3.4 Khảo sát sự hiện diện của glycoside 33

3.3.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin 34

3.3.6 Khảo sát sự hiện diện của tanin 35

3.4 Điều chế các cao thô từ cây Chỉ thiên giả 38

3.4.1 Điều chế cao ethanol 38

3.4.2 Điều chế các cao thành phần 38

3.5 Khảo sát cao petroleum ether 40

3.5.1 Sắc ký cột thường cao petroleum ether 41

3.5.2 Sắc ký cột thường phân đoạn PE VI 43

3.6 Khảo sát sơ bộ hợp chất HN02 45

3.6.1 Khảo sát TLC với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau 45

3.6.2 Một số đặc điểm của chất HN02 46

3.6.3 Khảo sát phổ NMR của chất HN02 46

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

d Doublet (NMR)

 Chemical shift

DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer

EtOAc, Ea Ethyl acetate

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

HPLC High-performance liquid chromatography

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Thân, lá và hoa của cây Chỉ thiên giả 2

Hình 2: Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 15

Hình 3: Giải ly bản mỏng 18

Hình 4: Xác định giá trị Rf 21

Hình 5: Chiết ngâm dầm mẫu cây Chỉ thiên giả 28

Hình 6: Định tính alkaloid 31

Hình 7: Định tính steroid 32

Hình 8: Định tính flavonid 33

Hình 9: Định tính glycosid 34

Hình 10: Định tính saponin 35

Hình 11: Định tính tanin 36

Hình 12: Quy trình điều chế cao thô từ cây Chỉ thiên giả 40

Hình 13: Sắc ký cột thường cao PE 41

Hình 14: Sắc ký cột thường phân đoạn PE VI 43

Hình 15: Kết quả TLC chất HN02 trong 3 hệ dung môi khác nhau 45

Hình 16: Dung dịch HN02 không màu và tinh thể HN02 màu trắng 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Kết quả định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ 37 Bảng 2: Kết quả sắc ký cột thường cao PE 42 Bảng 3: Kết quả sắc ký cột phân đoạn PE VI 44 Bảng 4: So sánh phổ 1

H-NMR của HN02 và stigmasta-5,22,25-trien-3-ol 48 Bảng 5: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của HN02 trong CDCl3 49

LỜI MỞ ĐẦU



Trong một số bài thuốc dân gian để điều trị các bệnh về hô hấp hay cảm mạo có nhắc đến vị thuốc Chỉ thiên (hay Chỉ thiên giả) Qua tìm hiểu thì cây Chỉ thiên giả

(hay còn gọi là cây Ngọc nữ Ấn Độ) có tên khoa học là Clerodendrum indicum (L.) O

Ktze, thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Cây thường mọc hoang ven đường, bãi đất trống hay được trồng làm cảnh ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ nước ta

Hữu ích như vậy nhưng hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về loài cây này Việc sử dụng loài cây này trong các bài thuốc dân gian dựa vào kinh nghiệm dân gian chứ không có cơ sở khoa học

Với mong muốn tìm hiểu thêm về loài cây này, chúng tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether ly trích từ cây Chỉ thiên giả”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Chỉ thiên giả

1.1.1 Phân loại khoa học

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Thực vật có hoa (Magnoliophyta)

Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)

Bộ: Hoa môi (Lamiales)

Họ: Cỏ Roi ngựa (Verbenaceae)

Chi: Clerodendrum

Loài: Clerodendrum indicum

Tên thường dùng: Chỉ thiên giả, Ngọc nữ Ấn Độ

Tên khoa học: Clerodendrum indicum (L.) O Ktze

Tên gọi khác: Tube-flowers, Turk’s Turban

1.1.2 Tổng quan về chi Clerodendrum

Chi Clerodendrum gồm tới 400 loài ở các vùng nhiệt đới và nóng, chủ yếu ở phía đông bán cầu Nhiều loại được trồng làm cảnh hay làm cây thuốc Ở nước ta có khoảng 30 loài

Chi Clerodendrum có thân gỗ hoặc cây nhỡ, mọc đứng hay leo Lá mọc đối hay mọc vòng, đơn, nguyên hoặc có răng cưa, có khi chia thùy và thường có mùi hôi khi ta

vò lá Cụm hoa chùy ở ngọn hoặc nách lá, có lá bắc Đài lợp, hình chuông, có năm cánh Tràng hình ống, không đều, ống mảnh, thường rất dài, phiến chia làm năm thùy không đều nhau Nhị chia làm bốn phần, đính trên ống tràng và thò ra ngoài Bầu có bốn ô, bốn noãn Quả hạch hình cầu được bao bởi phần gốc của đài hoa

1.1.3 Phân bố sinh thái

Cây Chỉ thiên giả phân bố nhiều ở các nước như Ấn Độ, Myanma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia và Việt Nam Ở nước ta cây mọc nhiều ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ

Cây thường mọc ở ven đường hay các bãi đất hoang Ngoài ra nó cũng được trồng như một loại cây cảnh

1.1.4 Đặc điểm hình thái

Chỉ thiên giả là một loại tiểu mộc, cao 1-3.5 m, không nhánh hay có ít nhánh Lá mọc chụm 3-5 lá, phiến lá hẹp dài đến 20 cm, không lông, cuống ngắn, ở mắt có một hàng lông to nối liền cuống

Cụm hoa chùy ở ngọn, có lá đài dài 20-25 cm, rộng 10-15 cm Cụm có ít hoa, mọc vòng Hoa có lông, dài 12-18 mm; hoa có màu trắng sau chuyển dần thành màu kem Đài hình chuông, ống dài 5 mm; thùy hình trái xoan nhọn, có tuyến dày ở trong, dài 10 mm, rộng 4-5 mm Tràng hoa không có lông: ống hình trụ cong, mở về phía trên, dài 8-10 mm Nhị hoa thò ra ngoài, chỉ nhị mảnh, bao phấn thuôn Bầu nhụy tù, không có lông, vòi nhụy rất dài, đầu nhụy chẻ đôi ngắn Quả hạch màu lam đen, nằm trong đài đồng trưởng, rộng đến 12 mm

Hình 1 Thân, lá và hoa của cây Chỉ thiên giả

1.1.5 Một số ngiên cứu trong và ngoài nước 1,2

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi

Clerodendrum Thành phần hóa học chủ yếu của chi này gồm có phenolic, flavonoid, terpenoid và steroid

Một số nghiên cứu về loài cây này ở nước ngoài đã được công bố gồm có:

 Năm 1997, Tain và các cộng sự đã cô lập được nhóm chất cleroindicin A-F từ

các phần trên mặt đất của cây Clerodendrum indicum (L.)

Cleroindicin C: R1 = O, R2 = β-OH, R3 = β-H

Cleroindicin D: R1 = O, R2 =  -OH, R3 = -H

Cleroindicin E: R1 =  -OH, β-H, R2 = -OH, R3 = -H

Nhóm chất cleroindicin A-F là nhóm chất có hoạt tính kháng ung thư, thuộc

nhóm phenolic Cây Clerodendrum indicum được chiết với cồn, sau đó loại béo bằng

PE, phần còn lại sau khi loại béo được đem đi tiến hành sắc ký sẽ thu được cleroindicin

 Năm 1973, Sankara Subramanian, Ramachandran Nair và năm 1993, Gunasegaran cùng với những cộng sự đã cô lập được một số chất thuộc nhóm flavonoid

gồm hispidulin, scutellarein, scutellarein-7-O-β-D-glucuronide từ hoa của cây

H O

Cleroindicin F

(chloroform/methanol/n-propanol/nước) để thu được hispidulin tinh khiết

Hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về cây Chỉ thiên giả

Theo y học dân gian thì cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng bổ đẳng, thông khí,

hạ đờm, tiêu viêm, trừ giun

 Một số bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng cây Chỉ thiên giả

 Trị viêm xoang mũi dị ứng

O

O OH

OH OH

O OH

CO2H OH

OH

Scutellarein-7-O--D-glucuronide

O

Toàn cây viễn chí 12 g, lá hoặc quả từ bi biển (viticis Rotundifoliae) 10 g, lá cây

chỉ thiên (clerodendrum indicum (L.)) 10 g Tất cả đem nấu với 600 ml nước đến khi

sắc lại còn 200 ml chia 2 lần uống/ngày Đơn thuốc này dùng liên tục 7-10 ngày, nghỉ

7 ngày rồi tiếp tục liệu trình

 Chữa viêm phế quản cấp tính

Tía tô 12 g, lá hẹ, kinh giới, mỗi vị 10 g, bạch chỉ, rễ chỉ thiên, mỗi vị 8 g, xuyên khung, trần bì, mỗi vị 6 g Sắc uống ngày một thang

 Chữa cảm mạo, sốt cao, ho

Ngày dùng 16-20 g cây khô, hoặc 50 g cây tươi sao vàng, sắc uống

 Trị ho cho trẻ em khi thời tiết thay đổi

Cây sồi nước (tinh lang), rễ cây chỉ thiên, cây tía tô, các vị trên phơi khô, sắc uống

 Chữa đau lưng, đau khớp

Ớt chín 15 quả, lá đu đủ 3 lá, rễ chỉ thiên 80 g, tất cả giã nhỏ ngâm cồn với tỉ lệ 1:2, xoa bóp sẽ mau khỏi

 Ngoài ra cây Chỉ thiên giả còn được dùng để chữa các bệnh như

Dùng làm thuốc chữa cảm gió, cam tẩu mã, hen suyễn Lá dùng làm thuốc trị giun; còn dùng phối hợp với Trang đỏ, tán bột cuốn như điếu thuốc lá để hút trị mũi có

mủ

 Ở Ấn Độ, người ta dùng rễ cây làm thuốc trị hen suyễn, ho và bệnh lao hạch Nhựa cây dùng trị bệnh thấp khớp do giang mai Dịch lá trộn với sữa lỏng dùng làm thuốc đắp trị phát ban do nấm và bệnh chốc lở (pemphigut) Lá cũng được dùng làm thuốc trừ giun

1.2 Tổng quan về các nhóm hợp chất tự nhiên

1.2.1 Alkaloid

Là nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng nhất về mặt tác dụng sinh lý nhưng cũng

là nhóm phức tạp về phương diện hóa học

Trong thực vật bậc thấp đã tìm thấy khoảng 250 alkaloid ở nấm, ở tảo và các loài khác, nhưng alkaloid phân bố nhiều nhất trong thực vật bậc cao Trong cây một lá mầm đã tìm thấy khoảng 500 alkaloid trong khi đó ở cây hai lá mầm đã tìm thấy khoảng 3600 chất Người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật,… Trong cây alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định

Ví dụ: alkaloid tập trung ở hạt như mã tiền, cà phê,…; ở quả như ớt, hồ tiêu, thuốc phiện,…; ở lá như coca, thuốc lá, chè,…; ở hoa như cà độc dược; ở củ như ô dầu, bình vôi, bách bộ,…

Hàm lượng alkaloid trong cây thường thấp, trừ một số trường hợp như trong cây canhkina hàm lượng đạt 6-10%, trong nhựa thuốc phiện 20-30% Một số dược liệu chứa 1-3% alkaloid đã được coi là chứa hàm lượng alkaloid khá cao

Đa số alkaloid không màu, ở dạng kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc

có khoảng nhiệt độ phân hủy Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài alkaloid có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ)

Alkaloid là một base yếu (do sự có mặt của nguyên tử nitơ) Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R gắn trên nguyên tử nitơ

Phần lớn alkaloid có vị đắng, đặc biệt với một lượng nhỏ alkaloid cũng có thể cho phản ứng trầm hiện với thuốc thử đặc trưng của nó

Trong môi trường acid, alkaloid hiện diện ở dạng muối, dễ tan trong nước và alcol Dạng muối dễ kết tinh, tương đối bền, chúng bị phân hủy bởi ánh sáng mặt trời hoặc tia tử ngoại

1.2.2 Steroid

Sterol thuộc nhóm steroid, là những alcol thể rắn có cấu trúc từ 27-29 nguyên tử

C trong phân tử, Nhưng đều có chung một khung cơ bản là

cyclopentano-perhydrophenantren và một chuỗi ngang với các nhóm methyl (ergostan) hoặc ethyl (stigmastan) đặc biệt là ở C24 Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, -sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…) Sterol phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid

Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester

Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, caroten; tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzene, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, caroten, lecitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn

1.2.3 Flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng nhất trong thiên nhiên, hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Cho đến nay có khoảng

4000 flavonoid đã biết rõ cấu trúc

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa,… Flavonoid có cấu trúc cơ bản kiểu C6-C3-C6, trong đó mỗi C6 là một vòng benzene gắn với C3 Cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside

Khung cyclopentanophenantren

O

O 2 3 4 1

5 6 7 8

2'

3' 4' 5' 6'

Khung flavonoid

Do có nhiều nhóm –OH phenol nên các flavonoid có thể liên kết với nhau để tạo thành chất phức tạp hơn hoặc tạo với các hợp chất khác trong cây ví dụ kết hợp với đường để tạo thành glycoside

Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Phần lớn flavonoid có màu vàng, ví dụ: flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol có màu vàng đến vàng nhạt,… Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu, ví dụ isoflavon kết tinh không màu

Sự phân loại flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl và các mức độ oxy hóa của mạch

C3 Các hợp chất flavonoid được phân thành: flavon, flavanon, flavonol, chalcon, auron, anthocyanidin, isoflavon, rotenoid

Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxy (-OH) và các nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học Ví dụ: flavonoid mang nhiều nhóm –OCH3

và ít nhóm –OH, có tính phân cực yếu nên tan tốt trong dung môi ít phân cực như benzene, chloroform, ethyl acetate Flavonoid mang nhiều nhóm –OH, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong các dung môi phân cực như acetone, ethanol, methanol, butanol, nước,…

Để phân lập từng chất flavonoid, người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột, chất hấp phụ thông dụng là bột polyamid dùng để tách tất cả các các loại flavonoid Có thể dùng các chất khác như silica gel, bột cellulose,… Trong đó, silica gel dùng để tách các flavanon, isoflavon, flavonol Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký lớp mỏng điều chế

1.2.4 Glycoside

Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây:

lá, vỏ, hạt,… Trong cây, chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tan trong các dịch tế bào

Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần aglycon và phần đường Phần aglycon cấu tạo bởi một khung steroid, gắn với C17 là vòng lacton, dựa vào vòng lacton, người ta chia chúng thành 2 nhóm lớn:

- Cardenoid: vòng lactone 5 cạnh, có 1 nối đôi

- Bufadienolid: vòng lactone 6 cạnh, có 2 nối đôi

Phần đường được gắn vào C3 trên khung steroid Cho đến nay, người ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau Ngoài những đường thông thường như glucose, rhamnose, xylose, fucose còn có những đường là 2,6-desoxy

Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong petroleum ether, hexane, benzene nhưng tan được trong chloroform, diethyl ether, tan tốt trong alcol, nước

1.2.5 Saponin

Saponin là một glycoside phân bố khá rộng trong thực vật Người ta đã tìm thấy khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có chứa saponin, ngoài ra saponin còn được tìm thấy ở một số động vật như: hải sâm, cá sao,…

Người ta dựa theo cấu trúc hóa học mà chia hợp chất saponin ra thành hai loại: saponin steroid, saponin triterpenoid

- Saponin triterpenoid: phần genin loại này có 30C, gồm saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

- Saponin steroid: phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn xuất của khung cholestan, gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm saponin steroid alkaloid

Saponin là các chất phân cực mạnh nên tan nhiều trong nước và các alcol bậc thấp, rất ít tan trong aceton, không tan trong ether và hexan Do đó, có thể dùng 3 dung môi này để tủa saponin trong quá trình chiết xuất

Saponin có thể được tủa bởi (CH3COO)2Pb, Ba(OH)2, (sNH4)2SO4 Có thể dùng tính tạo tủa này để phân lập saponin

1.2.6 Tanin

Tanin là loại hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật Tanin có trong lá trà, lá ổi, rượu vang đỏ, nhiều loại trái cây nhất là trong vỏ trái măng cụt,… Các tanin có trọng lượng phân tử khoảng 500-3000

Tanin được phân thành hai nhóm lớn tùy theo cấu trúc hóa học của nó Tùy theo việc tanin đó có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc môi trường acid hay base mà phân thành “tanin thủy giải được” hoặc “tanin hóa đặc” Tanin thủy giải được là

polyester khi bị thủy phân cho ra phần aglycol là polyphenol gồm acid galic hoặc hexahydroxydiphenic Tanin hóa đặc là sự ngưng tụ của những đơn vị flavan

Các tanin do mang nhiều nhóm -OH nên ít nhiều hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt

Khi nếm tanin có cảm giác chát, se lưỡi, do tanin làm kết tủa các enzym có trong nước bọt, làm cho nước bọt mất đi tính chất của nó, làm bề mặt trong của lưỡi trơn láng

Tanin hiện diện với hàm lượng cao trong thực vật, muốn chiết lấy tanin có thể sử dụng dung môi là nước Làm tủa tanin bằng gelatin mặn, bằng cách rót dung dịch gelatin mặn vào dịch chiết, khuấy nhẹ, đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, tanin sẽ tủa

Do dung dịch gelatin mặn có độ nhớt cao nên có thể thay thế bằng dung dịch polyvinylpyrolidon

1.3 Các phương pháp chiết tách hợp chất thiên nhiên

1.3.1 Nguyên liệu

Để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học một loại cây cỏ, trong điều kiện cho phép thì nên dùng nguyên liệu tươi Nguyên liệu sau khi thu hái được làm khô tự nhiên trong mát có quạt hoặc nơi thoáng gió, tránh sử dụng nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu

Nếu nguyên liệu phải thu hái ở nơi xa, có thể bọc vào các túi nhựa sẽ giữ được tươi trong vài ngày Khi thu hái nguyên liệu phải chú ý loại bỏ sâu bệnh Đối với các

bộ phận vỏ, thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh thu hái dược liệu có mang các sinh vật ký sinh

1.3.2 Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi nguyên liệu

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất

tự nhiên có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tuỳ thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp

có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập Như ta đã biết, hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể cómột quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng, vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới

có thể chọn được quy trình phù hợp

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet, Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40°C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt

 Lựa chọn dung môi để chiết tách

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hoà tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ

dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetraclorua,…

Dung môi dùng để chiết cần thỏa các điều kiện sau:

- Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì tổn thất dung môi sẽ lớn, dễ cháy

- Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán

- Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất

- Không tạo thành hỗn hợp nổ đối với không khí, không được có những tạp chất không bay hơi và khi bay hơi không được để lại các tạp chất có mùi lạ

- Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị Không gây mùi lạ đối với sản phẩm và không độc hại với người sử dụng

- Dễ tìm và rẻ tiền

 Một số lưu ý khi sử dụng dung môi để chiết tách các hợp chất

- Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

- Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl) phthalat và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây

cỏ đang khảo sát

- Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như brucin, strychnin, ephedrine,… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước,

sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ

- Diethyl ether ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nổ Peroxid này rất hoạt động, có thể oxid hoá các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid

- Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm

cis-1,2-iol hiện diện trong môi trường acid

- Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thuỷ giải các hợp chất glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycosid tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị

- Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40°C, chưng cất ở nhiệt độ cao có thể làm hư một số hợp chất kém bền nhiệt

 Sự hòa tan các hợp chất trong dung môi

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán

sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết

Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch carbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo,…), các thành phần của tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thực vật (phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,…

Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycosid bị thủy giải, các monoglycosid (chỉ mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu

Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như clorophyl, các glycosid (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với cácacid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrate carbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, oligosacarid, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhầy, chất gôm,…

1.3.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi nguyên liệu

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng

 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng

Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình

là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để dung môi tinh khiết

Phương pháp thực hiện: bột cây được xây thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào

bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bông bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt

Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây

Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng, có nắp đậy

Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc,

cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mất thời gian

Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều, gồm sự ngấm kiệt,

sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet,… Ngoài ra, còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Kỹ thuật chiết lỏng lỏng thường được áp dụng để: chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu, phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo,…); dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometan,…) hoà tan tốt các hợp chất

có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether, aldehyde, ketone, ester,…) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ methanol, nước,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH,…)

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất

có tính phân cực khác nhau (tuỳ độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Hình 2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,

n-butanol,… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi

lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… sau đó cô quay thu hồi dung môi ta thu được cao chiết tương ứng

Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ

n lên trên một tấm kính sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng

Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

1.4 Các phương pháp sắc ký

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC)

 Nguyên lý của phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trong sắc ký lớp mỏng có 4 cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, nhưng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn Các chất cần tách trong TLC có thể khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang đối với phương chuyển động của dung môi

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau

 Chất hấp phụ

 Hiện tượng hấp phụ

Hiện tượng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên

bề mặt một chất rắn Hiện tượng này xảy ra trên bề mặt, do đó độ mịn của chất hấp phụ có tầm quan trọng ảnh hưởng đến mức độ phân tách sắc ký hấp phụ

 Chấm chất phân tích

Cho mẫu phân tích vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm chất này thành một vết nhỏ, gọn lên tấm bản mỏng

Yêu cầu đối với vết chấm:

- Vết chấm phải nhỏ và đều nhau

- Lượng chất phải đồng đều nhau giữa các vết chấm

- Khoảng cách giữa các vết chấm đều nhau

Để đạt được các yêu cầu trên thì ta phải:

- Hòa tan chất thử vào dung môi dễ bay hơi

- Dịch chấm có nồng độ vừa phải, không loãng quá hay đặc quá

- Que chấm (ống mao quản) bé và đều nhau

Nếu có điều kiện thì đặt tấm bản mỏng lên trên một mặt phẳng kim loại nóng để bốc hơi nhanh dung môi hoặc dùng máy sấy tóc để hơ nóng vết chấm sau mỗi lần chấm, nếu không thì ta dùng miệng để thổi cho dung môi bay hơi nhanh hơn

Sau khi chấm hoàn tất, nhúng bản mỏng vào dung môi giải ly được đặt trong bình kín

 Giải ly bản mỏng

 Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình, với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích khoảng 10 mL dung môi Chiều cao của lớp dung môi trong bình không được cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng (vết chấm trên bản mỏng không được ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản mỏng vào bình)

Bình triển khai bản mỏng yêu cầu phải:

- Kín

- Đáy bằng và không rộng lắm

- Có giấy lọc dùng bão hòa dung môi trong bình

- Đong dung môi đúng tỉ lệ đã định và trộn thật đều trước khi rót vào bình

- Cho dung môi bão hòa bình một thời gian trước khi đặt bản mỏng vào

- Trong quá trình giải ly không di chuyển bình, đặt bình vào nơi kín gió

Hình 3 Giải ly bản mỏng

 Các kỹ thuật giải ly bản mỏng

- Dung môi giải ly di chuyển xuống

Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung môi giải ly Người ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bản mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm bản mỏng rồi đi xuống dưới thấp

- Dung môi giải ly di chuyển lên

Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5-1 cm

- Giải ly nhiều lần liên tiếp

Kỹ thuật được áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rf gần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa

- Giải ly hai chiều

Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vuông, thí dụ 20×20 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ dung môi X Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90°, đặt trở lại bình sắc ký để được giải ly với hệ dung môi Y

 Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ được phát hiện bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý

 Phương pháp vật lý

Phương pháp thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV, dụng cụ này có gắn hai bóng đèn UV với hai loại bước sóng là 254 nm và 366 nm

Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia

UV Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm

Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện hợp chất có phát huỳnh quang Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu

 Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử

Các thuốc thử được xếp thành hai loại:

- Thuốc thử không đặc trưng: khi nó tạo vết có màu với hầu hết các loại hợp chất hữu

cơ, thí dụ: iod, sulfuric acid, chất chỉ thị phát huỳnh quang,…

- Thuốc thử đặc trưng: chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng, thí dụ: thuốc thử dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl tạo màu đỏ đậm

 Các công dụng của sắc ký lớp mỏng

Kỹ thuật TLC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên:

- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được

- Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không

- Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát

- Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột

- Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ

- Để kiểm tra biết một hợp chất có kém bền

- Để cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế),…

 Giá trị Rf

Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định Trị số Rf được tính như sau:

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng Trong sắc ký cột, chất hấp phụ được nhồi trong một ống hình trụ gọi là “cột” Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ không phân cực đến phân cực

Sắc ký cột thường được sử dụng để làm sạch hay tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp chất của chúng

b a

R f 

 Lựa chọn chất hấp phụ

Các chất hấp phụ thường dùng: nhôm oxit, silica gel, polyamid, CaCO3,… Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau

Pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và của sắc ký cột phải giống nhau

 Dung môi giải ly cột

Các hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng đều có thể ứng dụng vào sắc ký cột Tuy vậy, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp hoặc có mùi khó chịu hoặc độc thì không nên dùng làm dung môi giải ly cột

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Sau khi đã chọn được thì có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn

Thông thường nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải ly sẽ được tăng dần độ phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lượng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải ly Thí

dụ đang giải ly với ete dầu hỏa, sau đó muốn đổi sang ethyl acetate thì phải thêm từ từ theo tỷ lệ (99:1) (99 mL ete dầu hỏa và 1 mL ethyl acetate), (98:2); (95:5); (90:10); (70:30); (50:50); (10:90); (0:100)

Nếu cho thêm vào đột ngột thì sẽ làm gãy cột do alumine hay silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục

bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt, gãy cột, cột gãy sẽ làm khả năng tách của cột kém đi

Thông thường, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh và được giải ly ra khỏi cột trước còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn (khối lượng phân tử cũng liên quan đến thứ tự giải ly, một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân

tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử nhỏ hơn)

Ngoài ra, chiều cao của lượng chất hấp phụ cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp phụ: đường kính trong của cột vào khoảng 10:1

 Chuẩn bị cột sắc ký

 Nạp chất hấp phụ vào cột

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm trong cột thành một khối đồng nhất

Có hai cách nạp chất hấp phụ vào cột: nạp khô và nạp ướt

Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông gòn để chặn, tiếp theo phủ cát lên để

có được một mặt bằng phẳng

- Nạp khô

Cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột, sau đó cho từ từ bột hấp phụ vào cột, dùng thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều đặn Khi lớp chất hấp phụ đạt chiều cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại trên đầu cột Tiếp tục cho bột hấp phụ vào đến khi cột đạt được chiều cao nhất định Tiếp đến, rót dung môi vào cột và cho chảy liên tục một thời gian để ổn định cột Từ lúc này trở đi không được để khô dung môi ở đầu cột

- Nạp ướt

Chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng ướt được chuẩn bị như sau: