Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetate cây tu hú gmelina asiatica linn

TỔNG QUAN

Đặc diểm thực vật

1.1.1 Giới thiệu về chi Gmelina

Chi Gmelina, được mô tả lần đầu tiên bởi Linnaeus vào năm 1753, dựa trên loài Gmelina asiatica, được đặt theo tên của Johann Georg Gmelina, một giáo sư y học, thực vật học và hóa học tại Tübingen, Đức.

Chi này có nguồn gốc tự nhiên từ Ấn Độ và Nam Trung Quốc, trải dài đến Bắc Úc và Fiji Nhiều loài trong chi này phân bố rộng rãi ở các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới của nhiều quốc gia Một số loài có thể phát triển thành cây gỗ như Gmelina arborea, trong khi các loài khác như Gmelina asiatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippinensis thường được sử dụng làm cây trang trí Tổng số loài trong chi này ước tính từ 33 đến 40, trong đó có 31 loài đã được công nhận.

Các loài Gmelina thường là cây cao hoặc cây bụi, với đặc điểm bạnh vè, bao gồm các loài phổ biến như Gmelina asiatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippinensis Ngoài ra, còn có một số loại cây bụi hoặc cây nhỏ như Gmelina uniflora stapf, và một số loài có gai như Gmelina asiatica, Gmelina elliptica và Gmelina philippinensis Lá của các cây này thường có từ 3 đến 7 thùy.

1.1.2 Giới thiệu về loài Gmelina asiatica

Tên khoa học: Gmelina asiatica

Hệ thống phân loại khoa học:

Cây bụi, đôi khi leo, cao 2 - 4 m, hiếm khi rụng lá Cành nhỏ có lông khi còn non; cây lớn thường xuất hiện gai, dài tới 25 mm [4]

Lá có hình dạng elip với đỉnh tròn và rìa chia thành 5 thùy Mặt trên của lá nhẵn hoặc có một ít lông, màu xanh đậm và sáng bóng, trong khi mặt dưới nhẵn hoặc có vài sợi lông trên tĩnh mạch, màu trắng và phủ vảy da Đôi khi, lá có 3 gân từ gốc, với cuống lá dài từ 5-30 mm, nhẵn hoặc chỉ có một ít lông vảy.

Cụm hoa hình cầu, đôi khi xuất hiện ở nách lá trên các chồi bên ngắn, dài 1,5

Cây có chiều cao khoảng 10 cm, hình thoi hoặc mọc thẳng, với lông thưa và phủ vảy trắng Tràng hoa có 4 thùy, lông màu vàng và tuyến thưa; môi trước chia thành 3 thùy Nhị hoa nằm chèn vào đỉnh của ống, tạo nên vẻ đẹp sáng chói.

Quả (sấy khô) 13 - 30 x 8 - 30 mm, nhẵn, đỉnh tròn, màu vàng [4]

Cây được trồng tại Ấn Độ và Sri Lanka, Bắc Thái Lan, Bắc Việt Nam, Malaysia và phổ biến khắp vùng nhiệt đới [4]

Hình 1.1 Cây Tu hú 1.2 Các nghiên cứu về dược tính

1.2.1 Các nghiên cứu về dược tính trong chi Gmelina

Trong chi Gmelina có 31 loài, nhưng chỉ có Gmelina asiatica và Gmelina arborea được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Bài viết này sẽ trình bày một số nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của Gmelina arborea.

Bảng 1.1 Dược tính của loài Gmelina arborea thuộc chi Gmelina

Dược tính Mô tả chi tiết TLTK

Cao chiết methanol của thân cây có tác dụng bắt gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) với giá trị

IC50 là (19.20; 14.10 và 28.94 àg/ mL); tổng khả năng chống oxi hoá là (412.69; 518.45 và 390.41 mg/gam dịch chiết)

Cao chiết methanol của vỏ thân cây có khả năng ức chế DPPH là 85,2 %, giá trị IC50 bắt gốc nitrogen oxide là 93.6 ± 0.98 àg/mL

Sáu hợp chất flavonoid đã được phân lập từ cao chiết methanol của lá cây và được kiểm tra hoạt tính chống gốc tự do bằng phương pháp DPPH Kết quả cho thấy giá trị nồng độ IC50 của các hợp chất này dao động từ 5.70 đến 14.40 µg/mL.

Hạ đường huyết và chống tăng mỡ máu

Nghiên cứu này chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ Gmelina arborea có khả năng hạ đường huyết và giảm mỡ máu hiệu quả ở chuột mắc bệnh tiểu đường.

Nghiên cứu này sử dụng chuột từ 10-12 tuần tuổi và hòa tan 100 mg bột lá trong 1000 mL nước Kết quả cho thấy có sự thay đổi đáng kể về các chỉ số HbA1c, glucose, urea, creatinine, protein, albumin, globulin, SGOT, SGPT và ALP.

Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng dịch chiết là không độc hại và có tác dụng chống đái tháo đường

Chống tiêu chảy, sốt thương hàn, nhiễm trùng vết thương

Cao chiết thô của lá cây gây ức chế sự phát triển của khuẩn Escherichia coli gây bệnh

Tăng khả năng làm lành vết thương

Nghiên cứu thử nghiệm dịch chiết methanol từ bột lá khô Gmelina arborea với liều 200 mg/kg trọng lượng chuột cho thấy hiệu quả cao trong việc co rút vết thương và phá vỡ u hạt.

Kháng tế bào ung thư

Chiết xuất ethanol từ lá Gmelina arborea đã cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư, cụ thể là COLO 201 (ung thư ruột) với giá trị IC50 là 20 ± 0.15 mg/mL, HT-29 (ung thư dạ dày) với IC50 là 12 ± 0.32 mg/mL, và TE-2 (ung thư thực quản) với IC50 là 16 ± 0.05 mg/mL.

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tính của loài Gmelina asiatica

Bảng 1.2 Dược tính của loài Gmelina asiatica thuộc chi Gmelina

Dược tính Mô tả chi tiết TLTK

Cao chiết methanol từ thân cây cho thấy khả năng chống lại DPPH và gốc NO với giá trị IC50 lần lượt là 18.38 và 78.18 µg/mL Tổng hàm lượng phenolic trong cao chiết methanol đạt 4800 ± 24.53 mg/g, trong khi tổng hàm lượng flavonoid là 28.54 ± 0.18 mg/g.

Cao chiết chloroform và ethanol từ các bộ phận trên mặt đất của Gmelina asiatica đã được nghiên cứu về khả năng bảo vệ gan chuột khỏi tổn thương do CCl4 gây ra Liều thử nghiệm 400 mg/kg được sử dụng bằng đường uống mỗi ngày một lần.

Kết quả cho thấy nồng độ enzyme huyết thanh như aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT) và phosphatase kiềm huyết thanh (SALP) đã tăng cao, trong khi tổng số bilirubin đã phục hồi về mức bình thường.

Nghiên cứu cho thấy chiết xuất methanol từ vỏ cây Gmelina asiatica có khả năng giảm đáng kể hàm lượng glucose trong máu, với mức giảm lần lượt là 25.8% ở liều 100 mg/kg, 28.9% ở liều 250 mg/kg và 32.4% ở liều 500 mg/kg trọng lượng cơ thể.

Kháng khuẩn Cao chiết chloroform và ethyl acetate của Gmelina asiatica cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nhẹ chống lại [14]

C diphtheriae ở nồng độ 20 mg/mL Cao chiết ether dầu hỏa ức chế chống lại C diphtheriae ở nồng độ 50 mg/mL

Cao chiết với chất lỏng siêu tới hạn của lá và thân cây

Gmelina asiatica cho thấy khả năng kháng nấm Malassezia furfur gây ra gàu Kết quả cho thấy nồng độ ức chờ́ tối thiểu (MIC) là 15.6 àg/mL

Các nghiên cứu về thành phần hoá học

hỏa ức chế chống lại C diphtheriae ở nồng độ 50 mg/mL

Cao chiết với chất lỏng siêu tới hạn của lá và thân cây

Gmelina asiatica cho thấy khả năng kháng nấm Malassezia furfur gây ra gàu Kết quả cho thấy nồng độ ức chờ́ tối thiểu (MIC) là 15.6 àg/mL

Cao chiết ethyl acetate từ rễ Gmelina asiatica đã được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư vú, cho thấy dòng tế bào MCF-7 dương tính với thụ thể estrogen, trong khi dòng MDA-MB-231 âm tính Giá trị IC50 được xác định là 32.9 ± 3.8 μg/mL cho dòng tế bào MCF-7 và 19.9 ± 2.3 μg/mL cho dòng MDA-MB-231.

- Dịch chiết chloroform của các bộ phận trên mặt đất của

Gmelina asiatica được tiêm vào chuột , với liều điều trị

200 và 400 mg/kg trong 14 ngày Vào ngày 15, số lượng tế bào ung thư hạch bạch huyết giảm đáng kể trong khối u của chuột

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hoá học

1.3.1 Thành phân hoá học trong loài Gmelina asiatica

Năm 2016, Florence A.R và Regini Balasingh G.S đã nghiên cứu thành phần hóa học từ dịch chiết lá cây Gmelina asiatica, và kết quả cho thấy lá cây chứa nhiều nhóm hợp chất đa dạng như alkaloid, carbohydrate, glycoside, coumarin, quinone, saponin, steroid, terpenoid, protein, phytosterol, tannin và flavonoid.

Bảng 1.3 Phân tích thành phần hoá học cơ bản trong loài Gmelina asiatica Nhóm các hợp chất

Dịch chiết Nước Pet.ether Chloroform Ethanol Acetone

(-) Không hiện diện; (+) hiện diện thấp; (++) hiện diện trung bình; (+++) hiện diện cao

Năm 2015, nghiên cứu bằng phương pháp GC-MS trên cao chiết ethanol từ lá cây G asiatica đã phát hiện sự hiện diện của một số hợp chất béo và các hợp chất steroid như stigmasta-5,22-dien-3-ol, triterpene như chondrillasterol và methyl commated, cùng với 18-oleanene.

Năm 1975, A.S.R Anjaneyulu, A Madhusudiiana Rao, V Kameswara Rao và

L Ramachandra Row đã cô lập được một số hợp chất từ cao methanol của loài

Gmelina asiatica như methyl p-methoxy-cinnamate (6), sitosterol (7), paulownin

(8), gmelinol (9), methyl p-hydroxy-cinnamate (10) và cycloolivil (11) [20]

1.3.2 Thành phần hoá học một số loài trong chi Gmelina

Thành phần hoá học của chi Gmelina vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Bảng 1.3 giới thiệu thành phần hoá học của hai loài Gmelina được khảo sát nhiều nhất, đó là Gmelina arborea.

Bảng 1.4 Một số hợp chất đã được cô lập từ loài Gmelia arbora, Gmelia philippensis, thuộc chi Gmelina

Loài Hợp Chất Bộ phận Kí hiệu

6-O-α-L-(2-O-trans-cinnamoyl-3''- O-isovaleryl) rhamnopyranosylcatalpol Hoa 18 [22]

6-O- α -L-(2'',3''-di-O-trans-p-hydroxycinnamoyl) rhamnopyranosylcatalpol Hoa 19 [22]

6-O- α -L-(3''-,4''-di-O-trans-cinnamoyl) rhamnopyranosylcatalpo Hoa 21 [22]

6-O- α -L-(2''-,3''-di-O-trans-cinnamoyl) rhamnopyranosylcatalpol Hoa 22 [22]

Trên mặt đất 27 [23] 6-O-(3''-O-trans-cinnamoyl)- α -L- Trên mặt 28 [23] rhamnopyranosylcatalpol đất

Trên mặt đất 29 [23] 6-O-(3''-O-benzoyl)- α -L- rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Trên mặt đất 30 [23] 6-O-(3''-O-trans-cinnamoyl)- α –L- rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Trên mặt đất 31 [23] 6-O-(3''-O-cis-cinnamoyl)- α -L- rhamnopyranosylcatalpol heptaacetate

Một số hợp chất khác

2-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 35 [22] 3-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 36 [22] 2-O-cis-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 37 [22] 1-O-trans-Cinnamoyl- α -L-rhamnopyranose Hoa 38 [22] 3-O-trans-p-Methoxycinnamoyl- α -L- rhamnopyranose Hoa 39 [22]

Trên mặt đất 45 [25] 4''-O-cis-p-coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol Trên mặt đất 46 [25] 6-O- α -L-(2'', 3''-O-dibenzoyl, 4''-O-trans-p- coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 48 [25] 6-O- α -L-(2'',3''-O-dibenzoyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 49 [25] 6-O- α -L-(3'', 4''-O-dibenzoyl)- rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 50 [25] 6-O- α -L-(2'', 4''-O-dibenzoyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 51 [25] 6-O- α -L- (2''-O-trans-p-methoxycinnamoyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 52 [25] 6-O- α -L- (3''-O-trans-p-methoxycinnamoyl) rhamnopyranosylcatalpol

Trên mặt đất 53 [25] 6-O- α -L- (2''-O-trans-p-coumaroyl) rhamnopyranosylcatalpol

Catalpol Trên mặt đất 45 [25] acid Geniposidic Trên mặt đất 56 [25]

Gardoside Trên mặt đất 57 [25] acid 8-epi-loganic Trên mặt đất 58 [25] 1-O-(8-epi-loganoyl)-β-D-glucopyranose Trên mặt đất 59 [25] 6-O- α -L-rhamnopyranosylcatalpol Trên mặt đất 60 [25]

 Công thức hoá học một số hợp chất trong chi Gmelina

THỰC NGHIỆM

Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu trong luận văn là phần trên mặt đất của cây Tu hú (Gmelina asiatica), được thu hái tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương vào tháng 11 năm 2023.

2019 Được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

Cây Tu hú tươi được rửa sạch và đem phơi khô trong mát Sau đó, cây được sấy khô ở 60 o C (40.0 kg)

2.3 Điều chế các loại cao

Cây Tu hú (Gmelina asiatica Linn.) được phơi khô và nghiền thành bột mịn với khối lượng 40.0 kg Bột mịn này được trích xuất bằng methanol thông qua phương pháp ngâm, sau đó lọc và cô quay dung môi dưới áp suất thấp, thu được cao methanol thô với khối lượng 417 g Tiếp theo, cao methanol được chiết lỏng-lỏng bằng các dung môi n-hexane và ethyl acetate, tạo ra các cao phân đoạn tương ứng.

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế phân đoạn cao ethyl acetate từ cây Tu hú

Cô quay thu hồi dung môi

Chiết lỏng – lỏng lần lượt với dung môi n-hexane, ethyl acetate

2.4 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate

Phân đoạn cao ethyl acetate (279.2 g) được tách chiết bằng sắc kí cột silica gel, sử dụng hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% ethyl acetate, sau đó tiếp tục giải ly bằng hệ dung môi ethyl acetate – methanol với độ phân cực từ 0% đến 100% methanol Dịch giải ly được thu vào các lọ và quá trình giải ly được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) Các lọ có kết quả SKLM tương tự được gộp lại thành một phân đoạn, dẫn đến việc thu được tổng cộng 16 phân đoạn (EA 1 - ).

16), được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA

STT Phân đoạn Khối lượng

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 EA1 15.32 Nhiều vết Chưa khảo sát

2 EA2 13.81 Nhiều vết Khảo sát

3 EA3 20.93 Vệt dài Chưa khảo sát

2.4.1 Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao EA2

Phân đoạn EA2 (13.81 gam) cho SKLM có nhiều vết và được tách rõ ràng Phân đoạn EA2 được thực hiện bằng cách sử dụng silica gel SKC, giải ly với hệ dung môi chloroform - methanol với độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% methanol Các bước thực hiện tương tự như trong sắc ký cột phân đoạn EA Kết quả thu được 10 phân đoạn (EA2.1 – EA2.10), được trình bày trong bảng 2.2.

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA2

(gam) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

1 EA2.1 0.5282 Nhiều vết Khảo sát

4 EA2.4 0.9987 Nhiều vết Chưa khảo sát

8 EA2.8 0.8988 Vệt dài Chưa khảo sát

Phân đoạn EA2.1 (0.5282 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi n-hexane - chloroform 7:3 thu được hợp chất GA7 (3.2 mg)

Phân đoạn EA2.2 (0.8401 g) được sắc kí cột silica gel với dung môi chloroform - methanol 98:2, thu được hợp chất GA8 (4.9 mg) và với dung môi chloroform - methanol 93:7, thu được hợp chất GA10 (21.4 mg) Phân đoạn EA2.3 (0.6215 g) cũng được sắc kí cột silica gel, sử dụng dung môi chloroform, thu được hợp chất GA2 (6.1 mg) và GA4 (16.4 mg).

Phân đoạn EA4 (18.00 gam) cho SKLM nhiều vết được thực hiện với SKC silica gel, sử dụng hệ dung môi ethyl acetate – methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 50% methanol Các bước thực hiện tương tự như khi sắc ký cột phân đoạn EA2, kết quả thu được 5 phân đoạn (EA4.1 – EA4.5), như trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4

Phân đoạn EA4.1 (2.3 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi n-hexane – chloroform 1:1 thu được hợp chất GA11 (6.5 mg)

Phân đoạn EA4.2 (3.1 g) được sắc kí cột silica gel với dung môi n-hexane – chloroform 1:1, thu được hợp chất GA1 (13.0 mg), và sử dụng dung môi chloroform - methanol 95:5 để thu được hợp chất GA3 (26.9 mg) Trong khi đó, phân đoạn EA4.3 (2.9 g) cũng được sắc kí cột silica gel, giải ly với dung môi chloroform - methanol 95:5, cho ra hợp chất GA5 (28.4 mg).

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chất GA1, GA2, GA3, GA4, GA5, GA7, GA8, GA10, GA11

EA9 16.68 g Sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate

Sắc ký cột với hệ dung môi chloroform - methanol Sắc ký cột với hệ dung môi ethyl acetate – methanol

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA1

Hợp chất GA1 (13.0 mg) thu được từ phân đoạn EA4.2 với các đặc điểm sau:

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi n-hexane - chloroform (1:1) cho kết quả hấp thu UV Vết màu được hiện bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, cho vết màu vàng với giá trị Rf = 0.34.

- Phổ 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 1, 1a và bảng 3.1)

- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 1b và bảng 3.1)

- Phổ HSQC (CDCl3) (phụ lục 1c)

- Phổ HMBC (CDCl3) (phụ lục 1d)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA1 cho tín hiệu cộng hưởng của năm proton vòng thơm trong vùng δH 7.71-6.36, trong đó có ba proton ở δH 7.71 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz) và 7.05 (1H, d, J = 8.5 Hz) giúp dự đoán ba proton này gắn trên vòng thơm có ba nhóm thế ở vị trí 1, 2, 4 Hai proton thơm còn lại ghép cặp meta cộng hưởng ở δH 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.36 (1H, d, J =2.0

Hz) Ngoài ra, phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của ba nhóm methoxy ở δH

Phổ 13 C-NMR kết hợp với HSQC thấy hợp chất GA1 có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 178.8-92.2 đặc trưng cho hợp chất flavone Trong đó, một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 178.8 và các carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC 165.5-138.9 Ngoài ra phổ đồ còn có tín hiệu của ba nhóm methoxy ở δC

Qua các dữ liệu NMR ở trên cho phép dự đoán hợp chất GA1 là một flavone có 3 nhóm methoxy

Tín hiệu cộng hưởng của –OH tạo kiềm nối ở δH 12.63 giúp dự đoán vị trí C-5 mang nhóm –OH

Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxy ở δH 3.86 tương quan với carbon tại δC 138.9, đề xuất vị trí C-3 mang nhóm methoxy Sự tương quan từ proton của nhóm methoxy ở δH 3.88 và hai proton ghép cặp meta ở 6.45 và 6.36 đến carbon ở δC 165.5 giúp dự đoán C-7 gắn nhóm methoxy Proton của nhóm -OH ở δH 6.00 tương quan HMBC đến carbon δC 114.6, cho thấy nhóm -OH này gắn tại C-4'.

146.4 giúp dự đoán nhóm methoxy còn lại gắn C-3'

Dựa vào các dữ liệu phổ NMR và sự so sánh với hợp chất 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone, số liệu NMR của GA1 cho thấy sự tương đồng rõ rệt Do đó, cấu trúc của hợp chất GA1 được đề nghị là 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone.

Hình 3.1 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA1

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA1 với 5,4'-dihydroxy-3,7,3'- trimethoxyflavone

GA1 (CDCl3) 5,4'-dihydroxy-3,7,3'- trimethoxyflavone (CDCl3) [26] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm)

3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất GA3

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform – methanol (95:5) cho kết quả hấp thu UV, được hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20% sau khi hơ nóng ở nhiệt độ cao, tạo ra vết màu vàng với Rf = 0.48.

- Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) (phụ lục 2 và bảng 3.2)

- Phổ 13 C-NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 2a và bảng 3.2)

- Phổ HSQC (DMSO-d 6 ) (phụ lục 2b)

- Phổ HMBC (DMSO-d 6 ) (phụ lục 2c)

Phổ 1 H-NMR của GA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn proton methine vòng thơm ghép cặp ortho với nhau ở δH 7.97 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', H-6') và 6.96

Hợp chất GA3 có hai vòng thơm, bao gồm một vòng bốn nhóm thế và một vòng có hai nhóm thế đối xứng Trong phổ NMR, các proton methine ghép cặp meta xuất hiện tại δH 6.73 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-8) và 6.37 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng của proton hai nhóm methoxy được ghi nhận ở δH 3.86 (s, 7-OCH3) và 3.80 (s, 3-OCH3) Hơn nữa, một proton của nhóm hydroxy kiềm nối xuất hiện ở δH 12.66 (1H, s, 5-OH) và một proton của nhóm hydroxy tự do ở δH 10.30 (1H, s, 4'-OH).

Hợp chất GA3 được xác định là một flavone thông qua phân tích phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC Trong đó, carbon >C=O hiện diện ở δC 178.0, cùng với các carbon mang oxygen ở vùng δC 165.1-137.8 Đặc biệt, khác với GA1, GA3 chỉ có tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δC 59.7 và 56.0 trên phổ 13 C-NMR.

Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên nhận thấy GA5 là một flavone có hai nhóm methoxy

Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate

Phân đoạn cao ethyl acetate (279.2 g) được tách bằng phương pháp sắc kí cột silica gel, sử dụng hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% ethyl acetate, sau đó tiếp tục giải ly bằng hệ dung môi ethyl acetate - methanol với độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% methanol Dịch giải ly được hứng vào các lọ và quá trình giải ly được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) Những lọ có kết quả SKLM giống nhau được gộp lại thành một phân đoạn, cuối cùng thu được 16 phân đoạn (EA 1 - EA 16).

16), được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA

Sắc kí lớp mỏng Ghi chú

Phân đoạn EA2 (13.81 gam) cho SKLM nhiều vết đã được tách rõ ràng bằng SKC silica gel, sử dụng hệ dung môi chloroform - methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Các bước thực hiện tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn EA, kết quả thu được 10 phân đoạn (EA2.1 – EA2.10), được trình bày trong bảng 2.2.

Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn cao ethyl acetate EA2

Phân đoạn EA2.1 (0.5282 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi n-hexane - chloroform 7:3 thu được hợp chất GA7 (3.2 mg)

Phân đoạn EA2.2 (0.8401 g) đã được sắc kí cột silica gel, sử dụng dung môi chloroform - methanol tỉ lệ 98:2 để thu được hợp chất GA8 (4.9 mg) và dung môi chloroform - methanol tỉ lệ 93:7 để thu được hợp chất GA10 (21.4 mg) Trong khi đó, phân đoạn EA2.3 (0.6215 g) cũng được sắc kí cột silica gel, giải ly với dung môi chloroform, cho ra hợp chất GA2 (6.1 mg) và GA4 (16.4 mg).

Phân đoạn EA4 (18.00 gam) cho SKLM với nhiều vết được tách rõ ràng bằng cách sử dụng silica gel SKC Quá trình giải ly được thực hiện với hệ dung môi ethyl acetate – methanol, với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 50% methanol Các bước thực hiện tương tự như khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn EA2 Kết quả thu được gồm 5 phân đoạn (EA4.1 – EA4.5), được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4

Phân đoạn EA4.1 (2.3 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel, giải ly với hệ dung môi n-hexane – chloroform 1:1 thu được hợp chất GA11 (6.5 mg)

Phân đoạn EA4.2 (3.1 g) được sắc kí cột silica gel với dung môi n-hexane – chloroform 1:1, thu được hợp chất GA1 (13.0 mg) và với dung môi chloroform - methanol 95:5, thu được hợp chất GA3 (26.9 mg) Phân đoạn EA4.3 (2.9 g) cũng được sắc kí cột silica gel, sử dụng dung môi chloroform - methanol 95:5, cho hợp chất GA5 (28.4 mg).

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chất GA1, GA2, GA3, GA4, GA5, GA7, GA8, GA10, GA11

EA9 16.68 g Sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate

Sắc ký cột với hệ dung môi chloroform - methanol Sắc ký cột với hệ dung môi ethyl acetate – methanol

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA1

- Chất hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi n-hexane - chloroform theo tỷ lệ 1:1 cho kết quả hấp thu UV, với vết màu vàng hiện lên khi xử lý bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, có giá trị Rf là 0.34.

- Phổ HSQC (CDCl3) (phụ lục 1c)

- Phổ HMBC (CDCl3) (phụ lục 1d)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA1 cho tín hiệu cộng hưởng của năm proton vòng thơm trong vùng δH 7.71-6.36, trong đó có ba proton ở δH 7.71 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz) và 7.05 (1H, d, J = 8.5 Hz) giúp dự đoán ba proton này gắn trên vòng thơm có ba nhóm thế ở vị trí 1, 2, 4 Hai proton thơm còn lại ghép cặp meta cộng hưởng ở δH 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.36 (1H, d, J =2.0

Hz) Ngoài ra, phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của ba nhóm methoxy ở δH

Phổ 13 C-NMR kết hợp với HSQC thấy hợp chất GA1 có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 178.8-92.2 đặc trưng cho hợp chất flavone Trong đó, một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 178.8 và các carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC 165.5-138.9 Ngoài ra phổ đồ còn có tín hiệu của ba nhóm methoxy ở δC

Tín hiệu cộng hưởng của –OH tạo kiềm nối ở δH 12.63 giúp dự đoán vị trí C-5 mang nhóm –OH

Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxy tại δH 3.86 tương quan với carbon ở δC 138.9, cho thấy vị trí C-3 mang nhóm methoxy Sự tương quan từ proton của nhóm methoxy ở δH 3.88 và hai proton ghép cặp meta ở 6.45 và 6.36 đến carbon ở δC 165.5 gợi ý rằng C-7 cũng gắn nhóm methoxy Proton của nhóm -OH tại δH 6.00 tương quan HMBC với carbon ở δC 114.6, cho thấy nhóm -OH này gắn tại C-4' Cuối cùng, tương quan HMBC của proton ở δH 7.05 đến carbon δC cung cấp thêm thông tin về cấu trúc phân tử.

146.4 giúp dự đoán nhóm methoxy còn lại gắn C-3'

Dựa trên các dữ kiện phổ NMR và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone, số liệu NMR của GA1 cho thấy sự tương đồng rõ rệt Do đó, cấu trúc của hợp chất GA1 được đề nghị là 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavone.

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA1 với 5,4'-dihydroxy-3,7,3'- trimethoxyflavone

GA1 (CDCl3) 5,4'-dihydroxy-3,7,3'- trimethoxyflavone (CDCl3) [26] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm)

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform – methanol (95:5) cho kết quả hấp thu UV, và màu sắc được hiện bằng dung dịch sulfuric acid 20% sau khi hơ nóng ở nhiệt độ cao, tạo ra vết màu vàng với Rf = 0.48.

- Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) (phụ lục 2 và bảng 3.2)

- Phổ 13 C-NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 2a và bảng 3.2)

- Phổ HSQC (DMSO-d 6 ) (phụ lục 2b)

- Phổ HMBC (DMSO-d 6 ) (phụ lục 2c)

Phổ 1 H-NMR của GA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn proton methine vòng thơm ghép cặp ortho với nhau ở δH 7.97 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', H-6') và 6.96

Hợp chất GA3 có cấu trúc phức tạp với hai vòng thơm, bao gồm một vòng bốn nhóm thế và một vòng có hai nhóm thế đối xứng Các proton methine ghép cặp meta xuất hiện ở δH 6.73 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-8) và 6.37 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) Bên cạnh đó, phổ đồ cũng cho thấy tín hiệu của hai nhóm methoxy ở δH 3.86 (s, 7-OCH3) và 3.80 (s, 3-OCH3), cùng với một proton của nhóm hydroxy kiềm nối ở δH 12.66 (1H, s, 5-OH) và một proton của nhóm hydroxy tự do ở δH 10.30 (1H, s, 4'-OH).

Hợp chất GA3 được xác định là một flavone thông qua phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC Cụ thể, một carbon >C=O cộng hưởng tại δC 178.0, trong khi các carbon mang oxygen cộng hưởng trong khoảng δC 165.1-137.8 Đặc biệt, khác với GA1, GA3 chỉ hiển thị tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δC 59.7 và 56.0 trên phổ 13C-NMR.

Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên nhận thấy GA5 là một flavone có hai nhóm methoxy

Tín hiệu cộng hưởng của nhóm –OH tại δH 12.66 cho thấy vị trí C-5 có nhóm –OH Đồng thời, proton của nhóm methoxy tại δH 3.86 có mối tương quan HMBC với carbon thơm ở δC 137.8, xác định nhóm methoxy đầu tiên gắn tại vị trí C-3 Ngoài ra, proton của nhóm methoxy tại δH 3.80 cũng có tương quan HMBC với carbon δC.

165.2 giúp xác định nhóm methoxy thứ hai này gắn ở vị trí C7

Dựa trên các dữ liệu phổ NMR và so sánh với hợp chất 5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxylflavone (kumatakenin), số liệu NMR của GA3 cho thấy sự tương đồng rõ rệt Do đó, chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất GA3 là 5,4'-dihydroxy-3,7-dimethoxylflavone (kumatakenin).

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA3 với kumatakenin

GA3 (DMSO-d 6 ) Kumatakenin (DMSO-d 6 ) [27] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

Sắc kí lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform – methanol (95:5) cho kết quả hấp thu UV, với vết màu vàng xuất hiện khi xử lý bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, có giá trị Rf là 0.3.

- Phổ HRESIMS (Phụ lục 3): cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 269.0465

- Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) (phụ lục 3a và bảng 3.3)

- Phổ 13 C-NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 3b và bảng 3.3)

Phổ HRESIMS của GA5 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 269.0465 phù hợp với công thức phân tử C15H10O5 ([M-H] - = 269.0450), sai số 0.0015

Phổ 1 H-NMR của GA5 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn proton methine vòng thơm ghép cặp ortho với nhau ở δH 7.92 (2H, dd, J = 7.0, 1.5 Hz, H-2', H-6') và 6.93 (2H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz, H-3', H-5'), hai proton methine vòng thơm ghép cặp meta với nhau ở δH 6.48 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-8) và 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-

Hợp chất GA5 bao gồm hai vòng thơm, trong đó có một vòng với bốn nhóm thế và một vòng khác có hai nhóm thế đối xứng Bên cạnh đó, GA5 còn có tín hiệu cộng hưởng của một proton olefin tại δH 6.77 (1H, s, H-3) và một proton của nhóm hydroxy kiềm nối ở δH 12.95 (1H, s, OH-5).

Phổ 13 C-NMR cho thấy GA5 có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 181.7 - 94.8 đặc trưng cho hợp chất flavone Chứng tỏ GA5 là một flavonoid có cấu trúc tương tự như GA1 và GA3, tuy nhiên, GA5 không có sự hiện diện nhóm methoxy Qua những dữ kiện phổ NMR nói trên và phổ HRESIMS kết hợp với dữ liệu phổ của hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavone (apigenin) [28] cho thấy số liệu NMR của GA5 tương đồng với số liệu NMR của apigenin nên đề nghị cấu trúc hợp chất GA5 là 5,7,4'-trihydroxyflavone (apigenin)

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất GA5 (apigenin)

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA5 với apigenin

GA5 (DMSO-d 6 ) Apigenin (DMSO-d 6 ) [28] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

- Chất dạng bột, màu vàng cam, tan tốt trong dung môi DMSO

Sắc kí lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform cho phép phát hiện các vết hấp thu UV Sau khi xử lý bằng dung dịch sulfuric acid 20% và nung nóng ở nhiệt độ cao, vết màu xuất hiện với sắc vàng cam, có giá trị Rf là 0.38.

- Phổ 1 H-NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) (phụ lục 4a, 4b và bảng 3.4)

- Phổ 13 C-NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 4c, 4d và bảng 3.4)

- Phổ HQSC (DMSO-d 6 (phụ lục 4e)

- Phổ HMBC (DMSO-d 6 ) (phụ lục 4f)

Phổ HRESIMS của GA4 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 367.1194 phù hợp với công thức phân tử C21H20O6 ([M-H] - = 367.1182), sai số 0.0012

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA4 cho thấy có sự hiện diện của hai nhóm hydroxy tự do ở δH 9.64 (2H, s), hai cặp proton olefin có cấu hình trans ở δH 7.54 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-4/ H-4'), 6.75 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-3/ H-3') Đồng thời, phổ đồ còn hiện diện tín hiệu proton của hai vòng benzene có ba nhóm thế ở vị trí 1,

2, 4 ở δH 7.32 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-6/ H-6'), 7.15 (2H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-10/ H-10'), 6.82 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-9/ H-9') Ngoài ra, hợp chất GA4 còn xuất hiện tín hiệu một proton olefin ở δH 6.06 (1H, s) và hai nhóm methoxy ở δH 3.84 (-OCH3, s)

Phổ 13 C-NMR kết hợp phổ HSQC của hợp chất GA4 cho thấy hợp chất có 21 carbon, trong đó có một tín hiệu cộng hưởng của hai carbon carbonyl ở C 183.1 (C- 2/ C-2'), bốn carbon thơm mang oxygen ở C 149.3 (C-8/ C-8'), 147.9 (C-7/ C-7') Các carbon vòng thơm khác cộng hưởng trong vùng C 140.6 đến 100.7 Ngoài ra, trên phổ còn xuất hiện tín hiệu của hai nhóm methoxy ở C 55.7 (2x-OCH3)

Trên phổ NMR, tín hiệu cộng hưởng của proton và carbon xuất hiện với cường độ gấp đôi so với tín hiệu C-1, cho thấy GA4 có cấu trúc đối xứng Điều này chỉ ra rằng mỗi vòng benzene trong cấu trúc này mang một nhóm hydroxy và một nhóm methoxy.

Bốn proton vòng thơm ở δH 7.31 (H-6/H-6') và 7.14 (H-10/H-10') cho tương quan HMBC đến carbon olefin ở δC 140.6 (C-4/C-4'), xác định vị trí liên kết đôi gắn trực tiếp vào vòng benzene tại C-5/C-5' Hai proton olefin ở δH 7.54 (H-4/H-4') và 6.75 (H-3/H-3') tương quan HMBC đến carbon >C=O ở δC 183.1 (C-2/C-2'), xác định vị trí liên kết đôi tại C3-C4 Proton nhóm methoxy ở δH 3.84 tương quan đến carbon ở δC 147.9 (C-7/C-7'), xác định vị trí hai nhóm -OCH3 ở carbon 7 và 7' Hai proton -OH ở δH 9.64 tương quan đến bốn carbon ở δC 149.3 (C-8/C-8') và 115.7 (C-9).

C-9') giúp xác định vị trí nhóm hydroxy này ở vị trí C-8/ C-8' Một số tương quan khác được trình bày trong hình 3.4

Dựa trên các dữ kiện phổ NMR kết hợp với phổ HR-ESI-MS và dữ liệu của hợp chất (1E, 6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) hepta-1,6-diene-3,5-dione (curcumin), số liệu NMR của GA4 cho thấy sự tương đồng với curcumin, do đó, cấu trúc của hợp chất GA4 được đề nghị là curcumin.

(curcumin) Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA4 với curcumin

GA4 (DMSO-d 6 ) Curcumin (DMSO-d 6 ) [29] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

- Chất dạng bột, màu trắng, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform (100%) cho thấy màu nâu khi được hiện bằng dung dịch sulfuric acid 20% và được hơ nóng ở nhiệt độ cao, với giá trị Rf là 0.4.

- Phổ 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 5a, 5b, 5c và bảng 3.5)

- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 5d, 5e và bảng 3.5)

Phổ HRESIMS của GA2 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 443.3789 phù hợp với công thức phân tử C30H50O2 ([M+H] + = 443.3889), sai số 0.01

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA2 cho thấy có sự hiện diện của một cặp tín hiệu hai proton olefin ở δH 4.68 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-29a) và 4.57 (1H, dd, J =2.0, 1.0

Hz, H-29b), một tín hiệu proton gắn trên carbon mang oxygen của >CH-O- ở δH

3.19 (1H, dd, J = 11.0, 4.5 Hz, H-3) và sáu tín hiệu methyl mũi đơn tại δH 1.68 (3H, s, H-30), 1.03 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, s, H-23), 0.97 (3H, s, H-27), 0.83 (3H, s, H-

25) và 0.76 (3H, s, H-24) Ngoài ra, trên phổ đồ còn có hai tín hiệu proton methylene không tương đương của carbon carbinol tại H 3.79 (1H, d, J = 10.5 Hz, H-28a) và 3.33 (1H, d, J = 10.5 Hz, H-28b)

Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA2 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon Trong đó xuất hiện những tín hiệu đặc trưng của khung sườn lupane với một carbon olefin tứ cấp tại C 150.5 (C-20), một carbon methylene olefin tại δC 109.7 (C-29), một carbon oxymethine tại δC 79.0 (C-3) và một carbon methylene mang dị tố oxygen tại C 60.6 (C-28)

Dựa trên các dữ liệu phổ NMR, phổ HR-ESI-MS và so sánh với thông tin về hợp chất betulin, số liệu NMR của GA2 cho thấy sự tương đồng rõ rệt với betulin Do đó, chúng tôi đề xuất cấu trúc của hợp chất GA2 là betulin.

Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất GA2 (betulin) Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA2 với betulin

GA2 (CDCl3) Betulin (CDCl3) [30] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

- Chất dạng bột, màu vàng, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi n-hexane - chloroform (7:3) cho kết quả hấp thu dưới đèn tử ngoại Khi hiện màu bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, vết cho màu vàng cam với giá trị Rf = 0.3.

- Phổ 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 6a, 6b và bảng 3.6)

- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 6c, 6d và bảng 3.6)

Phổ HRESIMS của GA7 cho mũi ion phân tử giả ở m/z = 253.0500 phù hợp với công thức phân tử C15H10O4, ([M-H] - = 253.0501), sai số 0.0001

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA7 cho thấy có sự hiện diện của năm tín hiệu proton vòng thơm ở δH 7.83 (1H, dd, J = 7.5, 1.0 Hz, H-5), 7.67 (1H, dd, J = 8.5,

(1H, dd, J = 1.5, 0.5 Hz, H-2), một tín hiệu proton của nhóm methyl ở δH 2.47 (3H, s) Ngoài ra, trên phổ đồ còn có hai tín hiệu proton -OH kiềm nối ở δH 12.12 (1H, s, 8-OH) và 12.02 (1H, s, 1-OH)

Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA7 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 carbon Trong đó xuất hiện những tín hiệu cộng hưởng của hai carbon carbonyl >C=O ở δC

Hai tín hiệu cộng hưởng của carbon vòng benzene được ghi nhận ở 192.6 (C-9) và 182.1 (C-10), cùng với các tín hiệu của carbon gắn với oxygen ở δC 162.8 (C-1) và 162.5 (C-8) Thêm vào đó, có một tín hiệu của carbon nhóm methyl ở δC 22.3 Các tín hiệu của các carbon vòng benzene khác nằm trong khoảng δC 149.4 – 113.8.

Dựa trên các dữ liệu phổ NMR kết hợp với phổ HR-ESI-MS và thông tin từ hợp chất chrysophanol, chúng tôi nhận thấy rằng số liệu NMR của GA7 tương đồng với chrysophanol Do đó, chúng tôi đề xuất cấu trúc của hợp chất GA7 là chrysophanol.

Hình 3.6 Cấu trúc của hợp chất GA7 (chrysophanol) Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA7 với chrysophanol

GA7 (CDCl3) Chrysophanol (DMSO-d 6 ) [31] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

Hợp chất GA8 (4.9 mg) thu được từ phân đoạn EA2.2 với các đặc điểm như sau:

- Chất dạng bột, màu trắng, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng dung môi chloroform - methanol (98:2) cho thấy vết hấp thu UV, được hiện hình bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, tạo ra vết không màu với giá trị Rf là 0.30.

- Phổ 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 7 và bảng 3.7)

- Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 7a và bảng 3.7)

- Phổ HMBC (CDCl3) (Phụ lục 7b)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA8 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefin ghép trans ở δH 7.64 (1H, dd, J = 16.0 Hz, H–7), 6.30 (1H, dd, J = 16.0, H–

8), tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên vòng benzene ở δH 7.43 (2H, d, J = 9.0

Hz, H–3/ H–5), 6.85 (2H, d, J = 8.5 Hz, H–2/ H–6) Ngoài ra, dữ liệu phổ còn cho thấy có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng proton nhóm methoxy ở δH 3.80 (s, – OCH3)

Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA8 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của mười carbon Trong đó xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một carbon carbonyl tại δC

Phổ đồ cho thấy sự hiện diện của hai carbon olefin tại δC 144.7 (C–7) và 115.2 (C–8) Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng của carbon vòng thơm gắn oxygen xuất hiện tại δC 157.8 (C–4), cùng với bốn carbon benzene tại δC 130.0 (C–2/C–6) và 115.9 (C–3/C–5) Thêm vào đó, có một carbon benzene tứ cấp tại δC 127.2 (C–1) và một carbon methoxy tại δC 51.7 (–OCH3).

Tương quan HMBC của proton nhóm methoxy ở δH 3.80 (C-10) đến carbon

>C=O ở δC 168.0 (C–9) giúp xác định vị trí nhóm methoxy Ngoài ra, proton olefin ở δH 7.64 (H–7) cho tương quan HMBC đến các carbon ở δC 168.0 (C–9), 130.0 (C– 2/ C–6) và 115.2 (C–8) với proton olefin tại ở δH 6.30 (H–8) đến các carbon ở δC

168.0 (C–9) và 127.1 (C–1) giúp xác định vị trí liên kết đôi nằm tại C7 và C8 Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.7

Dựa trên các dữ kiện phổ NMR đã nêu và kết hợp với dữ liệu phổ NMR của hợp chất methyl 4-hydroxy cinnamate, có thể xác định rằng dữ liệu phổ NMR của hợp chất này có những đặc điểm tương đồng đáng chú ý.

GA8 sự tương đồng với methyl 4–hydroxy cinnamate nên đề nghị cấu trúc hợp chất GA8 là methyl 4–hydroxy cinnamate

Hình 3.7 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA8 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA8 với methyl 4–hydroxy cinnamate

GA8 (CDCl3) Methyl 4–hydroxy cinnamate

(CDCl3) [32] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

- Chất dạng bột, màu trắng, tan tốt trong dung môi methanol

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi chloroform - methanol tỷ lệ 93:7 cho kết quả là vết hấp thu UV, được hiện hình bằng dung dịch sulfuric acid 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, tạo ra vết không màu với Rf = 0.3.

- Phổ 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) (phụ lục 8, 8a và bảng 3.8)

- Phổ 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (phụ lục 8b, 8c và bảng 3.8)

- Phổ HMBC (CD3OD) (Phụ lục 8d, 8e)

- Phổ HMBC (CD3OD) (Phụ lục 8f, 8g)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA10 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefin ghép trans ở δH 7.48 (1H, d, J = 16.0 Hz, H–7), 6.53 (1H, d, J = 16.0 Hz, H–

8), năm tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên vòng benzene ở δH 7.53 (2H, d, J 8.5 Hz, H–2/ H–6), 7.33 (2H, m, H–3/ H–5) và 7.36 (1H, m, H –4) giúp dự đoán hợp chất GA10 là một vòng benzene có một nhóm thế

Phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC của hợp chất GA10 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của chín carbon Trong đó xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai carbon olefin tại δC 141.4 (C–7) và 126.1 (C–8) Phổ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của carbon benzene trong vùng δC 128.5 – 130.1 Như vậy, hợp chất GA10 có cấu trúc tương tự hợp chất GA8

Tương quan HMBC của hai proton olefin tại δH 7.48 (H–7) và 6.53 (H–8) đến carbon >C=O ở δC 176.1 (C–9) cho phép xác định vị trí của nhóm carbonyl liên hợp Hình 3.8 trình bày thêm một số tương quan HMBC khác.

Dựa vào các dữ kiện phổ NMR và so sánh với dữ liệu của acid cinnamic, có thể thấy rằng dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA10 tương đồng với acid cinnamic Do đó, cấu trúc của hợp chất GA10 được đề nghị là acid cinnamic.

Hình 3.8 Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất GA10 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA10 với acid cinnamic

GA10 (CD3OD) acid cinnamic (CD3OD) [33] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm)

- Chất hình kim, không màu, tan tốt trong dung môi chloroform

Sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi n-hexane - chloroform theo tỷ lệ 1:1 cho vết hấp thu UV, được hiện hình bằng dung dịch acid sulfuric 20% và hơ nóng ở nhiệt độ cao, tạo ra vết vàng với Rf = 0.42.

- Phổ HMBC (CDCl3) (Phụ lục 9c)

- Phổ HMBC (CDCl3) (Phụ lục 9d)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA11 cho tín hiệu cộng hưởng của hai proton vòng thơm ghép cặp meta ở δH 6.36 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) và 6.56 (1H, d, J = 2.5

Hz, H-8), một proton thơm δH 6.66 (1H, s, H-3), tín hiệu của vòng thơm mang 1 nhóm thế ở δH 7.85 (2H, m, H-2',6') và 7.48 (3H, m, H-3',4',5') Ngoài ra, phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methoxy ở δH 3.94 (3H, s) và 3.90 (3H, s)

Phổ 13 C-NMR kết hợp với HSQC cho thấy hợp chất GA11 có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 177.7-93.0 đặc trưng cho khung flavone Trong đó, một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 177.7 và các carbon thơm mang oxygen cộng hưởng trong vùng δC 164.2-160.0 Ngoài ra phổ đồ còn có tín hiệu của hai nhóm methoxy ở δC 56.5 và 55.8

Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxy ở δH 3.94 (3H, s) tương quan với carbon thơm mang oxygen C-5 tại δC 161.1, đề xuất rằng vị trí C-5 mang nhóm methoxy Ngoài ra, sự tương quan từ proton của nhóm methoxy ở δH 3.90 (3H, s) cũng tương quan với carbon thơm mang oxygen C-7 tại δC 164.2, cho thấy vị trí C-7 cũng mang nhóm methoxy.

Dựa trên các dữ liệu phổ NMR và so sánh với hợp chất chrysin 5,7-dimethyl ether, số liệu NMR của GA11 cho thấy sự tương đồng rõ rệt Do đó, cấu trúc của hợp chất GA11 được đề xuất là chrysin 5,7-dimethyl ether.

(Chrysin 5,7-dimethyl ether ) Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GA11 với chrysin 5,7-dimethyl ether

GA11 (CDCl3) Chrysin 5,7-dimethyl ether

(CDCl3) [34] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ cây Tu hú thu hái thu hái tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương vào tháng

Vào năm 2019, phương pháp ngâm dầm đã được áp dụng để điều chế cao methanol thô, từ đó chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được cao ethyl acetate Cao ethyl acetate sau đó được sắc ký cột để tách các phân đoạn cao EA, và tiếp tục được sắc ký cột nhiều lần với các hệ dung môi khác nhau, cho ra 9 hợp chất được ký hiệu là GA1.

GA3, GA5, GA4, GA2, GA7, GA8, GA10, GA11

Các hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc bao gồm flavone (GA1 - 5,4'-đihydroxy-3,7,3' trimethoxyflavone; GA3 - kumatakanin; GA5 - apigenin; GA11 - chrysin 5,7 dimethyl ether), triterpenoid (GA2 - betulin) và anthraquinone (GA7).

(chrysophanol)), phytopolyphenol (GA4 (curcumin)), acid cinnamic và dẫn xuất

(GA8 (methyl 4–hydroxy cinnamate), GA10 (acid cinnamic))

Bảng 4.1 Cấu trúc các hợp chất đã phân lập được

Trong số 9 hợp chất được cô lập, hợp chất GA8 là duy nhất đã được phát hiện trong loài Gmelina asiatica, trong khi 8 hợp chất còn lại đều là những phát hiện mới trong chi Gmelina.

 Tiếp tục nghiên cứu phân lập các hợp chất trên các phân đoạn cao chưa được khảo sát của cây Tu hú

 Khảo sát hoạt tính của các hợp chất cô lập được

Udhayasankar, and T Baluprakash, S N Suresh, “Potent in vitro cytotoxic effect of Gmelina arborea Roxb (Verbenaceae) on Three Human Cancer Cell lines”, International Journal of Pharma Sciences and Research

[2] M.A Ghareeb, H.A Shoeb, H.M.F Madkour, L.A Refahy, M.A Mohamed and

A M Saad, “Antioxidant and cytotoxic activities of flavonoid compounds from Gmelina arborea Roxb”, Global Journal of Pharmacology, 8(1), 87-

[3] Phạm Hoàng Hộ, “Cỏ cây Việt Nam”, nhà xuất bản Trẻ, 829, 1999

[4] Rogier de Kok, “A revision of the genus Gmelina (Lamiaceae)”, Kew

[5] H.A Shoeb, H.M.F Madkour, L.A Refahy, M.A Mohamed, A.M Saad and M

A Ghareeb, “Antioxidant and cytotoxic activities of Gmelina arborea

Roxb, Leaves”, British Journal of Pharmaceutical Research, 4(1), 125-

[6] S.M Patil, V.J Kadam, and R Ghosh, “In vitro antioxidat activity of methanolic extract of stem bark of Gmelina arborea Roxb (Verbenaceae)”,

International Journal of PharmTech Research, 1(4), 1480-1484, 2009

[7] D Punitha, A Thandavamoorthy, K Arumugasamy, S Natarajan , U Danya, and M R Udhayasankar, “Anti – Hyperlipidemic effect of ethanolic leaf extract of Gmelina Arborea in streptozotocin induced male wistar albino rats”, Research Article, 2(3), 223-332 , 2012

[8] P Kumaresan, K.A Jeyanthi, R Kalaivani, “Biochemical evaluation of anti diabetic activity of aqueous extract of Gmelina arborea in Alloxan induced albino rats”, International Journal of Herbal Medicine , 2(2), 90-94, 2014

The study by El-Mahmood, Doughari, and Kiman investigates the in vitro antimicrobial properties of crude extracts from the leaves and stem bark of Gmelina arborea (Roxb) The research specifically focuses on the effectiveness of these extracts against various pathogenic species within the Enterobacteriaceae family.

[10] A Shirwaikar1, S Ghosh, G.M Padma, P.M Rao, “Effect of Gmelina arborea Roxb leaves on wound healing in rats”, Journal of Natural Remedies, 3(1), 45-48, 2003

[11] N Silvia, T Satyanaraya, “Phytochemical and antioxidant studies on methanolic extract of Gmelina asiatica Linn stem”, International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 6(2), 276-281, 2014

[12] N.J Merlin, and V Parthasarathy, “Antioxidant and hepatoprotective activity of chloroform and ethanol extracts of Gmelina asiatica aerial parts”,

Journal of Medicinal Plants Research, 5(4), 533-538, 2011

[13] R Kasiviswanath, A Ramesh, and K.E Kumar, “Hypoglycemic and antihyperglycemic effect of Gmelina asiatica Linn In normal and in alloxan induced diabetic rats”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28(4), 729-

[14] C Mahendra, D.V Gowda, U.V Babu, “Insignificant activity of extracts of

Gmelina asiatica and Ipomoea digitata against skin pathogens”, Journal of Pharmaceutical Negative Results, 6(1), 123-132, 2015

[15] C Mahendra, D.V Gowda, M Vijayakumar, U.V Babu, “Anti-Dandruff activity of supercritical fluid extracts of Rosemarinus officinalis and Gmelina asiatica Indo”, American Journal of Pharmaceutical Research,

[16] M.K Balijepalli, S Tandra, P.M Rao, “Antiproliferative activity and induction of apoptosis in estrogen receptor-positive and negative human breast carcinoma cell lines by Gmelina asiatica roots”, Pharmacognosy Research, 2(2), 113-119, 2010

[17] N.J Merin and V Parthasarathy, “Potential antitumour activity of Gmelina asiatica aerial parts against dalton ascites lymphoma in mice”, Asian Journal of Chemistry, 22(4), 345-367, 2010

[18] A.R Florence, and G.S Regini Balasingh, “Phytochemical analysis of

Gmelina asiatica L leaves”, International Journal of Chemical Studies,

[19] A.R Florence and S Jeeva, “FTIR and GC-MS spectral analysis of Gmelina asiatica L leaves”, Science Research Reporter, 5(2), 125-136, 2015

[20] A.S.R Anjaneyulu, A Madhusudiiana Rao, V Kameswara Rao and L

Ramachandra Row, “The lignans of Gmelina asiatica”, Phytochemistry, 14,

[21] A.M Ghareeb, H A Shoeb, H.M.F Madkour, L.A Refahy, M.A Mohamed and A M Saad, “Anti oxidant and cytotoxic activities of flavonoidal compounds from Gmelina arborea Roxb”, Global Journal of Pharmacology, 8(1), 87-97, 2014

[22] W Gu, X.J Hao, H.X Liu, Y.U Wang, C.L Long, “Acylated iridoid glycosides and acylated rhamnopyranoses from Gmelina arborea flowers” Phytochemistry Letters, 6(2), 681–685, 2013

[23] N Tiwari, K Akhilesh, Yadav, P Srivastava, K Shanker, K Ram, Verma,

M Madan, Gupta, “Iridoid glycosides from Gmelina arborea”, Phytochemistry 69, 2387–2390, 2008

[24] S Falah, T Katayama, T Suzuki, “Chemical constituents from Gmelina arborea bark and their antioxidant activity”, The Japan Wood Research Society, 54, 483–489, 2008

[25] E Helfrich, H Rimpler, “Iridoid glycosides from Gmelina philippensis.”

[26] Lai-King Sy, Geoffrey D Brown, “Three sesquiterpenes from Artemisia annua”, Phytochemistry, 48 (7), 1207- 1211, 1998

[27] Z Xiuyun, L Bogang, Z Min, Y Xiaohong, Z Goulin, “Chemical constituents of Buddleja brachystachya Diels”, China J Appl Environ,

The study conducted by D.G Lee et al (2012) published in the Journal of Agricultural Chemistry and Environment investigates the presence of apigenin in Blumea balsamifera Linn DC and evaluates its inhibitory effects on aldose reductase in rat lenses The findings highlight the potential of apigenin as a natural compound with therapeutic benefits against aldose reductase, which is significant in the context of diabetic complications.

[29] A.M Anderson, M.S Mitchell, R.S Mohan, “Isolation of curcumin from

Turmeric”, Journal of chemical education, 77(3), 359-362 2000

[30] A Tijjani, I.G Ndukwe and R.G Ayo, “ Isolation and characterization of lup-20(29)-ene-3,28- diol (betulin) from the stem-Bark of Adenium obesum (Apocynaceae)”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research April,

[31] D Knut, W.A Dagfinn and W.F George, “NMR Study of some anthraquinones from Rhubarb”, Magnetic Resonance in Chemistry, 30, 359-

[32] M Qayum, M Nisar, M Raza Shah, W.A Kaleem, A Wahab, S Abbas, B

Rehman, “Antioxidant potential and chemical constituents of impatiens bicolor Royle”, Intermational Journal of Bassic Medical Sciences and Pharmacy, 3(1), 2049-4963, 2013

[33] L Gao, X Xu, H Nan, J Yang, G Sun, H Wu and M Zhong, “Isolation of cinnamic acid derivatives from the root of Rheum tanguticum Maxim.ex

Balf and its significance”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(5), 929-

[34] H Haberlein and K.P Tschiersch, “Triterpenoids and flavonoids from

Phụ lục 1 Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA1

Phụ lục 1a Phổ 1 H-NMR dãn rộng của hợp chất GA1

Phụ lục 1b Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA1

Phụ lục 1c Phổ HSQC của hợp chất GA1

Phụ lục 1d Phổ HMBC của hợp chất GA1

Phụ lục 2a Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA3

Phụ lục 2b Phổ HSQC của hợp chất GA3

Phụ lục 2c Phổ HMBC của hợp chất GA3

Phụ lục 3 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GA5

Phụ lục 3a Phổ 1 H-NMR của hợp chất GA5

Phụ lục 4b Phổ 1 H-NMR dãn rộng của hợp chất GA4

Phụ lục 4c Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA4

Phụ lục 4d Phổ 13 C-NMR dãn rộng của hợp chất GA4

Phụ lục 4e Phổ HSQC của hợp chất GA4

Phụ lục 4f Phổ HMBC của hợp chất GA4

Phụ lục 5c Phổ 1 H-NMR dãn rộng của hợp chất GA2

Phụ lục 5d Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA2

Phụ lục 5e Phổ 13 C-NMR dãn rộng của hợp chất GA2

Phụ lục 6c Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA7

Phụ lục 6d Phổ 13 C-NMR dãn rộng của hợp chất GA7

Phụ lục 7a Phổ 13 C-NMR của hợp chất GA8

Phụ lục 7b Phổ HMBC của hợp chất GA8

Phụ lục 8c Phổ 13 C-NMR dãn rộng của hợp chất GA10

Phụ lục 8d Phổ HSQC của hợp chất GA10

Phụ lục 8e Phổ HSQC dãn rộng của hợp chất GA10

Phụ lục 8f Phổ HMBC của hợp chất GA10

Phụ lục 8g Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GA10

Phụ lục 9c Phổ HSQC của hợp chất GA11

Tiêu đề	Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cao Ethyl Acetate Cây Tu Hú (Gmelina asiatica Linn.)
Tác giả	Huỳnh Văn Dũng
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết
Trường học	Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Hóa hữu cơ
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	104
Dung lượng	4,75 MB

Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetate cây tu hú gmelina asiatica linn

TỔNG QUAN

Đặc diểm thực vật

Các nghiên cứu về thành phần hoá học

THỰC NGHIỆM

Nguyên liệu

Phân lập một số hợp chất hữu cơ trong phân đoạn cao ethyl acetate

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA1

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA3

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA5

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA4

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA2

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA7

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA8

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA10

Khảo sát cấu trúc hợp chất GA11