Ph©n tö protein cã mét sè ph¶n øng hãa häc ®Æc trng nh ph¶n øng Biure, ph¶n øng Xanthoprotein, ph¶n øng Pauli, ph¶n øng Xacaguchi…Trong sè c¸c ph¶n øng kÓ trªn cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t [r]
Trang 1Bài 1: thực nghiệm về protein và amino acid
I Các phản ứng màu
Phân tử protein có một số phản ứng hóa học đặc trng nh phản ứng Biure, phản ứng Xanthoprotein, phản ứng Pauli, phản ứng Xacaguchi…Trong số các phản ứng kể trên có phản ứng dùng để phát hiện sự có mặt của liên kết peptide, có phản ứng dùng để phát hiện các acid amin chứa nhân thơm trong phân tử protein…Chính nhờ những phản ứng đó mà ngời ta có thể định tính
và định lợng protein trong dung dịch
1 Phản ứng Biure
a Nguyên lý
Trong môi trờng kiềm, các chất có liên kết pepitide sẽ tác dụng với Cu2+ tạo thành phức chất có màu tím hồng Cờng độ màu của phản ứng phụ thuộc vào lợng Cu2+ và số lợng các liên kết peptide có trong phân tử protein Phản ứng này giống nh phức hợp 2 phân tử ure với 1 ion Cu2+ nên
có tên là phản ứng Biure
Cơ chế phản ứng
b Tiến hành
+ ống 1: cho vào ống nghiệm khoảng 0,1g ure Đun trên ngọn lửa đèn cồn đến khi ure nóng chảy; để nguội sẽ đợc biure
+ ống 2: 1 ml lòng trắng trứng
+ ống 3: 1 ml dung dịch gelatin 1%
+ ống 4: khoảng 1 ml sữa tơi
Cho thêm vào mỗi ống 1 ml NaOH 10%, 1-2 giọt CuSO4 1%
Lắc đều, quan sát, so sánh và giải thớch kết quả
c ứng dụng
- Phát hiện protein trong vật phẩm
- Trong môi trờng kiềm mạnh, phức hợp màu ở dới dạng anion Phản ứng này tạo phức hợp có màu bền, ổn định, đợc dùng để định lợng protein
2 Phản ứng Xantoprotein
a Nguyên lý
Các protein có chứa amino acid mạch vòng nh: phenylanaline, tyrosine, tryptophan, vv… dới tác dụng của HNO3 đặc, nhân thơm của các amino acid bị gắn nitro sẽ tạo thành dẫn xuất nitro
có màu vàng Nếu gặp môi trờng kiềm mạnh thì dẫn xuất này sẽ tạo thành muối có cấu tạo dạng quinoid có màu vàng da cam
Cơ chế phản ứng:
b Tiến hành
Trang 2Cho vào 3 ống nghiệm
- ống 1: 1 ml dung dịch lũng trắng trứng
- ống 2: khoảng 1 ml s a t ữ ươi
- ống 3: 1 ml dung dịch gelatin 1%
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml HNO3 đặc, đun trên ngọn lửa đèn cồn, đến khi xuất hiện màu vàng Sau khi để nguội, cho từ từ từng giọt NaOH 20% (khoảng 1-2 ml) cho đến khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng da cam
Nhận xét và giải thích kết quả
c ứng dụng
- Phát hiện protein trong vật phẩm
- Kiểm tra chất lợng protein
II Các phản ứng sa lắng protein
Protein hòa tan trong nớc thành dung dịch keo a nớc Trong dung dịch các tiểu phần protein cùng loại tích điện cùng dấu, xung quanh tiểu phần protein có lớp vỏ thủy hóa (phân tử l ỡng cực liên kết với nhóm phân cực nh – OH, - COOH, - NH2, ) Nhờ hai yếu tố trên, protein tồn tại dới dạng dung dịch keo bền vững Protein sẽ kết tủa nếu làm mất hai yếu tố hòa tan trên nh sau :
- Làm mất điện tích của tiểu phần protein bằng cách :
+ Đa pH của dung dịch protein về pH đẳng điện (pHi) của protein đó, khi pH của dung dịch bằng với pHi của protein, đa số các protein ở dạng lỡng cực, không mang điện tích
+ Thêm chất điện giải NaCl, (NH4)2SO4…các ion này sẽ trung hòa điện tích của tiểu phần protein
- Làm mất lớp vở thủy hóa bằng cách :
+ Gây biến tính protein, cấu trúc của protein sẽ bị đảo lộn bằng cách đun sôi, thêm muối kim loại nặng, thêm acid, base mạnh và các tác nhân lý học
+ Thêm các chất hút nớc nh rợu etylic, tanin…
Những biến đổi này đợc phân làm 2 loại:
+ Biến đổi thuận nghịch: tức là dung dịch keo có thể trở lại trạng thái ban đầu sau khi khử tác nhân đi Thuộc loại biến đổi này gồm có các phản ứng: phản ứng diêm tích, tác dụng nhẹ của cồn, axeton ở nhiệt độ thấp
+ Biến đổi không thuận nghịch: protein bị biến đổi hoàn toàn, bị hủy hoại, mà rõ nhất là mất tính hòa tan trong nớc Thuộc loại biến đổi này gồm: phản ứng gây sa lắng bởi các muối kim loại nặng, phản ứng của các alkaloit, acid hoặc kiềm mạnh, đun sôi
1 Phản ứng diêm tích (phơng pháp dùng muối)
a Nguyên lý
Diêm tích là phơng pháp dùng các muối nh: NaCl, (NH4)2SO4 để kết tủa protein Nguyên nhân kết tủa là do các tiểu phần protein bị trung hòa điện tích Các protein khác nhau sẽ tủa ở những nồng độ muối khác nhau Vì vậy có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp Ví dụ globulin có trong lợng phân tử lớn hơn albumin, trong nớc globulin tích điện (-) ít hơn albumin, globulin bị kết tủa ở nồng độ amoni sulfat bán b o hòa, còn albumin kết tủa ở nồng độ b o hòa Sự kết tủa này thuận nghịch, khi giảm nồng độã ã
muối bằng cách pha lo ng với nã ớc hay thẩm tích thì globuline và albumine sẽ hòa tan trở lại
b Tiến hành
- ống 1: lấy 3 ml lòng trắng trứng, 3 ml dung dịch (NH4)2SO4 b o hòa lắc đều ta đã ợc dung dịch bán
b o hòa, ở nồng độ này globulin bị sa lắng, để 5 phút, lọc sang ống nghiệm 2.ã
- ống 2: Cho vào ống 2 bột (NH4)2SO4, vừa cho vừa lắc, đến khi b o hòa ã Ở nồng độ sulfate amon bóo hũa, albumin sẽ sa lắng Để 5 phỳt Lọc sang ống nghiệm 3
- ống 3: thu được sẽ mang thử bằng phản ứng biure
c ứng dụng
- Kết tủa bằng cách này các protein không bị biến tính nghĩa là các tính chất lý hóa, sinh vật học không bị thay đổi Ngời ta thờng dùng phơng pháp này để chiết suất các protein hoạt tính
2 Sa lắng bằng cồn
a Nguyên lý
Protein bị kết tủa bông hoặc vẩn trong dung môi hữu cơ nh : cồn, aceton, eter, Phản ứng tủa do protein bị mất lớp vỏ thủy hóa, tủa càng dễ nếu có thêm các chất điện giải NaCl
Trang 3Kết tủa bằng cồn có thể là kết tủa thuận nghịch nếu tiến hành ở nhiệt độ thấp (O đến – 15 C)
và tủa đợc tách khỏi cồn một cách nhanh chóng
b Tiến hành
- ống 1 : 1 ml cồn 96o
- ống 2: 1 ml cồn 96o, thêm vào 1-2 giọt NaCl b o hòaã
Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch lòng trắng trứng
- ống 3: 1ml cồn 96o, 1ml dung dịch gelatin 1%
Nhận xét và giải thích kết quả
c ứng dụng
- Dùng cồn sát trùng khi tiêm hoặc phẫu thuật
- Dùng để tách chiết enzyme
3 Sa lắng bởi nhiệt độ cao
a Nguyên lý
Protein khi đun nóng sẽ bị xáo trộn về mặt phân tử, mất lớp vỏ thủy hóa nên mất tính hòa tan và bị đông vón Hiện tợng này xảy ra mạnh ở điểm đẳng điện Nếu sự biến tính này xảy ra ở pH khác nhau (trong môi trờng kiềm mạnh, hoặc acid mạnh), phân tử protein vẫn ở trạng thái tích điện nên không bị đông vón mà ở dạng dung dịch
b Tiến hành
- Lấy 5 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch lòng trắng trứng
+ ống 1: đun sôi và theo dõi sự kết tủa dần dần protein
+ ống 2: thêm 1 giọt acetic acid 1% để tạo điểm đẳng điện, đun sôi
+ ống 3: thêm 0,5 ml acetic acid 10%, đun sôi
+ ống 4: thêm 0,5 ml NaOH 10%, đun sôi
+ ống 5: thêm 0,5 ml acetic acid 10%, 3-4 giọt NaCl b o hòa, đun sôi.ã
Nhận xét và giải thích kết quả
c ứng dụng
- Dùng nhiệt độ để hấp, sấy tiệt trùng…các dụng cụ
Bài 2: thực nghiệm về enzyme
1 Thuỷ phân tinh bột bởi amylase
a Nguyên lý
Tinh bột là polysaccharide, gồm nhiều glucose liên kết với nhau bởi liên kết - 1,4 glycoside và -1,6 glycoside, vì vậy tinh bột không có nhóm aldehyde tự do để thể hiện các phản ứng đặc hiệu của nhiều loại đờng đơn và đờng kép, nh phản ứng Tromer Amylase của nớc bọt có khả năng cắt các mạch nối và biến đa đờng thành những chất có phân tử nhỏ hơn (dạng dextrin) cho đến dạng đờng kép maltose Nớc bọt còn chứa một ít mantase thuỷ phân maltose thành glucose Nhờ sự có mặt của nhóm aldehyde tự do nên glucose cho phản ứng tromer dương tớnh
Trang 4b Tiến hành
- Súc miệng bằng nớc cất Ngậm một ít nớc cất khoảng 1-3 phút, khẽ cử động lỡi để trộn
đều nớc bọt với nớc cất, rồi cho qua phễu lọc vào ống nghiệm đư c dd ch a amylase.ợ ứ
- Nhỏ lên phiến sứ hai d y dung dịch lugol 1% : mã ộ dóy TN và 1 ĐC.t
- Lấy hai ống nghiệm
+ ống A: cho 3 ml tinh bột 1%, 2 ml dung dịch amylase (ống TN) + ống B: cho 3 ml tinh bột 1%, 2 ml nớc cất (ống ĐC)
Lắc đều hai ng, ố nhỏ vài gi t t ng TN vọ ừ ố ào 1 l dóy TN, vỗ ở ài gi t t ng ọ ừ ố ĐC vào 1
l dóy ỗ ở ĐC Sau kho ng 2 phỳt l i nh vả ạ ỏ ào l ti p theo ỗ ế Quan sát sự đổi màu và nhận xét
- Phần còn lại của 2 ống thử bằng phản ứng Tromer Nhận xột kết quả
2 ảnh hởng của nhiệt độ
a Nguyên lý
Phần lớn các enzyme có hoạt lực mạnh ở thân nhiệt Nếu nhiệt độ quá thấp thì enzym sẽ hoạt động rất yếu, ngựơc lại nếu nhiệt độ cao thì enzyme sẽ bị tê liệt và bị huỷ hoại
b Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm
+ ống 1: cho 1 ml dung dịch amylase, ngâm vào chậu nớc đá 15 phút
+ ống 2: cho 1 ml dung dịch amylase, đun sôi , để nguội
+ ống 3: cho 1 ml dung dịch amylase
Sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch tinh bột 1% lắc đều, để yên trong 5 -10 phút rồi thử bằng phản ứng Tromer hoặc dd lugol 1% Quan sát màu của các ống và giải thích kết quả
3 Tác dụng đặc hiệu
a Nguyên lý
Amylase và sucrase là hai enzyme thủy phân liên kết glycoside, nh ng amylase chỉ thủy phân liên kết , 1-4 glycoside của tinh bột, còn sucrase chỉ thủy phân liên kết , 1-2 glycoside của sucrose
b Tiến hành
Lấy 4 ống nghiệm
+ ống 1: cho 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch amylase
+ ống 2: cho 1 ml dung dịch sucrose 1%, 1 ml dung dịch amylase
+ ống 3: cho 1 ml dung dịch sucrose 1%, 1 ml dung dịch sucrase
+ ống 4: cho 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch sucrase
Lắc đều rồi thử bằng phản ứng Tromer, quan sát màu của các ống nghiệm và giải thích kết quả
Trang 54 ảnh hởng của pH
a Nguyên lý
Vì có bản chất protein, nên enzyme rất mẫn cảm với pH của môi trờng Mỗi loại enzyme có một pH tối u trong hoạt động của mỡnh, ví dụ pepsin có hoạt lực mạnh ở pH 1,5-2,5 pH môi trờng càng gần pH tối u, tốc độ phản ứng càng cao, nghĩa là enzyme hoạt động càng mạnh Do đó sự thay đổi pH dù nhỏ cũng ảnh hởng đến hoạt độ của enzyme, do ảnh hởng đến trạng thái ion hóa của enzyme
b Cách tiến hành
Lấy thật chính xác vào các ống nghiệm đánh số từ 1- 8 theo chỉ dẫn dới đây:
Số ống
Tinh bột 1% 1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Amylase 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Lắc đều, để 10 phút rồi thử bằng phản ứng Tromer hoặc dung dịch Lugol 1% cho biết kết quả và nhận xét