Nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng

Nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng.

Chủ nhiệm đề tài:

T.S THÁI DUY THÌN

Cơ quan chủ trì:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Cơ quan phối hợp chính:

VIEN KIEM NGHIEM THUỐC BỘ Y TẾ

BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU

KHOA HOC CAP BO

Co quan quan ly dé tai: BO Y TE

Cơ quan chủ trì đề tài: TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NANG CAO (HPLC) VA DO QUANG PHO UV-VIS DE

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT TRONG

MỘT SỐ THUỐC CÓ TỪ 2 ĐẾN š THÀNH PHẦN

Chủ nhiệm đề tài: Thái Duy Thìn

Danh sách những người thực hiện chính:

1.PGS-TS Thái Phan Quỳnh Như

2 NCS-DS Trần Việt Hùng

3.7hS Nguyễn Tường Vy

4.ThS Võ Nhị Hà

Š ThŠ Nguyễn Tuấn Anh,

6 DS CKI Hoàng Văn Đức

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 1-2003 đến tháng 12 -2005

Tổng kinh phí được duyệt: 190.000,000đ

Tổng kinh phí được cấp: 190.000.000đ

MUC LUC

Noi dung Trang

Phan A TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TAI 1

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu

2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6

2.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích 6

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

4.1 Định tính và định lượng paracetamol, bromhexin hydroclorid,

pseudoephedrin hydroclorid, clorpheniramin maleat và cafein bằng

phương pháp HPLC Chủ rì: PGS-TS Thái Phan Quỳnh Như 23 4.2 Định lượng đồng thời paracetamol (PA) và acid mefenamic

(AM) trong viên nén bao phim Pamesic bằng phương pháp HPLC

4.3 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (PA) và cafein

(CA) trong thuốc đa thành phần bằng HPLC Cjủ trì: TS Thái Duy Thìn 31

4.4 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (PA) và ibuprofen

(B) trong thuốc đa thành phan Chu tri: TS Thai Duy Thin 35

4.5 Định lượng đồng thời paracetamol (PA) và quinin sulfat (QS)

trong viên bao Antigrip F bằng phương pháp HPLC

4.6 Định lượng đồng thdi theophylin, ephedrin hydrochlorid va

phcnobarbital trong thuốc hỗn hợp trị hen suyễn bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu nang cao Cha tri: PGS-TS Thai Phan Quynh Nhu

4.7 Định lượng déng thdi paracetamol, clorpheniramin maleat va

phenylpropanolamin hydroclorid bằng phương pháp HPLC

Chủ trì: TS Thái Duy Thìn

4.8 Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen trong viên nén

bằng phương pháp toàn phổ Chởử mì: TS Thái Duy Thìn

4.9 Định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat trong viên nén

Antigrip F bằng phương pháp phân tích da cau tir (MCA)

Chủ trì: NCS-DS Trần Việt Hùng

4.10 Tiểu đề tài 10 Định lượng đồng thời paracetamol và acid

mefenamic trong vién nén Pamesic bang do quang phd MCA

PHAN A TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TAI

1 Kết quã nỗi bật của đề tài

a Đồng gúp mới của đề tài

s% Chúng tôi đã khai thác, ứng dụng hai phương pháp phân tích công cụ mạnh, hiện

đại vào việc kiểm nghiệm các thuốc có nhiều hơn một thành phần hoạt chất, đó là

phương pháp HPLC và phương pháp quang phô tử ngoại phân tích đa cấu tử MCA,

sử dụng thuật toán thống kê trong việc đánh giá các kết quả phân tích

» Xây dựng được phương pháp, mô hình qui trình phân tích định tính và định lượng nói chung đối với các hoạt chất trong một công thức thuốc phối hợp sử dụng hai

phương pháp trên

» Ứng dụng thành công phương pháp, qui trình phân tích đã xây dựng vào việc kiểm nghiệm một số công thức thuốc có từ 2 tới 5 thành phần hoạt chất Đang tiếp tục nghiên cứu, đánh giá trên một số công thức thuốc phối hợp khác, đặc biệt là các

thuốc có nhiều hơn 5 thành phần hoạt chất

* *

b Két qué cu thé

% Đã xây dựng được 10 qui trình phân tích định tính và định lượng các hoạt chất trong 7 công thức thuốc phối hợp phổ biến trên thị trường, nhiều hơn một công thức so với dự kiến trong đề cương nghiên cứu Trong đó có 7 qui trình sử dụng phương pháp HPLC va 3 qui trình sử dụng phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích đa cầu tir MCA

% Đã khảo sát trên 4 công thức thuốc có hai thành phần phối hợp, 2 công thức thuốc

có ba thành phần phối hợp và 1 công thức thuốc có năm thành phần phối hợp s* Các nghiên cứu trên đều đã được các chuyên gia về kiểm nghiệm kiểm tra, thẩm định là có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn, đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành như tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tạp chí được học và tham gia báo cáo trong các hội nghị về dược nói riêng và hoá học nói chung (xem phan phụ lục)

e Về nghiên cứu khoa học

12 công trình khoa học có liên quan đã được công bố

Tham gia 3 hội nghị khoa học quốc tế:

Hội nghị dược Đông dương III 5/2003 ở Thái Lan

Hội nghị hoá học Á Âu ở Hà Nội 10/2003

Hội nghị dược Đông đương IV 11/2005 ở Thành phố Hồ Ch í Minh

nhằm trao đỗi thông tin, kiểm chứng và bàn luận về phương pháp liên quan tới các

nội dung có trong đề tài của chúng tôi

-1-d Đóng góp đào tạo cán bộ cho ngành

& Dé tai đã tập hợp và huy động được một số lượng lớn cán bộ trẻ của trường Đại

học dược Hà nội, Viện kiểm nghiệm thuốc và một số Trung tâm kiểm nghiệm địa

phương tham gia, góp phần nâng cao trình độ và kinh nghiệm chuyên môn cho các cán bộ

% Góp phần đào tạo được 2 thạc sỹ được học và một dược sỹ chuyên khoa cấp 1

s Có 12 sinh viên làm công trình tốt nghiệp phục vụ cho nội dung đề tài Một số sinh

viên sau khi tốt nghiệp đã phát huy tốt chuyên môn ở nơi công tác (viện kiểm

nghiệm thuốc, phòng kiểm nghiệm xí nghiệp, trung tâm kiểm nghiệm các tỉnh,

thành)

Hướng dẫn nhiều sinh viên tham gia thực nghiệm khoa học phục vụ cho đề tài có

kết quả, trong đó có 3 nhóm sinh viên tham gia báo cáo tại hội nghị khoa học tuổi

trẻ của trường, l sinh viên tham gia báo cáo hội nghị dược đông dương

% oe

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là có tính khả thi và có ý nghĩa thực tiễn, được

viện kiểm nghiệm và một số trung tâm kiểm nghiệm ứng dụng để kiểm tra chất lượng các thuốc đa thành phần đang lưu hành trên thị trường Một số chương trình được

nghiên cứu là để áp dụng làm tiêu chuẩn cho các cơ sở Một số chương trình đang được các cơ sở tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm của mình

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê

duyệt

a Tiến độ hoàn thành

Đề tài hoàn thành đúng tiến độ về thời gian đăng ký

b Thực hiện các mục tiêu Hghiên cửu

Đã hoàn thành đầy đủ theo mục tiêu và các nội dung nghiên cứu được hội đồng

khoa học của bộ phê đuyệt, còn thực hiện thêm được I công thức so với đề cương Các chỉ tiêu khoa học đề ra trong đề cương được tôn trọng và thực hiện đầy đủ

c Kế quả tạo ra so với dự kiến của bản đỀ cương

Các kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với dự kiến

d Đánh giá việc sử dụng kinh phí

Đã sử dụng kinh phí đúng mục đích, hiệu quả, chỉ tiền đề tài theo đúng qui định

> Các ý kiến đề xuất

Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu dé hoàn chỉnh và mở rộng hơn trong những đề tài

khác, tiếp tục đánh giá các phương pháp, qui trình và kết quả thu được; ứng dụng

nhiều hơn trong thực tiễn để có cơ sở đề nghị đưa một số chuyên luận thuốc đa

thành phần vào được điển Việt Nam trong lần xuất bản tới

s* Tiếp tục nghiên cứu, ứng dụng hai phương pháp đã xây đựng cho nhiều công thức

thuốc đa thành phần khác, đặc biệt là phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích đa cấu tử MCA Tiếp tục mở rộng kết quả nghiên cứu cho một số thuốc có nhiều thành phần hoạt chất hơn

» Rất mong được sự quan tâm của Bộ Y tế và các cơ quan để đề tài có thể được áp

dụng rộng rãi hơn và mở rộng cho nhiều sản phẩm khác

1 Đặt vấn đề

PHAN B NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN

CUU DE TAI CAP BO

1 DAT VAN DE

1.1 Tính cấp thiết cần nghiên cứu của đề tài

Trong những năm gần đây, ở nước ta, thị trường thuốc đang phát triển nhanh cả về

sản xuất và kinh doanh Các thuốc ngoại được cấp số đăng ký lưu hành ngày càng

nhiều Theo thống kê của cục quản lý Dược Việt Nam, hiện đã có khoảng 6 nghìn mặt hàng thuốc trong nước và khoảng 4 nghìn thuốc ngoại nhập (ước tính có trên 800 hoạt chất) đang lưu hành trên thị trường Việt nam Trong số đó, các thuốc đa thành phần đã

và đang chiếm một tỷ lệ cao

Để phối hợp tác đụng dược lý trong một chế phẩm thuốc và tiện sử dụng cho bệnh

nhân, thuốc đa thành phần thường được phối hợp các hoạt chất trong cùng một nhóm

thuốc như: các kháng sinh, các vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau, thuốc sốt rét,

thuốc chống lao v.v Cũng có thể kết hợp các hoạt chất của 2, 3 nhóm thuốc như

vitamin với thuốc hạ nhiệt, kháng sinh với thuốc chống viêm, thuốc nhỏ mắt hỗn hợp,

thuốc dùng ngoài hỗn hợp v.v

Nói chung, trên thế giới, các thuốc có nhiều thành phần đang được sản xuất và sử dụng ngày càng nhiều Như vậy việc nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm các thuốc

đa thành phần là một việc rất cần thiết đối với các nhà sản xuất, các nhà nghiên cứu về

kiếm nghiệm và các cơ quan quản lý chất lượng thuốc

Trong được điển Việt Nam mới nhất (D.Đ.V.N II), hầu như chưa có các chuyên luận về thuốc nhiều thành phần Vì vậy, việc nghiên cứu để đưa một số tiêu chuẩn cho

các thuốc loại này vào dược điển trong các lần xuất bản tới là rất cần thiết

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và cấp thiết đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài:

“Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lông hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV-Vis để định tính và định lượng các hoạt chất trong một số thuốc có

từ 2 đến 5 thành phần”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

% Xây dựng qui trình phân tích một số thuốc đa thành phần đã chọn (chưa có tiêu

chuẩn hoặc có tiêu chuẩn nhưng chưa đầy đủ hoặc có nhược điểm), dựa trên

phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích đa cấu tir MCA

% Áp dụng các qui trình trên để kiểm nghiệm các thuốc đa thành phần có công thức

tương tự, góp phần nâng cao chất lượng thuốc lưu hành trên thị trường.

1 Dat van dé

+» Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

Trong phạm vi 1 đề tài cấp bộ chúng tôi chọn một số công thức thuốc có từ 2 đến 5

thành phần để nghiên cứu (đã được bộ phê duyệt), đó là các thuốc hỗn hợp sau:

+ Paracetamol, clorphenirramin maleat va phenylpropanolamin hydroclorid

+ Theophyllin; ephedrine hydroclorid va Phenobarbital

Thuốc có 5 thành phần

+Paracetamol; cafein; pseudoephedrin hydroclorid; bromhexin hydroclorid và

clorphenirramin maleat

2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trong những năm qua, ở Việt Nam ta đã có nhiều công trình nghiên cứu ở cấp cơ

sở và cấp bộ về kiểm nghiệm các thuốc đa thành phần như:

- Nghiên cứu định lượng đồng thời các vitamin tan trong nước và vitamin tan trong dầu trong thuốc hỗn hợp multivitamin bằng phương pháp HPL,C [10]

- Nghiên cứu ứng dụng quang phổ UY-VIS, quang phổ đạo hàm để định lượng

các thuốc đa thành phần [7; 8]

- Nghiên cứu định lượng đồng thời các hoạt chất trong một số thuốc hạ nhiệt

giảm đau bằng phương pháp HPLC [6;]

Tuy nhiên, so với tốc độ phát triển của thị trường thuốc hiện nay thì chưa đủ đáp ứng, còn rất nhiều nội dung cần phải được nghiên cứu để ứng dụng trong thực tiễn Trên thế giới, các chế phẩm thuốc đa thành phần được nghiên cứu rất nhiều, nhưng

phần lớn chỉ dừng ở mức tiêu chuẩn cơ sở

Trong các được điển lớn và thông dụng như BP, USP, EP, JP, Pháp, Quốc tế [19;

23; 24; 25; 27; 28] chủ yếu ghỉ các dạng thuốc đơn thành phần

Dược điển Anh (BP1998 và BP2000) có ghi một số thuốc đa thành phần như các

chuyên luận thuốc multivitamin, thuốc tiém lidocain va adrenalin

Riêng được điển Mỹ (USP 23, USP 24, USP 27 ) có số thuốc đa thành phần nhiều

hơn và tập trung vào một số nhóm thuốc phổ biến như: các vitamin, nhóm thuốc hạ nhiệt giảm đau

Các nước trong khu vực Đông Nam Á đã có những hội nghị về các phương pháp kiếm nghiệm ngoài được điển Tổ chức Y tế thế giới cũng đã có những chương trình

để tổ chức học tập và trao đỗi giữa các nước về vấn đề này

2.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLQ

a Khái niệm Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao

Là một phương pháp tách hoá lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác

nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một

pha tĩnh

Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định

Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia đưới dang tiểu phân

hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi

bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ

Quá trình sắc ký xây ra có thể theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion

b Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

** Thời gian lieu và thể tích lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất

đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho pic trên sắc ký đồ

Nếu gọi tạ là thời gian lưu giữ của một chất

thi: tp =tp- to

Trong đó: — £g là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

tạ là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định

và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất, cấu tạo và

tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đỗi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng

thời gian tương ứng với thời gian lưu

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh

Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bồ với hệ số phân bố được tính theo

công thức sau:

Œ:

Cu

Trong 46: Cs, Cy là nồng độ của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở

thời điểm cân bằng.

% Thừa số dung lượng

Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k° khác nhau, hệ số chọn lọc cho

biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký

Ky _ Ky _tap—to _ tre

Q=—=

K, Fa teanty tra

Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy ¿ luôn lớn hơn l, z

càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ Thường phân tích trong điều kién a

trong khoảng 1,5 đến 2

+» Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân

bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả

định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lý thuyết được định nghĩa như là một

khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học

giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tinh va trong pha động

Số đĩa lý thuyết N được tinh theo các công thức:

N= 16x( ‘2 hoặc ssix| ta

Trongđó W_ : Chiều rộng pic ở đáy pic

W,,, _ : Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

Hut

N

Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký

Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết

(N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích.

s Độ phân giải (Rs)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều

kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính theo Í trong 3 công

Trong đó W„: là độ rộng day pic do 6 1/20 chiều cao của pic

A : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân

đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic

** Phương trình Van-Dcemicr

Phương trình Van-Deemiter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và các

thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc ký

H=A+P+Cxu

t

H : Chiều cao đĩa lý thuyết

u : Tốc độ đòng pha động

A, B, C : Cac hé số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký

Trong đó: — A: Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy (eddy điffusion)

B/u: Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán đọc của các phân tử chất tan theo phương dòng chảy của pha động (longitadinal diffussion)

C: Mô tả ảnh hưởng của sự chuyển khối (mass transfer)

c Hệ thống HPLC: Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau:

- Binh chtra dung môi (pha động)

- Bom cao áp: đây pha động qua cột sắc ký

- _ Bộ phận tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

- _ Cột tách (pha tĩnh)

- Detector

- May ghi tín hiệu hoặc máy vi tính,

Hình 2 hệ thống HPLC hoàn chỉnh Hình 3 Các thành phần cơ bản của một

máy sắc ký lỏng hiện đại

1 Khay chứa bình dung môi (Solvent cabinet)

2 Bộ đuổi khí chân không (Vacuum degasser)

3 Bơm cao áp (Pump)

4 Bộ tiêm mau ty dong (Autosampler)

5 Bộ điều nhiệt cho cột (Columm compartment)

- _ Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia nó

thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử Tương ứng

với loại chất nhỏi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật

HPLC

- Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai

loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký long-léng (LLC)

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha

thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc ký pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion

- _ Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành hai

loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)

-10-%% Điều kiện đối với một pha tinh

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký

- _ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc

ký nhất định

- Tinh chat bề mặt phải ỗn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- _ Cân bằng động học của sự tách phải xây ra nhanh và lặp lại tốt

- _ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất

s* Quả trình rửa giải

Rửa giải đẳng đòng: pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải

Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỷ lệ của các thành phần tạo nên

pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải Lúc này, độ phân cực của pha

động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách

* Các vấu tô chính cần chủ ý trong lựa chon pha động

- _ Bán chất của dung môi lựa chọn làm pha động

Thanh phan cdc chất tạo ra pha động

Tốc độ dòng pha động

pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)

* Điều kiện doi voi mot pha động

- _ Phải trơ đối với pha tĩnh

- _ Hoà tan được chất cần phân tích

- _ Bền vững theo thời gian

- _ Có độ tỉnh khiết cao

- _ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

- _ Phù hợp với loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích

- _ Có tính kinh tế và không quá hiếm

$ Pha động là một trong những yêu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn

hợp mẫu Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký

-11 Hiéu luc cia cét tach

- D6 phan giải các chất trong một pha tinh

- - Độ rộng và sự cân đối của pc sắc ký

Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều phải được đuôi khí

bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm Vì không khí hòa tan trong

đung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu

Cách đánh giá pic

% Đánh giá diện tích pic: Diện tích pic của một chất tương ứng với tổng lượng chất

đó Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường đùng máy tích phân điện tử gắn

với máy vi tính (sai số khoảng 0,5%) hoặc máy tích phân cơ học (sai số khoảng 1,3%) Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và ca pic

có đường nền bị trôi Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ trung bình, vừa và cao

%% Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có

thé ding dé đánh giá sắc ký đồ Phương pháp này chỉ áp đụng khi các chỉ số k° là

hằng định Với pic có đường nên bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao pic sé dé đàng và chính xác hơn việc xác định điện tich pic

g Cách tỉnh kết quả

* Phương pháp ngoại chuẩn: Là phương pháp đựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và

mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với

mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn

* Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần

với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử Nó được tách hoàn toàn và

có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tương tự

Phương pháp thêm chuẩn: Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có

vấn đề ảnh hưởng của các chất phy (vi dụ : tá được) Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả

được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ

tăng của diện tích hoặc chiều cao pic

s* Phương phún tinh theo phần trăm diện tích pic: Nồng độ của mẫu thử được tính

toán dựa trên điện tích pic tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích pic chất thử trên tổng

diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của đetector trên các chất là như nhau, nếu không như nhau khi

đó với mỗi chất cần có hệ số hiệu chỉnh

% a

2.2.2 Phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích ấn cầu tit (MCA)

a Co sé ly thuyét

% Nguyên tắc chưng

Cơ sở lý thuyết của phương pháp dựa trên nguyên lý “Độ hấp thụ quang A của một hỗn hợp trong dung dịch tại một bước sóng ở bất kỳ bằng tổng độ hấp thụ quang của mỗi thành phân tại bước sóng đó”

Trong dung dịch, độ hấp thụ quang và nồng độ dung dịch có mối liên hệ với nhau

theo dinh ludt Lambert - Beer:

A: độ hấp thụ quang tai budc song 1

E: độ hấp thụ riêng tại bước sóng ^

C: nông độ dung dịch

d: bề dầy cốc đo

ta có thể viết gọn lại như sau: A = K.C (với K = E.đ được gọi là hệ số tỷ lệ)

Nếu ta giả sử hỗn hợp cần đo có n thành phan thi theo nguyên lý trên ta có:

Tại bước sóng thứ nhất: Ai = KìaCi +Kq¿Cs + +KqzO, (2)

Khi độ hấp thụ quang được đo tại m bước sóng, ta sẽ thu được hệ gồm z: phương trình, với n ân số về nồng độ ( Cạ ) và n ø ẩn số về hệ số tỷ lệ ( Kma )

Ai= KiiCi + Ki¿C¿ + + KinCn

Az = Ka iC) + KoaCy + + KanCy

Trong đó: [A] là ma trận độ hấp thụ quang, được đo trên máy

[K] là ma trận hệ số tỷ lệ, được xác định trước bằng cách đo phổ

của các dung dịch chuẩn hỗn hợp đã biết trước nồng độ

[C] là ma trận nồng độ của các thành phần trong hỗn hợp

Để có thể giải được phương trình (4) ta cần phải chuyển ma trận chữ nhật [K]„„

thành ma trận vuông bằng cách nhân với ma trận chuyển vị của K

Gia str m > n, khi đó ta có thể viết phương trình (4) dưới dạng sau:

Ans =[K] in Coy (5)

Nhân cả hai về của phương trình (5) với ma trận chuyển vị của K là [KTma ta được

-13-[K Jinn Ay = [KÌ]azIF]z„-C,i

— [Z]n1 =(Thna- ©,

Trong thực tế của bài toán, C là nồng độ chưa biết cần tìm của mẫu thử, vậy ta có

thể viết phương trình trên đưới dạng như sau

Ể,=[Tisa.[Zki (6)

Như vậy, để xác định nồng độ chưa biết của mẫu thử, điều quan trọng là ta cần phải

giải được phương trình (6) dựa trên việc xác định ma trận hệ số hấp thu [K]„„ thông qua đo độ hấp thu 4,,,

% Giải hệ Cremer bằng phương pháp Gguss

Một hệ phương trình đại số tuyến tính chỉ tìm được nghiệm, khi số phương trình của hệ lớn hơn hoặc bằng số ấn (nghĩa là ta phải có m > n) Trong trường hợp tối thiểu với m = n, khi đó ta sẽ có hệ n phương trình n ẫn và ma trận [K] là một ma trận vuông

(kích cỡ n x n), đây chính là hệ Cremer quen thuộc trong đại số tuyến tính Đề giải loại

hệ này ta dùng phương pháp Gauss

Xét hệ phương trình Cremer sau:

y.1X1 + ApaX2 + + ân nXa = Dạ

Phương pháp Gauss là phương pháp giải bằng cách dùng các biến đổi sơ cấp để đưa hệ đã cho về hệ tam giác có đạng:

có ma trận hệ số ai1XỊ + a12X¿ + + ai nXa = Đị

Bi Gr An

A22Xạ + + aanXa = bạ

Với giả thiết amm # 0, khi đó việc giải hệ tam giác trên rất đơn giản.Từ phương

trình cuối ta sẽ tìm được xạ, thế lên các phương trình tiếp trên tìm được Xạ., Xạ.2 và

xị ở phương trình đầu tiên

$% Phân tích chuẩn, đánh giá chất lượng của phân tích chuẩn bằng cách áp dụng thuật bình phương tôi thiểu và các thông kê tương quan

Thuật bình phương tối thiểu (least square method) sẽ làm cho độ đúng trong việc

phân tích chuẩn cao hơn vì nó làm giảm thiểu sự sai khác giữa nồng độ thực (entered

Giả thiết số lượng các hỗn hợp chuẩn được sử dụng là p Theo dạng ma trận của hệ

(4) ở trên

Chúng ta đã biết muốn xác định được ma trận hệ số [K] của hỗn hợp gồm n chat thi

ta phải sử dụng tối thiểu n dung dịch hỗn hợp chuẩn và đo tại tối thiểu là n bước sóng

(m = n= p) để có nˆ phương trình xác định một nghiệm duy nhất của hệ gồm n phần

tử của K

Ví dụ: muốn xác định các hệ số K của hỗn hợp gồm 2 chất, ta phải sử dụng tối

thiểu 2 dung địch hỗn hợp chuẩn và đo mật độ quang tại tối thiểu 2 bước sóng khi đó

ta sẽ có 2 x 2 = 4 phương trình xác định các giá trị của hệ số tỷ lệ Kmn› Cụ thể như sau:

Tại bước sóng |

dung dịch hỗn hợp chuẩn 1: A; = K¡¡C¡ + Kị¿C¿

dung dịch hỗn hợp chuẩn 2: A;=K¡¡Œ + Ky2C4

Tại bước sóng 2

dung dịch hỗn hợp chuẩn 1: A¿ =Kạ¡C¡ + Kạ¿C¿

dung dịch hỗn hợp chuẩn 2: A¿= K;¡C¿ + KạzC¿

Trên thực tế, ta có thể giảm sai số trong phân tích chuẩn bằng cách áp dụng nguyên ;

lý bình phương tối thiểu “sử đựng số lượng các dung dịch hỗn hợp chuẩn nhiều hơn số

cẩu tử (p>Ø” khi đó hệ trên sẽ trở thành “hệ trên xác định- overdctermined system”

và nguyên tắc, để giải loại hệ này ta đưa về việc giải hệ Cremer, khi đó mỗi lần chúng

ta chỉ cần dùng giá trị phân tích của n dung dịch chuẩn trong số p đung dịch sử dụng (p

> n), vậy chúng ta gặp bài toán tổ hợp chập n của p phần tử Theo công thức tính tổ

hợp ta có:

Kệt quả là ta sẽ có C; trường hợp, nghĩa là ta sẽ có tương ứng C hệ Cremer và

thu được C,, nghiệm, mỗi nghiệm gồm n giá trị tương ứng với nˆ phần tử của hệ số

tỷ lệ K

Ví dụ: vẫn với trường hợp hỗn hợp có 2 chất ở trên, để phân tích chuẩn chúng ta sẽ

dùng 5 chuẩn hỗn hợp Nếu giả thiết chỉ đo tại hai bước sóng thì sẽ có C; =10

trường hợp và sẽ có 10 giá trị ma trận chuẩn hóa K, có nghĩa là ta đã phải giải 10 hệ

phương trình, mỗi hệ có 4 phương trình để xác định 4 ẩn số là các hệ số tỷ lệ K của 2

chất tại hai bước song

Từ các giá trị K này, tính được ma trận trung binh [K], va sẽ xác định được nồng

độ của mỗi thành phần trong dung dịch chuẩn hỗn hợp theo công thức:

-15-So sánh các giá trị C này với giá trị nồng độ mà ta pha ban đầu cho mỗi thành phần trong hỗn hợp ta sẽ tính được sự sai khác giữa nồng độ tính được ở trên và nồng độ

thực của các dung dịch chuẩn hỗn hợp Sau đó, ta có thể đùng các thống kê tương quan

để đánh giá sai số cũng như chất lượng đường chuẩn

4% Phận tích mẫu thử và áp dụng thuật toán bình phương tỗi thiểu trong phân tích

Như vậy, để tính nồng độ chưa biết của mẫu thử, mỗi lần ta chỉ cần sử dụng giá trị

độ hấp thụ quang đo tại n bước sóng trong số m bước sóng phân tích, ta lại gặp bài

toán tổ hợp chập n của m phần tử Vẫn ở ví dụ trên, trong trường hợp dùng 6 bước sóng phân tích cho hỗn hợp gồm có hai chất, chúng ta sẽ giải được C3 = 15 giá trị

cho nồng độ của mỗi thành phần và kết quả sẽ là giá trị trung bình của 15 giá trị mà ta

tính được

b Phan mềm cho phân tích đa cầu tử MCA

Thực tế, cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích đa cấu tử (MCA) cũng như các

thuật toán để giải quyết nó đã có từ lâu, và đã có thể thực hiện được ngay từ khi có

máy quang phỗ UV-Vis Tuy nhiên, do hạn chế về độ chính xác của các thiết bị phân tích, cũng như hạn chế về thiết bị xử lý số liệu dẫn đến kết quả phân tích không chính

xác hoặc có thể đo được chính xác nhưng lại phải khá công phu trong việc tính toán kết quả

Năm 1989-1990: Hãng Beckman giới thiệu phần mềm phân tích quang phổ MCA trên các máy quang phố Beckman DU thông thường Để phân tích MCA trên thế hệ

máy này, trước hết chúng ta phải lựa chọn một số bước sóng phân tích thích hợp đối với mỗi thành phần, sau đó tiến hành phân tích các mẫu chuẩn và mẫu thử, cuối cùng

là xử lý kết quả dựa vào phần mềm trên máy tính điện tử

Các thế hệ máy quang phố hiện đại sau này như: DU 650i, DU 7000 của hãng

Beckman hay HP8452, HP8453 của hãng HP có sự cải tiến rõ rệt cả về phần cứng và

phần mềm Về phần cứng, các máy được trang bị bộ vi xử lý tốc độ cao, cấu hình

quang học cải tién, detector chuỗi diot được nối với bộ truyền và biến đổi dữ liệu tốc

đồng thời thu được toàn bộ dữ liệu phổ trong khoảng bước sóng đã chọn dùng cho phân tích Sự cải tiến về giao diện phần mềm, dùng thuật toán chuyển hóa chuỗi Fourier trong xử Ïý dữ liệu phố, cũng như là áp dụng các thống kê toán học đã làm cho

việc tính toán kết quả trở nên đơn giản hơn với sai số tối thiểu

Hiện nay ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm chưa được trang bị các thế hệ máy quang phổ

hiện đại như trên, vì vậy chúng tôi đã thiết lập một phần mềm xử lý kết quả cho phép

áp dụng kỹ thuật MCA để phân tích được một số chế phẩm có từ 2 đến 3 thành phần

hấp thụ quang trên máy quang phổ thông thường Chương trình xử lý này mà thuật giải của nó dựa trên việc giải quyết hai bài toán chủ yếu, đó là: phương pháp Gauss để khử

hệ phương trình Cramer; tổ hợp để xử lý các kết quả thu được từ nhiều hệ Cramer (hệ trên xác định-overdetermined) cùng với việc loại bỏ các kết quả quá sai lệch theo nguyên lý của thuật bình phương tối thiểu (least square method)

Hình 4 Cửa số chương trình phân tích — Hình 5 Thiết lập các thông số chung

đa cấu tử MCA

-17-3 DOI TUONG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

3.1 Thiết kế nghiên cứu

Đề tài được thiết kế theo mô hình nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu:

s* Thử nghiệm tìm kiếm kỹ thuật hoặc giải pháp để loại trừ ảnh hưởng của các thành phần khác (kế cả tá dược), khai thác các ứng đụng của phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phô UV-Vis hiện đại vào

việc phân tích các thuốc đã chọn

4 Nghiên cứu xây dựng các phương pháp định tính và định lượng đồng thời nhiều

hoạt chất trên các thiết bị HPLC và quang phổ UIV-Vis hiện có

* Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu, khảo sát tính tuyến tính, chứng mỉnh bằng thực nghiệm tính đúng, tính chính xác,

‹

% Dánh giá ích lợi và tính khả thi của phương pháp

* Ứng dụng các phương pháp đã xây dựng vào việc kiểm nghiệm một số thuốc

đang lưu hành trên thị trường

Dự kiến xây đựng phương pháp định tính và định lượng một số thuốc có chứa từ 2

đến 5 thành phan, cu thé nhu sau:

- _ Thuốc có 2 thành phần:

+ Paracetamol va cafein

+ Paracetamol va ibuprofen

+ Paracetamol va quinin sulfat

+ Paracetamol va acid mefenamic

Mỗi chương trình cho một công thức thuốc sẽ là một tiểu đề tài

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

Chọn mẫu và cỡ mẫu

- _ Chọn các mẫu thuốc điển hình, có từ hai thành phân trở nên cho các tiểu đề tài

-_ Mỗi tiểu đề tài chọn tối thiểu là 2 mẫu thuốc để nghiên cứu với số lượng đủ để

làm các khảo sát thực nghiệm

Đối tượng nghiên cứu Các mẫu thuốc áp dụng tuỳ theo thị trường cung cấp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp sắc ký lông hiệu năng cao (HPLC)

a Chỉ tiêu nghiên cứu

Các chỉ tiêu nghiên cứu được mô tả ở sơ đồ sau

b Phuong pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

% Lựa chon điều kiên sắc kỷ

- Thiét bi HPLC

Với máy HPLC ta quan tâm nhất tới detector, có thể gặp một số loai detector sau: detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), detector hấp thụ tử ngoại (UV), detector huynh quang (FLD: fluorescence detector), detector chiét sudt vi sai,

detector ion héa ngon lira, detector hong ngoai (IR)

Phổ biến nhất 14 detector UV-Vis (190nm - 900nm) nhu: detector mang diode

(DAD: diode array detector), detector do ở nhiều bước sóng (MWD: mulú

wavelength detector), detector do & budéc song thay déi (VWD: variable

- _ Loại cột dùng phân tích (pha tĩnh): cột của hãng nào, kích thước cột ra sao, các

thông số về loại pha tĩnh, cỡ hạt, độ xốp hạt

-19-2, lạt 4

`

“

9 eo

Lưu ý: Pha động là một yếu tô rất linh động, ta có thể dễ dàng thay đổi để

thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tý lệ các thành phần, thay đổi

Khảo sát độ tuyến tính của các thành phân cần phân tích

Ta biết rằng, nồng độ của mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính với diện tích hay chiều cao pic sắc ký (trong một khoảng nồng độ nhất định nào đó) Nghĩa là trong khoảng nồng độ đó thì diện tích (S) hay chiều cao (h) pic phụ thuộc vào nồng độ (C) theo một hàm bậc nhất

Tiến hành pha một dung dịch gốc, sau đó pha loãng dung dịch gốc này để

thu được một dãy dung dịch chuẩn biết trước nồng độ Đem các dung dịch

chuẩn này chạy sắc ký để thu được giá trị diện tích hay chiều cao pic, lập phương trình hồi qui, đánh giá độ tuyến tính thông qua hệ số tương quan r

Chuẩn bỉ các dụng dịch phân tích

Trong phương pháp HPLC, thông thường ta tính kết quả bằng cách so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Do đó, ta cần chuẩn bị các dung

dịch chuẩn và các dung địch thử cho quá trình sắc ký

Khảo sát tính thích hợp của hệ thông

Yêu cầu ở bước này là phải kiểm tra xem các điều kiện sắc ký ta đã lựa chọn

có thích hợp không? Ta thử chạy một mẫu phân tích với điều kiện sắc ký đã chọn, nếu các pic tách khỏi nhau hoàn toàn, pic nhỏ, gọn là được

Khảo sát độ chính xác của phương pháp

Độ chính xác thường được xác định thông qua độ lặp lại của phương pháp

(cách thông thường nhất là xác định độ lệch chuẩn tương đối của kết quả phân tích RSD - theo các được điển hoặc sai số tương đối)

Tiến hành khảo sát độ lặp lại bằng cách định lượng riêng biệt trên nhiều

mẫu giống nhau của chất cần phân tích rồi xử lý kết quả bằng phương pháp

thống kê

s* Khảo sút độ đúng của phương pháp

Độ đúng được xác định thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn

Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn đã biết trước hàm lượng

sao cho dung địch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát, xác định phần trăm tìm lại

3.3.2 Phương pháp quang phố phân tích đu cẫu tử (MC⁄)

a Chỉ tiêu nghiên cứu

Các chỉ tiêu nghiên cứu được mô tả ở sơ đồ sau

b Phuong pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

+% Khảo sát phố hấp thụ UV và lựa chon các bước sóng, hoặc giải sóng phân

+» Đánh giá độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Phan này tương tự như đối với phương pháp HPLC

fie sát phố hấp thụ UV và lựa chon cắc bước sóng,

hoặc giải sóng phân tích

Đánh giá độ đúng và độ chính xác của phương pháp

C

Các đặc trưng thông kê để xử lý kết quả phân tích:

+ Gia tri Trung binh: nội

4 KET QUA NGHIEN CUU

4.1 Dinh tinh và định lượng paracetamol, bromhexin hydroclorid, pseudoephedrin hydroclorid, clorpheniramin maleat và cafein bằng phương

phap HPLC

Viên nang hạ nhiệt, giảm đau, chữa ho “Cotussin” do công ty dược phẩm Tiền

Giang nghiên cứu sản xuất có công thức như sau:

Vì vậy để giúp các cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm của mình, chúng tôi

đã nghiên cứu phương pháp định lượng 5 hoạt chất trên trong viên hỗn hợp bằng

phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký lỏng pha thuận, đetector UV và chương trình sắc ky ding dong

- May lic siêu âm

- _ Cân phân tích với độ chính xác 0,1 mg

b Hoá chất dung môi

- _ Methanol tỉnh khiết sắc ký

- Dung dich dém Amoni nitrat pH 9,5 (884 ml nước cho thêm 94 ml Amoniac

đậm đặc (25 - 28%) và 21,5 ml acid nitric (69 - 71%), khuấy đều, để nguội

Điều chỉnh pH đến 9,5 bằng acid nitric hoặc Amoniac Lọc qua màng lọc 0,45

-23-Cột Lichrosorb Si 60 (250 x 4mm; 5 um)

Detector UV — VIS: 257 nm do PE va CM; PA; 298 nm do CA va BH

Pha động: Methanol - Dung dịch đệm Amoninitrat pH 9,5 (45 : 6)

cho vào bình định mức 20ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều, sau đó lọc qua

màng lọc 0,45m

Dung địch thử để định lượng CA, PE, BH và CM: Trộn đều và nghiền mịn

lượng bột viên lấy từ 20 nang Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với

2 viên, thêm 30 ml pha động, lắc khoảng 10 phút Dùng 30 mI nước để chuyển

hỗn hợp này vào bình gạn Thêm 10ml NaOH IN, lắc kỹ rồi chiết bằng

Cloroform 3 lần x 30ml Gộp dịch chiết, bốc hơi trên cách thuỷ đến hết Cloroform Hoà tan cắn trong 20ml dung dịch HCI 0,1N rồi thêm methanol vừa

đủ 200ml, lắc đều Lọc qua giấy lọc thường, sau đó loc qua mang loc 0,45 pm Dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn để định lượng PA: Pha chất chuẩn PA trong dung môi pha động để thu được dung dịch PA có nồng độ chính xác khoảng 30ug/ml

Dung dịch chuẩn để định lượng CA, PE, CM và BH:

+ Cân chính xác khoảng 40mg CM, hoa tan trong pha động vừa đủ 25ml (dung dich CM)

+ Cân chính xác khoảng 40mg BH, hoà tan trong pha động vừa đủ 25ml (dung dịch BH)

+ Cân chính xác khoảng 560mg PA, 60mg CA, 20mg PE, cho vào một cốc có

mỏ, thêm chính xác 5ml dung dịch CM, 10ml dung dịch BH, 15ml pha

động, khuấy cho tan hết rồi xử lý tiếp như mẫu thứ, từ đoạn “ dùng 30ml nước đề chuyền hết hỗn hợp này vào bình gạn ”

Tinh két quả: Dựa vào diện tích hoặc chiều cao của pic chuẩn và thử tương ứng

B Kết quả và biện luận

Với chương trình sắc ký đã nêu, sắc ký đồ đã tách các chất CA và BH; PE và CM như hình 1.1 va hinh 1.2

B.1 Khảo sát khoảng tuyến tính

Chúng tôi đã khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ các hoạt chất và diện

tích pic trên 5 dung dịch chuẩn của PA, hỗn hợp CA và BH; PE và CM với các nồng

độ khác nhau Kết quả được giới thiệu ở bảng 1.1

Các kết quá trên cho thấy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị diện tích pic và nồng độ (r = 0,9985 - 0,9999) Nồng độ dung dịch chuẩn và dung dịch thử của chúng tôi nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính

A soa Lk Hé sé tuong Khoảng tuyên tính đã khảo sát

Thành phân | Phương trình hỗi quy quan (ue/ml)

B.2 Khả năng chiết hết hoạt chất

Trong phương pháp xử lý mẫu, giai đoạn chiết các hoạt chất cần đo và loại bỏ Paracctamol đã được khảo sát khả năng chiết hết bằng cách: sau khi chiết 3x40m]

Cloroform thì chiết thêm 1 lần 40ml Cloroform nữa Lớp Cloroform chiết lần 4 này

-25-được bốc hơi trên cách thuỷ đến khô, hoà tan cắn trong 5ml dung dich HCI 0,1N thém

Methanol vừa đủ 20ml, rồi đo HPLC theo chương trình trên Kết quả thử trên 3 bình

đều không xuất hiện pic trên sắc ký đồ Như vậy, hoạt chất đã được chiết hết ở 3 lần

đầu Khá năng chiết được đảm bảo

B.3 Độ lặp lại, sai số và độ đúng

Các thử nghiệm này được thực hiện trên mẫu viên Cotussin của công ty Dược

phẩm Tiền Giang, SKS: 071199 Kết quả được giới thiệu trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ đúng trên mẫu COTUSSIN

Số liệu thông kê FA | CÁ | CM | PE | BH

Giá trị trung bình X ( mg / viên ) 2784 | 29,05 | 4,38 | 9,21 | 7,26

Tỷ lệ tìm lại được ( % ) ( n = 3, lượng chuân

thêm vào 20% mỗi chất) 390 | 221 | 285 | 290 | 98,4

Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đối tuỳ theo từng trường hợp từ

0,23 - 2,07% và tý lệ tìm lại được hoạt chất từ 98,4 - 99,1%

4.2 Định lượng đồng thời Paracetamol (PA) và Acid mefenamic (AM) trong viên

nến bao phim Pamesic bằng phương pháp HPLC

Viên bao Pamesic do công ty vật tư y tế Tiền Giang nghiên cứu sản xuất có thành

phần như sau:

Paracetamol (PA) 500mg

Acid mefenamic (AM) 250mg

Trong các dược điển hiện hành [19; 23; 27; 29 ] chưa có chuyên luận về hai thành phần này Hai chất trên có độ tan như nhau (đều đễ tan trong kiềm) nên rất khó chiết tách Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu phương pháp định tính và định lượng đồng thời cả 2 thành phan trên trong hỗn hợp thuốc với mục đích cùng cơ sở xây dựng tiêu

chuẩn cho sản phẩm mới

A Thực nghiệm

A.I Thiết bị, hoá chất

- May sac ký lỏng hiệu nang cao HP 1100 voi detector UV-Vis

- C6t Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10pm)

- B6 loc dung mdi va loc mau với đường kính lỗ màng lọc 0,45 um

- _ Chất chuẩn paracetamol và acid mefenamic do Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế

cung cấp

- Acetonitril, tetrahydrofuran loai ding cho HPLC

- Acid phosphoric tinh khiét phan tich

A.2 Phương pháp nghiên cứu

a Diéu kiện sắc kỷ

- _ Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10um)

- Detector UV dat 6 budc song 279 nm

- Pha động: Acetonitril — nude — tetrahydrofuran (3 : 8 :9) điều chỉnh đến pH 2,2 bang acid phosphoric

- Téc d6 dong 1 ml/phút

-_ Thể tích tiém 20yI

b Chuẩn bị dung dich

- _ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,1 g chất chuẩn PA và khoảng 0,05

g chất chuẩn AM, hoà tan bang 5 ml THF, sau dé pha loãng bằng dung môi pha động để được dung dịch chuẩn có nồng độ của PA khoảng 80 g/ml va cia AM khoang 40 pg/ml

- Dung dich thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột

mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng

-27-của khoảng 50 mg AM, hoà tan bằng 5 ml THF, pha loãng bằng dung môi pha

động để được dung dịch thử có nồng độ của PA khoảng 80 hg/ml và của AM

khoảng 40 ñg/ml lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m

B Kết quả

B.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thông sắc ký

Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, sắc ký đồ thu được ở hình 2.1 cho thấy

PA và AM được phân tách hoàn toàn

Hình 2.1 Sắc ký đồ thu được của dung dịch hỗn hợp PA và AM

B.2 Khảo sát khoảng tuyến tính

Chúng tôi tiến hành khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ các chất cần định lượng với diện tích pic tương ứng trên các chất chuẩn PA và AM Chuẩn bị một dãy dung

dịch hỗn hợp chuẩn trong pha động có nồng độ của PA biến thiên trong khoảng 20 —

200 ng/ml và của AM biến thiên trong khoảng 10 — 100 pg/ml, kết quả khảo sát độ

tuyến tính được trình bày ở bảng sau:

Bang 2.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tinh

-Paracetamol Acid mephenamic

Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến Hình 2.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến

tính nồng độ và diện tích pic tương ứng của PA tính nồng độ và diện tích pic tương ứng của AM

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa

diện tích pic và nồng độ với hệ số tương quan rất gần 1 (r = 0,9996 — 0.9999) Chúng

tôi chọn nồng độ dung địch thử và chuẩn đẻ định lượng nằm trong khoảng tuyến tính

đã khảo sát (PA khoang 80 g/ml va AM khoang 40 pg/ml)

B.3 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp được tiến hành trên hai mẫu thử viên nén bao phim Pamesic Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.2a Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu viên nén bao phim Pamesic

Mẫu 1 SKS : 011102

Bang 2.2b Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu viên nén bao phim Pamesic

Mau 2 SKS : 021202

Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm, thêm vào mẫu thử đã biết trước hàm

lượng một lượng chính xác chất chuẩn tương ứng với khoảng 20% lượng có trong mẫu thử Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày ở bảng sau :

Bảng 2.3 Kết quả khảo sát độ đúng

4.3 Định lượng đồng thời paracetamol (PA) và cafein (CA) trong thuốc đa thành

phần bằng phương pháp HPLC

Thuốc đa thành phần bao gồm paracetamol và cafein là một dạng phối hợp thông dụng, ví dụ viên Pasepan của CTDF Hà Tây hay viên Sedapa của XNDF TW 2 | 7

Để định tính và định lượng các hoạt chất trong hỗn hợp thuốc trên thường áp

dụng theo tiêu chấn cơ sở (chiết tách rồi đo quang) [2,16] Phương pháp này có nhược

điểm là phải qua bước chiết tách khá phức tạp, dễ mắc sai số, tốn nhiều thời gian, dung

A.1 Hoá chất, thiết bị

- May sac ky long hiéu nang cao HP 1100 voi detector UV

- C6t Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10um)

- Bé6 loc dung mdi va lọc mẫu với đường kính lỗ màng lọc 0,45 im

- _ Chất chuẩn paracetamol và cafein do Viện Kiểm nghiệm cung cấp

- Methanol loai ding cho HPLC

- Ethanol tuyét déi (PA), acid phosphoric (PA)

- Dung môi A : Ethanol - nude (1:1)

A.2 Phương pháp nghiên cứu

a Điễu kiện sắc ký

b Chuẩn bị dung dich

- Dung dich chudn: Chuan bị một dung dịch hỗn hợp chuẩn trong dung môi A

có nồng dé của PA khoảng 600 pg/ml va ctia CA khoang 20 pg/ml

- Dung dich thir: Can 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột

mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng của khoảng 60 mg PA, hoà tan và thêm dung môi A đến vừa đủ 100 ml, lọc qua giấy lọc thường(bỏ khoảng 20 ml địch lọc đầu) Sau đó lọc qua màng lọc

0,45um

B Két qua

Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, chúng tôi thu được sắc ky đồ cho thay PA

và CA được phân tách hoàn toàn như hình 3 l

Hình 3.1 Sắc ký đồ thu được của đung dịch hỗn hợp PA và CA

B.I Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Chúng tôi tiến hành khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ các chất cần định lượng

với diện tích pic tương ứng trên các chất chuẩn PA và CA Chuẩn bị một dãy dung

dịch hỗn hợp chuẩn trong dung môi A có nồng độ của PA biến thiên trong khoảng 150

— 750 ng/ml và của CA biến thién trong khoang 10 — 50 pg/ml, kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tinh

Phương trình hồi quy | Y = 15,2x + 154,9 Y = 46,4x + 29,3

Hệ sô tương quan r=0,9995 r= 0,9996

-32-

B.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại

Độ lặp lại được khảo sát trên hai mẫu viên nén SEDAPA do XNDPTW II sản

Kết quả khảo sát độ lặp lại ở trên cho thấy sai số tương đối từ 0,54 đến 1,07%,

với sai số này cho phép áp dụng được phương pháp trên

B.3 Kết quả khảo sát độ đúng

Khảo sát độ đúng trên hai mẫu SEDAPA ở trên bằng phương pháp thêm chuẩn,

kết quá được trình bày ở bảng 3.4 và 3.5

Bang 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu SEDAPA, Ä⁄ấu ¡ SKS : 350900

STT | Lượng thêm Lượng tìm % tìm lại Lượng thêm Lượng tìm % tìm lại

vào (mg) | thấy (mg) vào (mg) — | thấy (mg)

STT Lượng _ | Lượng tìm _ | Lượng thêm | Lượng tìm `

thay (mg) vao (mg) thay (mg)

4.4 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (PA) và ibuprofen (IB) trong

thuốc đa thành phần bằng phương pháp HPLC

Một trong những dạng thông dụng trên thị trường hiện nay là hỗn hợp paracetamol và ibuprofen (ví dụ: viên nén Alaxan của xí nghiệp United Pharma Việt nam [11], vién nén Pi-Antalvic [5] của công ty Dược vật tư y tế Trà Vinh, viên nén

MK protamol của công ty cổ phần Dược phẩm Mê Kông ) Dược điển Việt Nam cũng

như các dược điển khác hiện nay đều chưa có chuyên luận cho đạng bảo chế này Mục

tiêu của chúng tôi là nghiên cứu một số phương pháp định lượng paracetamol và ibuprofen có trong thành phần một dạng thuốc với mục đích làm phong phú thêm và đánh giá các phương pháp cho các cơ sở lựa chọn áp dụng Đồng thời mong được góp

phần xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng của ngành cũng như của Quốc gia cho các dạng thuốc có thành phần tương tự

A Thực nghiệm

A.I Thiết bị, hoá chất

- May sac ký lông hiệu năng cao MERCK-HITACHI 655A-12 với đetector UV- Vis 655A-22

- _ Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10um)

-_ Bộ lọc dung môi và lọc mẫu với đường kính lỗ màng lọc 0,45 um

- Chat chudn paracetamol va ibuprofen do vién kiểm nghiệm cung cấp

- Diethyl ether, ethanol 96°, natri sulfat khan, dung dich NaOH 0,1N va 0,01N

A.2 Phương pháp nghiên cứu

a Diéu kiện sắc kỷ

- Cét Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10pm)

- Detector UV dat & budc séng 224 nm

- - Pha dộng: Acetonitril - acid phosphoric 0,1% (60:40)

- _ Tốc độ dòng 1 ml/phút

- _ Thể tích tiêm 20ul

b Chuẩn bị dung dich

- Dung dich chuẩn : Chuẩn bị một dung dịch hỗn hợp chuẩn trong pha động có

néng d6 cha PA khoang 65 pg/ml va cha IB khoang 40 pg/ml

- Dung dich thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột

mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng của khoảng 32,5 mg PA, hoà tan và thêm pha động đến vừa đủ 50 ml, lọc (bỏ

khoảng 20 mi dịch lọc đầu) Hút chính xác 2,0 mi dịch lọc trên cho vào bình

định mức 20,0 ml, thêm pha động đến vừa đủ, lắc đều Lọc qua màng lọc

0,45um

-35-B Két qua

Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, chúng tôi thu được sắc ký đồ cho thay PA

và IB được phân tách hoàn toàn

được trình bày ở bảng sau:

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Phương trình hôi quy | Y = 67,Íx + 199,4 Y = 37,4x + 343,0

Hệ sô tương quan R=0,9999 R=0,9997

= 67,092x + 199

R? = 0,9998

0 50

Hình 4,2, Dé thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến

tính nồng độ và diện tích pic tương ứng của PA